Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-21T04:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344106.pdf: 1369213 bytes, checksum: f8ff23b4d4b81a73090a205f36bd0484 (MD5) Previous issue date: 2016 / As celulases são enzimas capazes de hidrolisar a ligação ß-1,4-glicosídica da cadeia da celulose, que é o principal componente da parede celular da biomassa vegetal. Um dos principais obstáculos para a utilização das celulases em larga escala é o seu custo de produção que ainda é elevado, e uma alternativa é o cultivo microbiano em resíduos agroindustriais por fermentação em estado sólido (FES). Com importância ambiental, o resíduo de acerola, rico em materiais lignocelulósicos, apresenta um potencial para a obtenção desse tipo de enzima. Diante deste contexto, este trabalho teve como objetivo estudar a produção de celulases por meio do processo de fermentação em estado sólido do resíduo agroindustrial da acerola, utilizando o microrganismo Trichoderma reesei. O resíduo foi caracterizado físico-quimicamente, quanto à granulometria, densidade aparente, densidade real, porosidade do leito, pH, sólidos solúveis, açúcares redutores e redutores totais, pectina, umidade, cinzas, lignina, hemicelulose, alfa-celulose, holocelulose e extrativos. Foram construídas as isotermas de adsorção de umidade do resíduo de acerola para as temperaturas de 25, 30, 35 e 40 °C. Em seguida, realizou-se um estudo da produção de celulases por FES, avaliando ao longo do tempo, o pH, a umidade, a concentração de açúcares redutores e a atividade enzimática, expressa em carboximetilcelulase. Avaliou-se também a influência da umidade inicial e concentração da fonte de nitrogênio, sob a atividade enzimática (carboximetilcelulase). Numa etapa seguinte realizou-se um estudo da extração das enzimas avaliando a influência da agitação, do tempo e da proporção massa de fermentado e volume de solvente, sob a atividade enzimática (carboximetilcelulase). Por fim, verificou-se a estabilidade das enzimas produzidas frente a variações da temperatura e do pH. A caracterização físico-química do resíduo de acerola demonstrou a viabilidade de sua utilização no processo de FES para produção de celulases. Os resultados obtidos no estudo da produção de celulases apontaram que o ensaio realizado com 45 % de umidade e concentração de nitrogênio de 1,00 %, foi o que apresentou melhor condição, pois, a partir de 120 horas do processo este ensaio obteve os maiores valores para atividade enzimática, chegando a valores acima de 1,25 U.g-1 em 216 horas de fermentação. Já no estudo de extração das celulases, destacou-se o ensaio 8 da matriz do delineamento fatorial, no qual utilizou-se uma agitação de 150 rpm, 45 minutos de extração e proporção de massa de fermentado e volume de solvente de 01:45 (g.mL-1), condição na qual foi obtida a maior atividade enzimática, com122,15 U.g-1. Por fim, verificou-se que as celulases produzidas com resíduo de acerola apresentaram boa estabilidade térmica até a temperatura de 50 oC, apresentando, no mínimo, 85,42 % da atividade máxima determinada nas condições padrão. Já com relação a variações no pH, as enzimas produzidas nesse estudo são instáveis em pH 2,5 exibindo 51,40 % de sua atividade máxima, mas apresentam boa estabilidade para pH entre 3,5 e 5,5. Os resultados deste estudo forneceram informações importantes para a futura aplicação do resíduo agroindustrial de acerola como substrato para processos de fermentação em estado sólido, objetivando a produção de celulases.<br> / Abstract : Cellulases are enzymes capable of hydrolyzing the bond ß-1,4-glycosidic of cellulose chain, which is the main component of the cell wall of biomass. One of the main obstacles to the use of cellulases in large scale is its cost of production that is still high, and an alternative is the microbial cultivation of agro-industrial waste by solid state fermentation (SSF). With environmental importance, the residue of acerola, rich in lignocellulosic materials, presents a potential for obtaining such enzyme. Given this context, this study aimed to study the production of cellulase by the method of solid-state fermentation of agroindustrial waste of acerola, using Trichoderma reesei microorganism. The residue was characterized chemically-physical, as the particle size, bulk density, real density, the bed porosity, pH, soluble solids, reducing sugars and total reducing, pectin, moisture, ash, lignin, hemicellulose, alpha-cellulose, holocelulose and extractives . It was constructed the acerola residue moisture adsorption isotherms for temperatures of 25, 30, 35 and 40 ° C. Then, it was made a study of production of cellulases by SSF, evaluating over time, pH, moisture, reducing sugar concentration and enzymatic activity, expressed as carboxymethylcellulase. Also, it was evaluated the influence of the initial moisture content and concentration of nitrogen source in the enzyme activity (carboxymethylcellulase). In a next step it was carried out a study of the extraction of enzymes evaluating the influence of agitation, time and proportion mass fermented and volume of solvent in the enzyme activity (carboxymethylcellulase). Finally, it was found the stability of the enzymes produced against changes in temperature and pH. The physicochemical characterization of acerola residue demonstrated the feasibility of its use in the SSF process for the production of cellulases. The results obtained in the study of cellulase production pointed out that the test carried out with 45% moisture and 1.00% nitrogen concentration, showed the best condition because, from 120 hours to process this test got the greatest values for enzyme activity, reaching above 1,25U.g-1 values at 216 hours of fermentation. In the study of extraction of cellulases, stood out the test 8 of the factorial design matrix, which used a stirring of 150 rpm, 45 minutes of extraction and mass ratio of fermented volume and solvent 1:45 (g.mL-1), a condition in which was obtained the highest enzymatic activity, with 2.15 U.g-1. Finally, it was found that cellulases produced from acerola residue showed good thermal stability up to the temperature 50° C, with at least, 85.42% of the determined maximum activity at standard14conditions. In relation to variations in pH, the enzymes produced in this study are unstable at pH 2.5 showing 51.40% of its maximal activity, but exhibit good stability to pH between 3.5 and 5.5. The results of this study provided important information for the future application of agro-industrial acerola waste as a substrate for fermentation processes in solid state, aiming the cellulases production.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:01:35Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Márcia Josefa da Silva.pdf: 1750850 bytes, checksum: d36504435c0ecdaffe970fd5045e35c0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:01:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Márcia Josefa da Silva.pdf: 1750850 bytes, checksum: d36504435c0ecdaffe970fd5045e35c0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / CAPES / A biomassa lignocelulósica destaca-se como matéria-prima alternativa para a produção de combustíveis e outros produtos. Devido à alta complexidade desse material, é necessária uma hidrólise enzimática eficiente com a utilização de um pool enzimático adequado. O objetivo deste trabalho foi estudar o perfil de produção de enzimas celulolíticas e xilanolítica por Trichoderma reesei RUT C-30 em meios com diferentes capacidades de indução. A produção de enzimas foi realizada em biorreator de bancada (Bioflo 110) com 1,3 ou 3 L de volume de trabalho, nas seguintes condições: 500 rpm, 28° C, 2 vvm e pH 5,0. As fontes de carbono investigadas foram: lactose, xilana, pectina, celulose microcristalina, melaço, biomassa de palma forrageira e hidrolisado hemicelulósico. O hidrolisado foi obtido por tratamento hidrotérmico de bagaço de cana-de-açúcar em reator descontínuo de 20 L (Regmed AU/20), com volume de trabalho de 10 L e carga de sólidos de 5% (m/v), a 185°C, por 16 minutos. Em substratos solúveis, a determinação da concentração celular foi realizada por peso seco e as concentrações dos substratos foram obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência. Ao final dos cultivos, foram isoladas proteínas extracelulares, que servirão para futura análise do secretoma de T. reesei RUT C-30. Em meio de lactose, os valores de atividades enzimáticas obtidos com 54 horas de cultivo foram: FPase (1,43 UI mL-1), CMCase (15,67 UI mL-1), xilanase (11,91 UI mL-1) e β-glicosidase (0,24 UI mL-1). A velocidade máxima específica de crescimento, μmax, e o coeficiente de rendimento de biomassa no substrato, Yx/s, foram 0,06 h-1 e 0,38 g g-1, respectivamente. Em meio de melaço, μmax e Yx/s foram 0,26 h-1 e 0,52 g g-1, respectivamente, e as atividades enzimáticas insignificantes. No hidrolisado, o crescimento do micro-organismo foi inibido devido à presença de compostos inibidores produzidos no tratamento hidrotérmico. Os valores de atividades enzimáticas com 54 horas foram: FPase (0,06 UI mL-1), CMCase (0,24 UI mL-1), xilanase (1,40 UI mL-1) e β-glicosidase nula. Em meio com celulose, também foram obtidos baixos valores de atividades enzimáticas, porém, a xilanase apresentou valor de 1,52 UI mL-1 com 50 horas de cultivo. A xilanase foi a enzima mais evidente nos cultivos com xilana, atingindo valor máximo de 11,93 UI mL-1, ao final do cultivo. Em meio com pectina: FPase, CMCase, xilanase e β-glicosidase foram: 0,01 UI mL-1, 1,25 UI mL-1, 2,83 UI mL-1 e 0,10 UI mL-1, respectivamente. Nos cultivos em meio à base de palma, observaram-se os seguintes valores com 50 horas: FPase (0,29 UI mL-1), CMCase (3,30 UI mL-1), xilanase (6,21 UI mL-1) e β-glicosidase (0,09 UI mL-1). Entre as fontes investigadas, a lactose é o melhor substrato para a indução de todas as enzimas estudadas, enquanto o melaço favorece o crescimento rápido do micro-organismo. O hidrolisado hemicelulósico e a palma forrageira são potenciais meios para a produção de enzimas, em particular xilanases. Para a utilização do hidrolisado, no entanto, será necessária a sua detoxificação ou, alternativamente, a obtenção de linhagens resistentes aos inibidores por engenharia metabólica e/ou engenharia evolutiva.

