Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-26T13:50:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-26T13:50:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Thâmarah_Completo.pdf: 3630312 bytes, checksum: 254c44fa854f1e011380abdfbfb972af (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-04-16 / CNPq, FACEPE, CAPES e UFPE / Nasutitermes corniger é uma espécie de cupim-praga que causa danos em diversas construções. Enzimas digestivas possuem várias aplicações biotecnológicas e podem constituir alvos para o controle de insetos. O presente trabalho descreve a detecção das atividades de celulases (endoglucanase, exoglucanase e β-glicosidase), hemicelulases (β- xilosidase, α-L-arabinofuranosidase e β-xilanase), α-amilase, e proteases (tripsina-símile, quimotripsina-símile, calicreína-símile e do tipo queratinase) em extratos de intestino de operários e soldados de N. corniger. As atividades enzimáticas foram avaliadas após incubação dos extratos de intestino em diferentes temperaturas e valores de pH e com lectinas termiticidas de Myracrodruon urundeuva. A adaptabilidade desta espécie de cupins para digerir materiais lignocelulósicos foi evidenciada pelos altos valores de atividade de endoglucanase e β-xilanase. Zimografia para proteases do extrato de operários revelou que polipeptídeos de 22, 30 e 43 kDa hidrolisaram caseína. Efeito de inibidores na atividade enzimática mostrou que serino proteases foram as principais proteases presentes no intestino de operários e soldados. As atividades tripsina-símile e calicreína-símile foram detectadas em maiores níveis. Os resultados dos ensaios de estabilidade frente ao aquecimento e pH revelam a presença de aparatos digestivos distintos entre operários e soldados. As lectinas de M. urundeuva afetaram diferentemente as atividades enzimáticas e sua atividade termiticida pode estar relacionada com a modulação de enzimas digestivas. O presente trabalho é uma etapa inicial no estudo do aparato digestivo de N. corniger e estimula a purificação e avaliação do potencial biotecnológico dessas enzimas.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-05T14:42:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 637711 bytes, checksum: 75ea0ad3a3c67b516122fbe953c21199 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T14:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 637711 bytes, checksum: 75ea0ad3a3c67b516122fbe953c21199 (MD5) Previous issue date: 2014-11-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A hidrólise da lignocelulose, presente na biomassa vegetal, requer a participação de uma série de enzimas lignocelulolíticas, produzidas por diversos micro-organismos. Este processo é natural, gradual e resulta na liberação de açúcares fermentáveis e outros produtos industriais. No entanto, o processo de hidrólise da lignocelulose na indústria requer uma formulação enzimática robusta e com amplo espectro de atividade hidrolítica, capaz de disponibilizar a maior quantidade possível de açúcares para os bioprocessos. Dessa forma, o ideal seria produzir coquetéis enzimáticos a partir de comunidades microbianas, que se estabelecem em ambientes onde o a biomassa vegetal está sendo degradada. Assim, os objetivos deste estudo foram: determinar e caracterizar atividades enzimáticas presentes no coquetel enzimático obtido a partir de uma comunidade microbiana celulolítica; determinar a diversidade de micro-organismos presentes nesta comunidade e inferir sobre as relações filogenéticas e funcionais entre seus membros. Uma comunidade microbiana celulolítica, derivada de duas outras comunidades foi cultivada em meio solução Peptona-Celulose (PCS), suplementado com 1% (p/v) de bagaço de cana, a 50°C e sem aeração, durante sete dias. O extrato enzimático produzido por esta comunidade apresentou cinco atividades enzimáticas diferentes (CMCase, FPase, xilanase, β-glicosidase e protease). Xilanase e CMCase alcançaram sua atividade máxima no sexto dia de cultivo (9,98 U mg -1 e 2,0 U mg -1 , respectivamente), FPase no quarto dia (0,6 U mg -1 ), β-glicosidase no terceiro (0,36 U mg -1 ) e protease no primeiro dia (0,05 U mg -1 ). O efeito do pH, temperatura e termoestabilidade sobre as atividades enzimáticas foi analisado. Xilanase e CMCase apresentaram maior atividade em pH 8,0, FPase e β-glicosidase em pH 7,0 e protease em pH 5,0. A melhor atividade de xilanase e CMCase ocorreu a 70°C, FPase a 60°C, β- glicosidase a 50°C e protease a 40°C. Xilanase, CMCase