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2973_1.pdf: 2030201 bytes, checksum: ea24ce193b25432b29bb1ab7c62811a8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / No intuito de minimizar o impacto ambiental, torna-se necessário o aproveitamento de resíduos, como o engaço da bananeira, buscando obter produtos com maior valor agregado. Este trabalho teve por objetivo verificar a viabilidade do engaço como substrato, para crescimento de fungos em processo fermentativo sólido e submerso, para a produção de enzimas celulolíticas. As determinações físico-químicas no engaço com lignina e sem lignina foram: pH, sólidos solúveis totais, acidez total titulável, umidade, cinzas, proteínas e lipídeos. No material seco foram realizadas as análises de celulose, lignina, fibra em detergente ácido. Utilizou-se a técnica de difusão em meio sólido para a seleção dos fungos. A atividade do complexo celulolítico foi determinada pela técnica do papel de filtro (FPA). Os extratos fermentados com Trichoderma viride foram filtrados, centrifugados e os sobrenadantes avaliados quanto à atividade do complexo celulolítico. O extrato foi fracionado com (NH4)2SO4, as proteínas precipitadas foram cromatografadas em CM-celulose e as frações submetidas a atividade celulolítica. A atividade da celobiase foi avaliada a pH 4,0, 4,8 e 6,0 e em temperaturas de 40, 50 e 60°C. Os resultados da pesquisa mostraram que o engaço apresentou baixo teor protéico (0,6%) e pH alcalino (7,8), entretanto a umidade de 88%, no material fresco, é favorável para o crescimento de fungos. O percentual de celulose encontrado no engaço foi de 36,5%. Na seleção, Trichoderma viride 2820 e Aspergillus niger 1015 apresentaram maior produção de halo (21mm) e por isso, foram utilizados nas fermentações em estado sólido e submerso. Maior produção da FPase ocorreu na fermentação submersa utilizando T. viride com 4,7 UI/mL. Durante o processo de purificação e caracterização do complexo, observou-se que o extrato bruto fermentado com T. viride produziu CMCase (2,1 UI/mL), FPase (5,7 UI/mL) e celobiase (629 UI/mL). Duas celobiases, C1TV e C2TV, identificadas em CM-celulose, apresentaram diferente perfil eletroforético. C1TV (508 UI/mL) foi mais ativa em pH 4,0 a 60 ºC e C2TV (193,1 UI/mL) em pH 4,8 a 50 ºC. Neste estudo, concluímos que o engaço tratado com explosão de vapor é viável para a produção de celulases, entretanto é necessária a suplementação do substrato com fonte de nitrogênio e correção do pH. A maior produtividade das celulases foi alcançada quando utilizando T. viride em estado submerso por 96 horas. Sob as condições estudadas o engaço de bananeira produziu uma FPase, uma CMCase e duas isoformas de Celobiase

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-02-06T18:33:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-02-06T18:33:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-06T18:33:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) Previous issue date: 2015-10-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cellulases are hydrolases, with great interest in industrial, notable for its power in the production of ethanol by hydrolysis of cellulolytic materials. The actinobacteria are producing this enzyme, especially of the genus Streptomyces. This study aimed to produce and characterize a portion of a cellulolytic complex excreted by actinobacteria belonging to the microorganisms Collection of UFPEDA. In the selection of microorganisms producers of cellulolytic complex in qualitative testing microorganisms 171x and 178 showed the most significant enzymatic Index. As for the complex production time, fermentation was studied by 7 days with aliquots being taken every 24h. There was thus obtained peak production at 48 the fermentation was also noted that the micro-organism 171x enzyme produced in greater quantities. The experiment followed with only the more significant production actinobacteria (171x), was tested for optimum substrate concentration (carboximeticelulose), growing temperature and an initial pH of production. The results demonstrate greater production of the cellulolytic complex with a substrate concentration of 3%, fermentation temperature 45 ° C and initial pH 4.0. About the partial characterization of the complex maybe that this behaved very satisfactorily, as proved to be very stable during the test. Furthermore, it has proven activity of the complex by zymography method and its probable molecular weight, the cellulolytic complex studied have Michaeliano behavior, the enzymatic hydrolysis product suggests that the enzyme complex is composed of endoglucanases and experiment suggests that the complex should be produced at 40ºC, pH 4 and 2.5 g / L of CMC. The micro-organism was identified at genus level by the microculture and kind method, molecular identification, being identified as Streptomyces capoamus. Data from this study showed the importance of isolated actinobacteria biotechnology of the savanna soil. This complex has potential for use in the treatment and environmental cleaning products industries because it has high stability in adverse conditions / Celulases são hidrolases, com grande interesse industrial, destacando-se pelo seu poder na produção de etanol, através de hidrólise de materiais celulolíticos. As actinobactérias são produtoras desta enzimas, em especial do gênero Streptomyces. Este trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar parcialmente um complexo celulolítico excretado por actinobactérias pertencentes ao acervo da Coleção de micro-organismos UFPEDA. Na seleção dos micro-organismos produtores do complexo celulolítico em ensaios qualitativos os micro-organismos 171x e 178 mostraram o Índice enzimático mais expressivo. Quanto ao tempo de produção do complexo, a fermentação foi estudada por 7 dias, com alíquotas sendo retiradas a cada 24h. Obteve-se assim o pico de produção com 48h de fermentação. Notou-se também que o micro-organismo 171x produziu a enzima em maior quantidade (0,139 U/mL). Os experimentos seguiram com apenas a actinobacteria com produção mais expressiva (171x), sendo testado a concentração ideal de substrato (carboximeticelulose), temperatura de cultivo e pH inicial de produção. Os resultados demonstraram uma maior produção do complexo celulolítico com substrato em concentração de 3%, temperatura de fermentação 45ºC e pH inicial 4,0. Quanto a caractericação parcial do complexo pode-se observar que este se comportou de forma muito satisfatória, pois demonstrou-se bastante estável durante os testes. Além disso, foi comprovada a atividade do complexo pelo método do zimograma e determinou-se sua provável massa molecular (80kDa), e que o complexo celulolítico estudado tem comportamento Michaeliano. O produto de hidrólise enzimática sugere que o complexo enzimático seja composto por endoglucanases. O delineamento experimental confirma que os dados obtido quando analisados os fatores isolados estão próximos ao ótimo. O micro-organismo foi identificado em nível de gênero através do método de microcultivo e de espécie, identificação molecular, sendo identificado como Streptomyces capoamus. Os dados obtidos neste estudo mostram a importância biotecnológica das actinobacterias isoladas de solo da caatinga. Este complexo celulolítico tem potencial para utilização em indústrias por possuir alta estabilidade em condições adversas

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

O cultivo da cana-de-açúcar é uma das atividades agrícolas mais importantes no Brasil, produzindo após a moagem o caldo, utilizado para a produção de açúcar e etanol, e o bagaço, resíduo lignocelulósico. O bagaço é recalcitrante à hidrólise enzimática, em parte pela baixa porosidade, resultante do recobrimento das fibrilas de celulose com lignina e hemicelulose. Neste estudo, o bagaço foi pré-tratado com sulfito alcalino nas concentrações de 2,5% de NaOH e 5% de Na2SO3 versus 5% de NaOH e 10% de Na2SO3 para produzir substratos para hidrólise enzimática. Ambos pré-tratamentos produziram substratos com teor de hemicelulose, grupos ácidos, grau de retenção de água e área superficial semelhantes. O conteúdo de lignina foi bem diferente nos bagaços pré-tratados com 5% de sulfito (21% de lignina) e 10% de sulfito (13% de lignina). A hidrólise da celulose e hemicelulose do bagaço com alto teor de lignina, utilizando a carga enzimática de 40 FPU/g e 80 U/g de ?-glicosidase foram próximas a 50% em 48 horas e, mesmo no bagaço com pouca lignina a conversão dos polissacarídeos não foi completa (90%). Considerando a importância do tipo de enzimas para a conversão dos polissacarídeos dos bagaços pré-tratados, realizou-se um planejamento experimental 24 com 6 pontos centrais ampliado em estrela, para avaliar uma mistura de enzimas partindo de 5 FPU/g do extrato comercial de Trichoderma reesei (celluclast) combinado com enzimas purificadas comerciais: xilanase de Neocallimastix patriciarum (família 10), xilanase de Thermotoga maritima (família 11), ?-xilosidase de Selelomonas ruminantium e ?-glicosidase de Aspergillus niger. A aplicação da mistura de enzimas otimizada no bagaço pré-tratado com alta carga de sulfito aumentou a conversão de celulose e hemicelulose em 6,6% e 15% respectivamente, comparado com a mistura de referência (5FPU de celluclast e 10UI de Novozyme 188 por grama de bagaço). A suplementação da celluclast com ?-xilosidase e ?- glicosidase foi estatisticamente significativa em 24 horas de hidrólise a um nível de 95% de confiança e a interação da xilanase 10 e 11 foi significativa com um nível de confiança de 90%. Quando foram realizados os mesmos ensaios do planejamento com o substrato com alto teor de lignina, as hidrólises da celulose e hemicelulose com a mistura de enzimas foram inferiores à obtida com a referência. A suplementação com xilanases e ?-xilosidase aumentou a conversão enzimática da hemicelulose apenas do substrato com pouca lignina, entretanto nos hidrolisados de ambos os substratos foi detectada a presença de xilooligossacarídeos, indicando a necessidade de adição de mais ?-xilosidase à mistura enzimática. As velocidades iniciais de hidrólise da celulose e hemicelulose foram pouco alteradas quando a lignina do bagaço reduziu de 21% para 13%, porém a conversão em 48 h de reação foi o dobro. Este estudo mostrou que o acesso das enzimas à hemicelulose foi limitado pelo alto teor de lignina do substrato, e que o benefício do uso de xilanases para a conversão de celulose foi obtido no substrato pré-tratado com alta carga de sulfito. / The cultivation of sugarcane is one of the most important agricultural activities in Brazil. The juice obtained from the crushed stalks of sugarcane is used to produce sugar and ethanol and the dry, fibrous residue remaining is the bagasse. Bagasse is recalcitrant to enzymatic hydrolysis, in part by low porosity due to the partial filling of space between the cellulose microfibrils by lignin and hemicelluloses. In this study, bagasses were pretreated with alkaline sulfite at concentrations of 2.5% NaOH and 5% Na2SO3 NaOH versus 5% and 10% Na2SO3 to produce substrates for enzymatic hydrolysis. Both substrates presented similar hemicellulose content, acid groups, water retention and specific surface area. Lignin content differed between pretreated bagasse with 5% sulfite (21%) and 10% sulfite (13%). The hydrolysis of cellulose and hemicellulose of bagasse with high lignin content, using 40 FPU/g and 80 U/g of ?-glucosidase was aproximately 50% in 48 hours and even on bagasse with low lignin content, the polysaccharides conversion was not complete (90%). Considering the importance of the type of enzymes for the conversion of polysaccharides of pretreated bagasses, a 24 full factorial experimental design with six central points was performed to evaluate a mixture of enzymes. A load of 5 FPU/g of Trichoderma reesei extract (celluclast) was combined with purified commercial enzymes: Neocallimastix patriciarum xylanase (family 10), Thermotoga maritima xylanase (family 11), Selelomonas ruminantium ?-xylosidase and ?-glucosidase from Aspergillus niger. The optimized mixture improved the conversion of cellulose and hemicellulose of the substrate with low lignin content in 6.6% and 15% respectively, when compared to the reference mixture (5FPU of celluclast and 10 IU of novozyme 188 per gram of bagasse). Supplementation with ?-xylosidase and ?-glucosidase was statistically significant at 24 hours of reaction and also the interaction of xylanases 10 and 11. When the same assays were performed with the substrate with low lignin, hydrolysis of the cellulose and hemicellulose with a mixture of purified enzymes was inferior to that obtained by the reference. Supplementation with xylanase and ?-xylosidase improved the enzymatic conversion only for substrate with low lignin content, however in supernatants of both substrates was detected the presence of xylo-oligosaccharides, suggesting the need for further addition of ?-xylosidase to the enzyme mixture. Initial rate of cellulose and hemicellulose hydrolysis changed very little when the lignin in the bagasse was reduced from 21% to 13%, but the conversion at 48 h conversion time was twice higher. This study showed that access of enzymes to the hemicellulose was limited by the high lignin content of the substrate, and that the benefit of using xylanases for the conversion of cellulose was obtained on the substrate pretreated with high sulfite load.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laryssa da Silva Melo.pdf: 834446 bytes, checksum: 1dbffe1130e351818bfc66f05b6077ae (MD5) Previous issue date: 2009-10-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Trichoderma are anamorphic fungi belonging to the class of Hifomicetos, also called imperfect fungi, or asexual conidial and whose gender Hypocrea teleomorph. They are free-living fungi, distributed throughout the world and found in different soil temperatures, especially those containing organic matter. Usually are not considered important human pathogens, but there are some reports indicating occasional pathogenicity of some species. Its easy handling and in vitro, stability and viability of colonies preserved this kind are a big target for biotechnology research. Because of these characteristics were isolated Trichoderma from plant Victoria amazonica, Rollinia sp. Murraya paniculata and Strychnos cogens; wood Scleronema micranthum, known as cardeiro; jatoba (Hymenaea courbaril), land of cubiu culture (Solanum sessiliflorum) and Indian black earth, in order to identify the molecular biology, the species level, such isolates and to assess their ability to produce cellulolytic enzymes. Of the 30 lines obtained were cultured spore, which were preserved in mineral oil, Castellani and method in 10% glycerol. From the suspension in glycerol, each sample was inoculated in 20ml of 10μL BD and cultivated 26oC, 100 rpm for 40:00 h. Next was extracted genomic DNA, performed PCR of specific regions of the ITS-1 and ITS-2 ribosomal DNA sequencing and subsequently. For the production of enzymes, the isolates were first grown in induction medium. Were inoculated 10μL of spore solution (glycerol 10%) in 50 mL of solution Manachini where the substratum was used to carboxymethylcellulose. The fungi were incubated at 27 ° C, 120 rpm for 120 hours. The dosage of CMCase was performed using the method of acid Dinitrosalicílico. For the determination of β-glucosidase was used p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPG) as substrate for the enzyme. The total protein concentration was determined by the Bradford method, using the reagent concentrate commercial Bio-RadTM and bovine serum albumin (ASB) as standard. The result of molecular identification of the first 13 samples revealed the species: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum and T. koningiopsis, with a percentage between 96 and 99% identity and 100% reliability. The results indicated CMCase enzyme to low values, less than 0.100 U / mL with the exception of T. koningii (MPCE 10 3.2), T. harzianum (MPCE 2 2.2a), both isolates of M. paniculata, and isolate 1437 identified as Trichoderma sp., from Indian black earth, which showed slightly