e FPase foram termoestáveis em todas as temperaturas testadas (40, 50 e 60°C) ao longo de 2h de incubação. A β- glicosidase foi termoestável nos 80 min iniciais, em todas as temperaturas. Protease foi termosensível a 40°C, nos 40 min iniciais de incubação. As atividades enzimáticas viiipresentes no coquetel enzimático, produzido pela comunidade microbiana mista, apresentaram tolerância a ampla faixa de pH e elevadas temperaturas e estabilidade térmica, exibindo potencial para aplicação em processos biotecnológicos. O DNA total da comunidade foi extraído, os genes ribossomais 16S e 28S foram amplificados e sequenciados. A análise das sequências dos genes ribossomais revelou que estes possuem similaridade maior que 90% com sequências conhecidas depositadas no GenBank e indicaram que a comunidade microbiana celulolítica era composta por diversas espécies de bactérias e fungos, que foram agrupadas em duas árvores filogenéticas. O fungo Ganoderma lucidum e a bactéria Ureibacillus não cultivável apresentaram a maior frequência relativa na comunidade. As complexas interações metabólicas e ecológicas entre as multiespécies microbianas, presentes na comunidade microbiana mista certamente contribuiram para a eficiente hidrólise da lignocelulose nas condições estabelecidas neste estudo. / The hydrolysis of lignocellulose present in the vegetable biomass requires the participation of a series of lignocellulolytic enzymes, produced by various microorganisms. This process is natural, gradual and results in the release of fermentable sugars and other industrially products. However, the hydrolysis process of the lignocellulose in the industry requires robust enzyme formulation with broad spectrum of hydrolytic activity, able to provide the largest possible amount of sugars for bioprocesses. Thus, the ideal would be to produce enzyme cocktails from microbial communities that are established in environments where the vegetable biomass is being degraded. The objectives of this study were to determine and characterize enzymatic activities present in the enzyme cocktail obtained from a cellulolytic microbial community; determine the diversity of micro-organisms present in this community and infer the phylogenetic and functional relationships among its members. One cellulolytic microbial community, derived from two other communities was cultured in Peptone- Cellulose Solution medium (PCS), supplemented with 1% (w/v) sugarcane bagasse, at 50°C, static conditions aeration, for seven days. The enzyme extract produced by this community showed activity of five different enzymes (CMCase, FPase, xylanase, β- glucosidase and protease). Xylanase and CMCase achieved their maximum activity on the sixth day of cultivation (9,98 U mg -1 e 2,0 U mg -1 , respectively), FPase on the fourth day (0,6 U mg -1 ), β-glucosidase on the third day (0,36 U mg -1 ) and protease on the first day (0,05 U mg -1 ). The effect of pH, temperature and thermostability of the enzyme activities was analyzed. Xylanase and CMCase exhibit higher activity in pH 8.0, FPase and β-glucosidase in pH 7.0 and protease in pH 5.0. The best activity of the xylanase and CMCase was at 70°C, FPase at 60°C, β-glucosidase at 50°C and protease at 40°C. Xylanase, CMCase and FPase were thermostable at all temperatures tested (50, 60 and 70°C) over 2h incubation. β-glucosidase was thermostable in the initial 80 min at all temperatures. Protease was thermosensitive at 40°C, in the initial 40 min. The enzymes present in the enzyme cocktail, produced by the mixed microbial community, presented xtolerance to a wide pH range and high temperatures and thermal stability, showing potential for application in biotechnological processes. The total DNA of the community was extracted, the 16S and 28S ribosomal genes were amplified and sequenced. Sequence analysis of ribosomal genes revealed that these have a similarity higher than 90% with known sequences deposited in GenBank and indicated that cellulolytic microbial community was composed of several species of bacteria and fungi that were grouped into two phylogenetic trees. The Ganoderma lucidum fungus and bacteria Ureibacillus uncultivable had the highest relative frequency in the community. The complex metabolic and ecological interactions between microbial multi-species present in the mixed microbial community certainly contributed to the efficient depolymerization of lignocellulose under the conditions established in this study.

Submitted by Lucienne Costa (lucienneferreira@ufcg.edu.br) on 2017-12-13T17:26:54Z No. of bitstreams: 1 CARLOS ALBERTO BISPO DE SOUSA - TESE (PPGEP) 2014.pdf: 2633408 bytes, checksum: 80087f7d1097f18a52b312e44cfc57af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T17:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CARLOS ALBERTO BISPO DE SOUSA - TESE (PPGEP) 2014.pdf: 2633408 bytes, checksum: 80087f7d1097f18a52b312e44cfc57af (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / Capes / A demanda por fontes de energia renovável tem crescido em todo o mundo. Nesse contexto, o bioetanol obtido a partir da hidrólise de materiais lignocelulósicos tem merecido destaque. Porém, a produção das enzimas celulolíticas usadas nesse processo é de custo elevado, e este é o principal empecilho para a obtenção do etanol celulósico em grande escala. O objetivo deste estudo foi produzir enzimas celulolíticas destinadas a produção de bioetanol, a partir da fermentação semissólida da biomassa da palma forrageira pelo fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB 48. O estudo da fermentação revelou que a melhor condição foi atingida com umidade inicial de 90% e suplementação de 1% de fonte de nitrogênio. A atividade máxima foi alcançada em 110 horas de processo, com produção de 6,45 U/gds. O estudo de lixiviação das enzimas produzidas revelou como as melhores condições do processo: a relação solvente/substrato de 20g/ml, agitação de 50rpm e tempo de contato de 15 minutos, na qual obteve-se extratos brutos com 15,14 U/gds expressa em carboximetilcelulase (CMCase). As enzimas recuperadas na lixiviação exibiram atividade CMCase ótima em temperatura de 55°C e pH ótimo entre 4,0 e 5,0. Estudos de estabilidade mostraram que a enzima é desativada em valores de pH superiores a 6,5 e temperaturas superiores a 50°C. Ensaios de hidrólise utilisando a própria biomassa da palma e o resíduo da fermentação como material lignocelulósico apresentaram respectivamente produtividade máxima de de 334,4 mg/L.h e 308 mg/L.h de glicose em 4 horas de processo. Foi realizado um estudo de partição das enzimas obtidas utilizando sistemas aquosos bifásicos. O SAB composto por 18% Peg 4000 e 12% citrato de sódio em pH 5,0 resultou em um fator de purificação de 5,31 para a CMCase e 61,4 para celobiase. Para FPase o fator de purificação foi de 2,29 quando a concentração de citrato usada foi de 16%. A biomassa da palma mostrou-se viável tanto para a obtenção das enzimas celulases quanto para a obtenção de açúcares fermentescíveis para produção de bioetanol. Os SABs mostraram-se promissores como etapa inicial de um processo de recuperação e purificação das celulases produzidas. / The demand for renewable energy has grown worldwide. In this context, bioethanol obtained from the hydrolysis of lignocellulosic materials has been highlighted . However, the production of cellulolytic enzymes used in the hydrolysis process is costly, and this is the main obstacle for obtaining cellulosic ethanol on a large scale. This study was designed to produce cellulolytic enzymes production of bioethanol from biomass semisolid fermentation of forage cactus by the filamentous fungus Trichoderma reesei LCB 48. The study revealed that the best fermentation condition was achieved with 90 % humidity and supplementation 1% of the nitrogen source . The maximum activity was achieved in 110 hours of process, with production of 6.45 U/gds . The study of leaching of enzymes produced revealed as the best process conditions: solvent substrate ratio of 20mL/ g , 50 rpm of agitation and contact time of 15 minutes , which was obtained in crude extracts with 15.14 U/gds expressed in carboxymethylcellulase ( CMCase ) . The crude extract was stable for up to 20 days when stored at room temperature. The enzymes recovered in the leaching exhibited CMCase activity at optimal temperature of 55 ° C and optimum pH between 4.0 and 5.0 . Stability studies showed that the enzyme is deactivated at pH values above 6.5 and temperatures above 50 ° C. Hydrolysis assays of pear cactus biomass itself and the residue fermenting lignocellulosic material presented as maximum yield of 334.4 mg/Lh and 308 mg/Lh of glucose in 4 process hours respectively. A study ds enzymes obtained using aqueous two-phase partition systems was carried out . SAB composed of 18 % PEG 4000 and 12% sodium citrate at pH 5.0 resulted in a purification factor of 5.31 to 61.4 for CMCase and cellobiase. FPase for the purification factor was 2.29 when the concentration of citrate used was 16% . Biomass palm proved to be feasible for both obtaining the cellulase enzymes as to obtain fermentable sugars to bioethanol production. The SABs proved promising as an initial step in a process of recovery and purification of cellulases produced .