higher levels of 0.112 and 0.103 and 0.105 U / mL, respectively. For β-glucosidase, the results showed high activity in the vast majority of isolates with emphasis on T. harzianum MPCE 3 3.1 (10.45 U / mL) and T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9.71 U / mL). All isolates produced protein in culture medium containing carboxymethylcellulose as substrate inducer / Trichoderma são fungos anamórficos pertencentes à classe dos hifomicetos, também chamados fungos imperfeitos, assexuais ou conidiais e que têm como teleomorfo o gênero Hypocrea. São fungos de vida livre, distribuídos em todo o mundo e encontrados em solos de diversas temperaturas, especialmente naqueles que contém matéria orgânica. Geralmente não são considerados importantes patógenos humanos, mas existem alguns relatos indicando patogenicidade ocasional em algumas espécies. Sua fácil manipulação e cultivo in vitro, estabilidade e viabilidade das colônias preservadas, fazem desse gênero um grande alvo para as pesquisas biotecnológicas. Por tais características, foram isolados Trichoderma das plantas Victoria amazonica, Rollinia sp., Murraya paniculata e Strychnos cogens; da madeira Scleronema micranthum, conhecida como cardeiro; de jatobá (Hymenaea courbaril), do solo de cultura de cubiu (Solanum sessiliflorum) e de terra preta de índio, com o objetivo de identificar, pela biologia molecular, em nível de espécie, tais isolados, bem como avaliar sua capacidade de produção de enzimas celulolíticas. Das 30 linhagens obtidas foram realizadas culturas monospóricas, as quais foram preservadas em óleo mineral, método Castellani e em glicerol 10%. A partir da suspensão em glicerol, de cada amostra foi inoculado 10μL em 20mL de BD e cultivado a 26oC, a 100 rpm por 40:00h. Em seguida foi extraído o DNA genômico, deste realizada a PCR específica para as regiões ITS-1 e ITS-2 do DNA ribossômico e posteriormente o sequenciamento. Para a produção de enzimas, os isolados foram previamente cultivados em meio indutor. Foram inoculados 10μL da solução de esporos (Glicerol 10%) em 50mL de solução de Manachini onde o substrato indutor utilizado foi a carboximetilcelulose. Os fungos foram incubados a 27°C, 120 rpm durante 120 horas. A dosagem de CMCase foi efetuada com base no método do Ácido Dinitrosalicílico. Para a dosagem de β-glucosidase foi utilizado o pnitrofenil- β-D-Glucopiranosídeo (pNPG) como substrato para a enzima. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se o reagente concentrado comercial da Bio-RadTM e albumina de soro bovino (ASB), como padrão. O resultado da identificação molecular das primeiras 13 amostras nos revelaram as espécies: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum e T. koningiopsis, com um percentual entre 96 e 99% de identidade e 100% de confiabilidade. Os resultados enzimáticos para CMCase indicaram valores baixos, inferiores a 0,100 U/mL com exceção de T. koningii (MPCe 10 3.2), T. harzianum (MPCe 2 2.2a), ambos isolados de M. paniculata, e o isolado 1437 identificado como Trichoderma sp., proveniente de terra preta de índio, que apresentaram valores um pouco mais altos de 0,112 e 0,103 e 0,105 U/mL, respectivamente. Para β-glucosidase, os resultados apresentados mostraram alta atividade na grande maioria dos isolados com destaque para T. harzianum MPCe 3 3.1(10,45U/mL) e T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9,71 U/mL). Todos os isolados produziram proteínas em meio de cultura contendo carboximetilcelulose como substrato indutor

O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis e questões ambientais têm gerado grandes preocupações para a sociedade, e alternativas sustentáveis e eficientes para solucionar e trazer inovações na produção de biocombustíveis estão cada vez mais próximas. O uso de biomassa pode ser uma vantajosa opção, mas para isso, é necessária a degradação das moléculas constituintes de sua parede celular a açúcares fermentáveis. A biotecnologia tem melhorado e aumentado as opções para suprir fontes sustentáveis e preservação do meio ambiente. A transformação de biomassa na escala industrial para produção de bioetanol depende da capacidade de otimizar o processo de hidrólise enzimática da celulose utilizando enzimas de complexo celulolítico, principalmente de fontes bacterianas e fungos filamentosos. Dessa forma, estudamos a principal endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913, que foi inicialmente identificada através de zimogramas e espectrometria de massas que mostrou boa cobertura de sequência e purificada utilizando passos de precipitação com sulfato de amônio seguida do uso de uma coluna de exclusão molecular. Esta enzima teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa para diversos substratos testados e também grande estabilidade para variações de pH e temperatura, com condições ótimas de pHótimo = 7.0 e Tótima = 45°C. Além da caracterização enzimática, a posição relativa entre o domínio catalítico e de ligação da celulose (CBM) da Endoglucanase por SAXS também foram determinadas, e ainda, para finalizar os estudos estruturais, a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da enzima foi determinada com resolução de 2.8&Aring;, contendo quatro moléculas por unidade assimétrica. / The exhaustion of fossil fuels and the environment issues related have been generated many concerns for the society and searching for sustainable and effective