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO FINAL.pdf: 1117246 bytes, checksum: 91bcbcfc247218ffb970c121596f7b0c (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / The vegetal biomass consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose is the most abundant polymer and xylan is the main component of hemicellulose. The conversion of cellulose and xylan to glucose and xylose can be realized by an enzymatic complex found in secretions of microorganisms such as fungi and bacteria. Enzymatic hydrolysis is an important step to the bioconversion of cellulosic and hemicellulosic fraction from lignocellulosic wastes. The thermophilic fungus Humicola grisea var thermoidea produces an efficient complex of cellulolytic enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidase) and xylanolytic (endoxylanase and β-xylosidase) with high thermostability when grown on different lignocellulosic substrates. The aim of this study was to analyze the kinetics of production of cellulases and xylanase by the fungus H. grisea cultivated on medium containing rice straw (RS), corncob (CC), crushed cane sugar bagasse (CSB) and wheat bran (WB) as carbon source and subsequently analyze the profile of proteins with cellulolytic and xylanolytic activity secreted by the fungus when grown in minimal medium, by liquid fermentation, containing the substrates at concentrations of 1, 2 and 3% and maintained at 42 ° C, 120 rpm for different times. The best results were obtained when the fungus was grown in 3% BCA and FT, the peaks of FPase (0.17 U / mL) and CMCase (3.54 U / mL) were observed after 192 h of growth with 3% BCA , peak avicelase (0,195 U / mL) after 48 h with 3% FT and peak xylanase (23.75 U / mL) after 216 h with 3% FT. The results showed that the best inducer of enzyme production with FPase and CMCase activity was the CSB and the best inducer of enzymes production with xylanase and avicelase activity was the WB. In profile analysis of proteins secreted by H. grisea by SDS-PAGE (216 h) and zymogram (144 h), no band was seen when the fungus was grown in the presence of glucose, suggesting catabolite repression. However, two very strong protein bands corresponding to HXYN2 (23 kDa) and CBH1.2 (47 kDa) were visualized in the gels containing CSB (2 to 3%) and WB (2 and 3%). These enzymes are the main xylanolytic and cellulolytic systems of the fungus, respectively. Were monitored by recombinant enzymes from H. grisea (in gels), an endoxylanase HXYN2r (23 kDa), an cellobiohydrolase CBH1.2r (47 kDa). The masses full profile of H. grisea can be seen in Figures 13, 14, 15, 16, 18 and 19. / A biomassa vegetal é constituída principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é o polímero mais abundante e a xilana o principal componente hemicelulósico. A conversão da celulose e da xilana à glicose e xilose pode ser realizada por um complexo enzimático encontrado nas secreções de microrganismos tais como fungos e bactérias. A hidrólise enzimática é um importante passo para a bioconversão da fração celulósica e hemicelulósica de resíduos lignocelulósicos. O fungo termofílico Humicola grisea var thermoidea produz um eficiente complexo de enzimas celulolíticas (endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases) e xilanolíticas (endoxilanases e β-xilosidase) com alta termoestabilidade quando cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos. O objetivo desse trabalho foi analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo fungo H. grisea cultivado em meio contendo palha de arroz (PA), sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e farelo de trigo (FT) como fonte de carbono e posteriormente analisar o perfil de proteínas com atividade celulolítica e xilanolítica secretadas pelo fungo quando cultivado em meio mínimo, por fermentação líquida, contendo os substratos nas concentrações de 1, 2 e 3%, e mantidos a 42 °C, 120 rpm por diferentes tempos. Os melhores resultados foram obtidos quando o fungo foi cultivado em 3% de BCA e FT, sendo que os picos de FPase (0.17 U/mL) e CMCase (3.54 U/mL) foram observados após 192 e 240 h respectivamente de crescimento com 3% de BCA, o pico de Avicelase (0.195 U/mL) após 48 h com 3% de FT e o pico de xilanase (23.75 U/mL) após 216 h com 3% de FT. Os resultados demonstraram que o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de FPAse e CMCase foi o BCA e o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de Avicelase e xilanase foi o FT. Na análise do perfil de proteínas secretadas pelo H. grisea por SDS-PAGE (216 h) e zimograma (144 h), nenhuma banda foi visualizada quando o fungo foi cultivado na presença de glicose, sugerindo repressão catabólica. Entretanto, duas bandas protéicas muito fortes, correspondentes à HXYN2 (23 kDa) e CBH1.2 (47 kDa) foram visualizadas nos géis contendo BCA (2 e 3%) e FT (2 e 3%); e representam as principais enzimas dos sistemas xilanolítico e celulolítico do fungo, respectivamente. Estas foram monitoradas pelas enzimas recombinantes do H. grisea (nos geis): uma endoxilanase HXYN2r (23 kDa) e uma celobiohidrolase CBH1.2r (47 kDa). As massas do perfil completo do H. grisea podem ser vistas nas Figuras 13-19.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é uma espécie de grande importância biotecnológica no que tange a degradação de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol em larga escala. Seu sistema de enzimas celulolíticas é muito eficiente, apesar de ser possuir poucas celulases, sugerindo que o controle dessas enzimas vai além da regulação transcricional. Assim, neste trabalho nós obtivemos o perfil fosfoproteômico de T. reesei cultivado em glicose e bagaço de cana-de-açúcar a partir de análise fosfoproteômica LC-MS/MS por spectral counting. A comparação entre os perfis de fosfoproteínas obtidos das linhagens parental QM6a de T. reesei e dos mutantes knockout para TMK1 e TMK2 permitiu a demonstração de que essas MAPK agem de maneira interconectada com outras vias de transdução de sinal na célula, especialmente a via de TOR e de AMPc-PKA, para regulação da produção de celulases. Além disso, também demonstramos a regulação da