alternative are being done in order to solve and bring innovations for biofuel production. Biomass can be a good alternative, but, for the success, it will be necessary degrading the cellular wall molecules into fermentable sugar. Biotechnology has improved and increased options in order to supply sustainable sources and environment preservation. The biomass transformation for bioethanol production, at the industrial scale, depends on the capacity of optimize the enzymatic hydrolysis of cellulose using enzymes of the cellulolytic complex, mainly produced by bacteria and filamentous fungi. We have studied the main endoglucanase of Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913 which has been initially identified by zymograms and mass spectrometry with high coverage sequence, and purified using precipitation with ammonium sulfate followed by size exclusion column. This enzyme had its kinetic parameters determined showing activity for the substrates tested and also has showed stability for pH and temperature changes, with optimal conditions of pHopt = 7.0 and Topt = 45°C. Following this enzymatic characterization, the relative position of the catalytic domain and cellulose binding domain (CBM) was determined by SAXS. In order to complete the structural studies, the crystallographic structure of the catalytic domain has been determined with 2.8&Aring; of resolution, showing four molecules by asymmetric unity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:08:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316860.pdf: 2287704 bytes, checksum: c42cb96f34552b97c592ab2368745c1f (MD5) / Nos últimos anos tem surgido um grande interesse mundial no desenvolvimento de tecnologias que consigam aproveitar resíduos lignocelulósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis. O bagaço da cana-de-açúcar é o principal resíduo agroindustrial do Brasil. Por mais que o bagaço seja empregado para geração de energia, grandes excedentes continuam sem aplicação. No entanto, o bagaço apresenta uma natureza recalcitrante, devido ao arranjo estrutural formado pelos seus componentes celulose, hemicelulose e lignina. Com isso, se torna necessário uma etapa de pré-tratamento para desprender a lignina e hemicelulose fazendo com que a celulose seja liberada e esteja acessível para as enzimas celulases. Partindo desta premissa, este trabalho estudou o pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar para uma sacarificação enzimática eficiente. Para tanto, foram avaliados dois métodos de pré-tratamento: um utilizando o peróxido de hidrogênio alcalino como um processo padrão e outro utilizando o peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas (objeto de estudo do presente trabalho). Para ambos pré-tratamentos, foram determinados as melhores condições de execução através de planejamentos experimentais, avaliando as variáveis: temperatura, concentração de H2O2, agitação, concentração de cinzas e por fim o tempo reacional, obtendo como superfície de resposta o rendimento de açúcares redutores liberados durante a hidrólise enzimática. Posteriormente, foram realizadas análises de composição e identificação de estruturas químicas e caracterização morfológica no bagaço antes e após os pré-tratamentos. A melhor condição para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino foi de 9,39% (v/v) H2O2, 46°C de temperatura e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de 40 minutos. Já para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas, a condição de 6,32% (v/v) H2O2, 3,40% (p/v) cinzas, 60°C de temperatura e agitação de 1,67 Hz por um período reacional de 2 horas foi a condição adequada. O rendimento de açúcares redutores após 48 horas de hidrólise enzimática para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino foi de 217,6 mg g-1 bagaço e de 179,9 mg g-1 bagaço para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas, enquanto que para o bagaço não tratado foi de apenas 74,3 mg g-1 bagaço, enquanto que o rendimento de glucose foi o mesmo para os dois pré-tratamentos, mostrando que possuem a mesma eficiência. Ambos pré-tratamentos não apresentaram modificações significativas na estrutura química do bagaço antes e após pré-tratamento. Além disso, foi possível observar uma pequena desorganização física nas fibras do bagaço. Ambos pré-tratamentos possuem a mesma eficiência no rendimento de glucose, no entanto, o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino apresenta formação de resíduos cáusticos envolvendo uma etapa de lavagem dispendiosa e com geração de efluente, além de promover parcial degradação da hemicelulose. Desta forma o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio suplementado com cinzas apresenta-se mais viável para uma aplicação amigável ao meio ambiente.