resposta a estresse celular por TMK2, e o papel da fosforilação no controle direto de enzimas CAZy. Nossos resultados mostram que a fosforilação desempenha papel importante na regulação dessas enzimas e de outras funções celulares no fungo após a transcrição de seus respectivos genes. O agrupamento desses dados permite melhor entendimento da via de sinalização mediada pelas MAPK TMK1 e TMK2 de T. reesei, e como as modificações pós-traducionais promovidas por elas afetam no sensing de nutrientes celulares e, por consequência, na produção de enzimas celulolíticas, de forma direta ou indireta. / The filamentous fungus Trichoderma reesei has great biotechnological importance in regards to the lignocellulosic biomass degradation for large-scale production of bioethanol. Its cellulolytic system is very efficient, despite being composed by only a few cellulases, which suggests that the control of these enzymes goes beyond their transcriptional regulation. Thus, in this study, we performed a spectral counting LC-MS/MS analysis and achieved the phosphoproteomic profile of T. reesei grown either in glucose or sugarcane bagasse as sole carbon source. The comparison between the phosphoproteins profiles obtained from the parental strain QM6a and the knockout mutants for TMK1 and TMK2 allowed us to demonstrate that these MAPK act in an interconnected manner with other signaling transduction pathways, especially the TOR and cAMP-PKA pathways, in order to regulate the cellulases production. Furthermore, we were also able to determine the regulation of cellular stress response by TMK2, and the role of phosphorylation in the direct control of CAZymes. Our results show that phosphorylation plays an important role on the control of these enzymes and other cellular functions in T. reesei after the transcription of their respective genes. Taken together, this data allows better comprehension of the signaling pathways mediated by TMK1 and TMK2 in T. reesei, and how the post-translational modification promoted by these MAPK might affect the nutrient sensing and, therefore, the production of the cellulolytic enzymes, either directly or indirectly.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

O objetivo deste trabalho foi avaliar se as enzimas secretadas pelo fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum podem atuar como auxiliares às celulases comerciais na hidrólise de substratos celulósicos oxidados. Para isto foi realizada a oxidação de celulose microcristalina Avicel mediante reação de Fenton (Fe+2, H2O2) e tratamento com CuSO4. O substrato oxidado foi caracterizado e posteriormente foi determinado o efeito desta modificação sobre a eficiência hidrolítica de enzimas comerciais (Celluclast/Novozym) e sobre misturas destas enzimas comerciais suplementadas com extrato enzimático obtido de G. trabeum. As reações realizadas com Avicel indicaram que ambos tratamentos químicos foram efetivos para modificar grupos funcionais presentes na celulose. A caracterização fisicoquímica dos substratos oxidados permitiu concluir que o tratamento Fenton gerou transformações mais intensas na celulose do que o tratamento com CuSO4. O análise dos hidrolisados ácidos das amostras oxidadas por Fenton mediante espectrometria de massas (GC-MS) confirmou que a oxidação ocorre principalmente no C1. As hidrólises enzimáticas utilizando preparações com diferentes cargas das enzimas comerciais apresentaram uma diminuição significativa da conversão de celulose quando as amostras são tratadas com o reagente Fenton. Por outro lado, a celulose oxidada gerada pelo tratamento com CuSO4 ainda é eficientemente hidrolisada pelas enzimas. As duas amostras de celulose Avicel oxidadas também foi hidrolisada utilizando misturas de enzimas comerciais e extratos enzimáticos de G. trabeum. Em todas as condições ensaiadas a suplementação da mistura reacional com extratos enzimáticos do fungo de decomposição parda G. trabeum diminuíram a eficiência de hidrólise enzimática da celulose oxidada. O emprego do dobro de carga enzimática de enzimas comerciais permitiu recuperar os níveis de hidrólise observados na celulose in natura. / The goal of this work was to evaluate whether enzymes produced by the brown-rot fungus Gleophyllum trabeum would be able to act as auxiliary enzymes of commercial cellulases during the enzymatic hydrolysis of oxidized cellulose. To reach this goal an oxidation of microcrystalline-cellulose (Avicel) was performed by two differente reaction systems: Fenton reaction (Fe2+, H2O2) or CuSO4 treatments. The oxidized subtracts were characterized and the effect of cellulose modification on the hydrolytic efficiency of commercial enzymes, supplemented or not with the enzymes recovered from a G. trabeum culture, was determined. The Avicel treatment by the oxidative systems resulted in cellulose structural changes as evidenced by infrared spectroscopy, viscosity measurements and chemical characterization by HPLC and GC/MS chromatography of the monomers recovered after acid hydrolysis. The physicochemical characterization of the oxidized celluloses allowed to conclude that the transformation of the cellulose was more intense when Fenton treatment was used as compared with the CuSO4 treatment. The analysis of the acid hydrolysates by GC-MS indicated that the oxidation by Fenton reaction occurred mainly at the C1 of the cellulose chain, resulting in gluconic acid in the acid hydrolysates. A meaningful decrease of the cellulose conversion was observed when Fetnon-treated samples were submitted to enzymatic hydrolysis using different amounts of commercial enzymes. On the other hand, the CuSO4-oxidized cellulose was still efficiently hydrolyzed by high enzyme dosages. The oxidized Avicel substrates were also hydrolyzed using a mixture of the commercial enzymes with enzymes recovered from G. trabeum cultures. At all tested conditions, the supplementation of the reaction mixture with enzymatic extracts from G. trabeum decreased the enzymatic hydrolysis efficiency. Nevertheless, the normal levels of enzymatic hydrolysis were recovered when the commercial enzymes dosage two-fold increased.

O presente trabalho teve como principal objetivo correlacionar a composição química do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H2SO4 diluído com a eficiência da sacarificação enzimática da celulose presente no material. Primeiramente, o bagaço in natura foi extraído com água, etanol ou água seguida de etanol, e as composições químicas determinadas. Posteriormente, o bagaço in natura foi pré-tratado com H2SO4 diluído em êmbolos de 200 mL, utilizando 15% de teor de sólidos (m/v). A temperatura (112,5-157,5 °C), o tempo de residência (5-35 min) e a concentração ácida (0-3,0% m/v) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23 completo. Após o pré-tratamento, as amostras foram caracterizadas quimicamente. Em seguida, dois extratos enzimáticos comerciais foram caracterizados quanto às atividades de enzimas hidrolíticas e fenoloxidases, e aos teores de proteínas. As condições adequadas de sacarificação enzimática da celulose para a amostra de bagaço pré-tratada com H2SO4 diluído (15% sólidos, 2% ácido, a 150ºC por 30 min) foram determinadas através de planejamentos fatoriais 23 completos, variando teor de sólidos (1,19-4,81% m/v), carga enzimática (1,91-38,09 FPU/g de bagaço) e carga de surfactante (0-0,1 g/g de bagaço), para os dois extratos enzimáticos. As amostras de bagaço pré-tratadas sob diferentes condições de temperatura, tempo de residência e concentração de H2SO4 (primeiro planejamento fatorial) foram submetidas à sacarificação enzimática com um dos extratos. Por fim, amostras selecionadas foram caracterizadas quanto às alterações morfológicas provocadas pelo pré-tratamento e pela hidrólise enzimática, por microscopia eletrônica de varredura. Os resultados mostraram que água seguida de etanol extraiu maior quantidade de extrativos do bagaço. Os extrativos apresentaram absorção de luz apenas na região do ultravioleta. A porcentagem de lignina nos bagaços extraídos com água, etanol e água seguida de etanol foi menor que aquela encontrada no bagaço in natura. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente. A maior variação foi observada para hemicelulose (3,67-27,27%). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram na composição química do bagaço pré-tratado. Por sua vez, os dois extratos enzimáticos apresentaram um complexo celulolítico completo e considerável atividade de xilanases, porém não foi observada atividade de fenoloxidases. O extrato II apresentou maior quantidade de proteínas (152,45±10,0 mg/mL), comparado ao extrato I (105,2±6,6 mg/mL). Para 24 horas de hidrólise enzimática com o extrato I, as três variáveis independentes influenciaram na digestão do bagaço pré-tratado. Somente os efeitos das cargas de enzima e surfactante foram significantes, utilizando o extrato II. Posteriormente, foi possível aumentar o teor inicial de sólidos sem comprometer o rendimento de sacarificação com o extrato II. Não foi possível correlacionar a conversão de celulose com o fator de severidade do pré-tratamento. Por outro lado, foi observada correlação negativa entre o conteúdo de hemicelulose e a conversão enzimática de celulose, enfatizando a influência da composição química do bagaço de cana na hidrólise enzimática da celulose. Observaram-se diferenças morfológicas entre o bagaço in natura e amostras pré-tratadas sob condições branda e severa, bem como após suas respectivas hidrólises enzimáticas. / This study aimed to correlate the chemical composition of a sugarcane bagasse pretreated with dilute H2SO4 with the efficiency of cellulose enzymatic saccharification of this material. First, the sugarcane bagasse was extracted with water, ethanol or water followed by ethanol, and its chemical composition was determined. Subsequently, the sugarcane bagasse was pretreated with dilute H2SO4 in 200 mL stainless steel containers, using 15% of solids loading (w/v). The temperature (112.5-157.5°C), time of residence (5-35 min) and acid concentration (0-3.0% w/v) varied according to a 23 full factorial design. After the pretreatments, the chemical compositions of the pretreated bagasses were determined. Then, two commercial enzymatic extracts were characterized regarding the activities of hydrolytic enzymes and phenoloxidases, and protein contents. The enzymatic saccharification conditions for the bagasse sample pretreated with dilute H2SO4 (15% solids, 2% acid, 150°C for 30 min) were determined through 23 full factorial designs, varying the solids loading (1,19-4.81% w/v), enzyme loading (1.91-38.09 FPU/g of bagasse) and surfactant loading (0-0.1 g/g of bagasse) for the two enzymatic extracts. The bagasse samples pretreated under the different conditions of temperature, time of residence and H2SO4 concentration (first factorial design) were subjected to enzymatic saccharification using one of the extracts. Finally, selected samples were analyzed for morphological changes caused by pretreatment and enzymatic hydrolysis, by scanning electron