<br> / Abstract : In the last years there is a worldwide emerging interest in the development of technologies that are able to take advantage of lignocellulosic residues to obtain fermentable sugars. The sugarcane bagasse is the principal agroindustrial residue from Brazil. Although the bagasse is used for power generation, large surplus remains still without application. Its recalcitrant nature, due to the arrangement formed by the structural components cellulose, hemicellulose and lignin, makes necessary a pretreatment step to release cellulose from lignin and hemicellulose permitting, then, cellulase enzymes to access the molecules. This work studied the efficiency of two pretreatments of the sugarcane bagasse in promoting the enzymatic saccharification: one using alkaline hydrogen peroxide as a standard process and another using hydrogen peroxide supplemented with ash. For both pretreatments, the best operational conditions were evaluated using experimental design. The variables studied were temperature, H2O2 concentration, agitation, ash concentration and reaction time; the response variable was reducing sugars released during enzymatic hydrolysis. Modifications promoted on the bagasse by the pretreatments were evaluated by analysis of chemical composition, identification of chemical structures and morphological characterization, before and after pretreatments. The best condition found for the hydrogen peroxide alkaline pretreatment was 9.39% (v/v) H2O2, 46°C temperature and stirring of 1.67 Hz for a reaction time of 40 minutes, and for hydrogen peroxide supplemented with ash pretreatment, the best condition was 6.32% (v/v) H2O2, 3.40% (w/v) ash, 60°C and 1.67 Hz stirring for a reaction time of 2 hours. The yield, expressed in reducing sugars, after 48 hours of enzymatic hydrolysis for the alkaline hydrogen peroxide pretreatment was 217.6 mg g-1 bagasse, and 179.9 mg g-1 bagasse for hydrogen peroxide ash pretreatment; the untreated bagasse gave 74.3 mg g-1 bagasse yield, whereas the yield of glucose was the same for both pre-treatment, showing that have the same efficiency. Both pretreatments showed no significant changes in the chemical structure of the pulp before and after pretreatment. Moreover, we observed a small physical clutter in the fibers of bagasse. Both pretreatments have the same efficiency in the yield of glucose, however, pretreatment with alkaline hydrogen peroxide shows formation of caustic residues involving an expensive step wash and worth generation of effluent, besides promote partial degradation of hemicellulose, therefore the pretreatment with hydrogen peroxide supplemented with ash appears more feasible for implementation.

O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis e questões ambientais têm gerado grandes preocupações para a sociedade, e alternativas sustentáveis e eficientes para solucionar e trazer inovações na produção de biocombustíveis estão cada vez mais próximas. O uso de biomassa pode ser uma vantajosa opção, mas para isso, é necessária a degradação das moléculas constituintes de sua parede celular a açúcares fermentáveis. A biotecnologia tem melhorado e aumentado as opções para suprir fontes sustentáveis e preservação do meio ambiente. A transformação de biomassa na escala industrial para produção de bioetanol depende da capacidade de otimizar o processo de hidrólise enzimática da celulose utilizando enzimas de complexo celulolítico, principalmente de fontes bacterianas e fungos filamentosos. Dessa forma, estudamos a principal endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913, que foi inicialmente identificada através de zimogramas e espectrometria de massas que mostrou boa cobertura de sequência e purificada utilizando passos de precipitação com sulfato de amônio seguida do uso de uma coluna de exclusão molecular. Esta enzima teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa para diversos substratos testados e também grande estabilidade para variações de pH e temperatura, com condições ótimas de pHótimo = 7.0 e Tótima = 45°C. Além da caracterização enzimática, a posição relativa entre o domínio catalítico e de ligação da celulose (CBM) da Endoglucanase por SAXS também foram determinadas, e ainda, para finalizar os estudos estruturais, a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da enzima foi determinada com resolução de 2.8&Aring;, contendo quatro moléculas por unidade assimétrica. / The exhaustion of fossil fuels and the environment issues related have been generated many concerns for the society and searching for sustainable and effective alternative are being done in order to solve and bring innovations for biofuel production. Biomass can be a good alternative, but, for the success, it will be necessary degrading the cellular wall molecules into fermentable sugar. Biotechnology has improved and increased options in order to supply sustainable sources and environment preservation. The biomass transformation for bioethanol production, at the industrial scale, depends on the capacity of optimize the enzymatic hydrolysis of cellulose using enzymes of the cellulolytic complex, mainly produced by bacteria and filamentous fungi. We have studied the main endoglucanase of Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913 which has been initially identified by zymograms and mass spectrometry with high coverage sequence, and purified using precipitation with ammonium sulfate followed by size exclusion column. This enzyme had its kinetic parameters determined showing activity for the substrates tested and also has showed stability for pH and temperature changes, with optimal conditions of pHopt = 7.0 and Topt = 45°C. Following this enzymatic characterization, the relative position of the catalytic domain and cellulose binding domain (CBM) was determined by SAXS. In order to complete the structural studies, the crystallographic structure of the catalytic domain has been determined with 2.8&Aring; of resolution, showing four molecules by asymmetric unity.