microscopy. The results showed that water followed by ethanol extracted the highest amount of extractives. The extractives showed light absorption only in the ultraviolet region. The percentage of lignin in the bagasse samples extracted with water, ethanol and water followed by ethanol was lower than that found in the raw material. According to the pretreatment conditions, the amount of cellulose, hemicellulose and lignin in the pretreated bagasse differed substantially. The greatest variation was observed for the hemicellulose content (3.67-27.27%). All the three factors evaluated in the pretreatment affected the chemical composition of the pretreated bagasse. In turn, the two enzymatic extracts showed complete cellulolytic complexes and considerable activities of xylanases, without activities of phenoloxidases. The extract II showed higher protein content (152.45±10.0 mg/mL) when compared with the extract I (105.2±6.6 mg/mL). For 24 hours of enzymatic hydrolysis using the extract I, all the three independent variables influenced the saccharification of pretreated bagasse. Only the enzyme and surfactant loadings were significant, when using the extract II. Later, it was possible to increase the initial solids content without hindering the saccharification yield, using the extract II. It was not possible to correlate the cellulose conversion with the pretreatment severity. On other hand, it was possible to observe a negative correlation between the hemicellulose content and the efficiency of enzymatic conversion, emphasizing the influence of the sugarcane bagasse chemical composition in the enzymatic hydrolysis of cellulose. Morphological differences were observed between the raw material and sugarcane bagasse samples pretreated under high or low severity, as well as after their corresponding enzymatic hydrolysis.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é uma espécie de grande importância biotecnológica no que tange a degradação de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol em larga escala. Seu sistema de enzimas celulolíticas é muito eficiente, apesar de ser possuir poucas celulases, sugerindo que o controle dessas enzimas vai além da regulação transcricional. Assim, neste trabalho nós obtivemos o perfil fosfoproteômico de T. reesei cultivado em glicose e bagaço de cana-de-açúcar a partir de análise fosfoproteômica LC-MS/MS por spectral counting. A comparação entre os perfis de fosfoproteínas obtidos das linhagens parental QM6a de T. reesei e dos mutantes knockout para TMK1 e TMK2 permitiu a demonstração de que essas MAPK agem de maneira interconectada com outras vias de transdução de sinal na célula, especialmente a via de TOR e de AMPc-PKA, para regulação da produção de celulases. Além disso, também demonstramos a regulação da resposta a estresse celular por TMK2, e o papel da fosforilação no controle direto de enzimas CAZy. Nossos resultados mostram que a fosforilação desempenha papel importante na regulação dessas enzimas e de outras funções celulares no fungo após a transcrição de seus respectivos genes. O agrupamento desses dados permite melhor entendimento da via de sinalização mediada pelas MAPK TMK1 e TMK2 de T. reesei, e como as modificações pós-traducionais promovidas por elas afetam no sensing de nutrientes celulares e, por consequência, na produção de enzimas celulolíticas, de forma direta ou indireta. / The filamentous fungus Trichoderma reesei has great biotechnological importance in regards to the lignocellulosic biomass degradation for large-scale production of bioethanol. Its cellulolytic system is very efficient, despite being composed by only a few cellulases, which suggests that the control of these enzymes goes beyond their transcriptional regulation. Thus, in this study, we performed a spectral counting LC-MS/MS analysis and achieved the phosphoproteomic profile of T. reesei grown either in glucose or sugarcane bagasse as sole carbon source. The comparison between the phosphoproteins profiles obtained from the parental strain QM6a and the knockout mutants for TMK1 and TMK2 allowed us to demonstrate that these MAPK act in an interconnected manner with other signaling transduction pathways, especially the TOR and cAMP-PKA pathways, in order to regulate the cellulases production. Furthermore, we were also able to determine the regulation of cellular stress response by TMK2, and the role of phosphorylation in the direct control of CAZymes. Our results show that phosphorylation plays an important role on the control of these enzymes and other cellular functions in T. reesei after the transcription of their respective genes. Taken together, this data allows better comprehension of the signaling pathways mediated by TMK1 and TMK2 in T. reesei, and how the post-translational modification promoted by these MAPK might affect the nutrient sensing and, therefore, the production of the cellulolytic enzymes, either directly or indirectly.

O objetivo deste trabalho foi avaliar se as enzimas secretadas pelo fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum podem atuar como auxiliares às celulases comerciais na hidrólise de substratos celulósicos oxidados. Para isto foi realizada a oxidação de celulose microcristalina Avicel mediante reação de Fenton (Fe+2, H2O2) e tratamento com CuSO4. O substrato oxidado foi caracterizado e posteriormente foi determinado o efeito desta modificação sobre a eficiência hidrolítica de enzimas comerciais (Celluclast/Novozym) e sobre misturas destas enzimas comerciais suplementadas com extrato enzimático obtido de G. trabeum. As reações realizadas com Avicel indicaram que ambos tratamentos químicos foram efetivos para modificar grupos funcionais presentes na celulose. A caracterização fisicoquímica dos substratos oxidados permitiu concluir que o tratamento Fenton gerou transformações mais intensas na celulose do que o tratamento com CuSO4. O análise dos hidrolisados ácidos das amostras oxidadas por Fenton mediante espectrometria de massas (GC-MS) confirmou que a oxidação ocorre principalmente no C1. As hidrólises enzimáticas utilizando preparações com diferentes cargas das enzimas comerciais apresentaram uma diminuição significativa da conversão de celulose quando as amostras são tratadas com o reagente Fenton. Por outro lado, a celulose oxidada gerada pelo tratamento com CuSO4 ainda é eficientemente hidrolisada pelas enzimas. As duas amostras de celulose Avicel oxidadas também foi hidrolisada utilizando misturas de enzimas comerciais e extratos enzimáticos de G. trabeum. Em todas as condições ensaiadas a suplementação da mistura reacional com extratos enzimáticos do fungo de decomposição parda G. trabeum diminuíram a eficiência de hidrólise enzimática da celulose oxidada. O emprego do dobro de carga enzimática de enzimas comerciais permitiu recuperar os níveis de hidrólise observados na celulose in natura. / The goal of this work was to evaluate whether enzymes produced by the brown-rot fungus Gleophyllum trabeum would be able to act as auxiliary enzymes of commercial cellulases during the enzymatic hydrolysis of oxidized cellulose. To reach this goal an oxidation of microcrystalline-cellulose (Avicel) was performed by two differente reaction systems: Fenton reaction (Fe2+, H2O2) or CuSO4 treatments. The oxidized subtracts were characterized and the effect of cellulose modification on the hydrolytic efficiency of commercial enzymes, supplemented or not with the enzymes recovered from a G. trabeum culture, was determined. The Avicel treatment by the oxidative systems resulted in cellulose structural changes as evidenced by infrared spectroscopy, viscosity measurements and chemical characterization by HPLC and GC/MS chromatography of the monomers recovered after acid hydrolysis. The physicochemical characterization of the oxidized celluloses allowed to conclude that the transformation of the cellulose was more intense when Fenton treatment was used as compared with the CuSO4 treatment. The analysis of the acid hydrolysates by GC-MS indicated that the oxidation by Fenton reaction occurred mainly at the C1 of the cellulose chain, resulting in gluconic acid in the acid hydrolysates. A meaningful decrease of the cellulose conversion was observed when Fetnon-treated samples were submitted to enzymatic hydrolysis using different amounts of commercial enzymes. On the other hand, the CuSO4-oxidized cellulose was still efficiently hydrolyzed by high enzyme dosages. The oxidized Avicel substrates were also hydrolyzed using a mixture of the commercial enzymes with enzymes recovered from G. trabeum cultures. At all tested conditions, the supplementation of the reaction mixture with enzymatic extracts from G. trabeum decreased the enzymatic hydrolysis efficiency. Nevertheless, the normal levels of enzymatic hydrolysis were recovered when the commercial enzymes dosage two-fold increased.