Les complexes des pores nucléaires (NPCs) sont des assemblages protéiques ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN) qui permettent et régulent les échanges entre le cytoplasme et le noyau. Au-delà de leur fonction de transport, plusieurs sous unité des NPCs (les nucléoporines, Nups) jouent un rôle important dans d’autres processus cellulaire tels que la division cellulaire et la différenciation. Le complexe-Y, composé de 9 Nups distincte, dont Nup133, représente une sous unité structurale des NPCs. Cependant, une fraction de ce complexe est localisée aux kinétochores (KTs) durant la mitose, où il est requis pour la ségrégation des chromosomes. Cette localisation aux KTs dépend du complexe Ndc80 mais également de Cenp-F. Par ailleurs, l’interaction Nup133/Cenp-F s'effectue aussi au niveau de l'EN en prophase, ce qui permet le recrutement de la dynéine, étape requise pour l’ancrage des centrosomes à l’EN dans les cellules HeLa et pour la migration du noyau vers le centrosome dans les progéniteurs neuronaux de cerveau de rat. Des études développementales chez la souris ont précédemment identifié le mutant merm qui meurt en milieu de gestation (E10.5). Bien que la mutation merm entraine l’absence de Nup133, la prolifération des cellules souches embryonnaires (mESCs) dérivées de blastocystes merm (Nup133-/-) n’est pas altérée. Cependant l’absence de Nup133 altère la différenciation des mESCs, notamment en neurones post-mitotique. Ce projet de thèse visait à comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels Nup133 contribue à la division et la différenciation cellulaire. Afin de caractériser le phénotype des mESCs Nup133-/-, nous avons utilisé deux protocoles de différenciation in vitro, vers une voie neuroectodermale ou mésoendodermale. Cette étude a montré que le nombre de cellules est fortement diminué chez le mutant Nup133-/- comparé aux cellules contrôles lors de la différenciation des mESCs. Cependant les mESCs Nup133-/- qui survivent montrent, comme les mESCs contrôles, une diminution de l’expression des marqueurs de pluripotence et une augmentation des marqueurs de différentiation. L’analyse par cytométrie de flux n’a pas révélé d'altération majeure dans la progression du cycle cellulaire mais à mis en évidence une augmentation de la mort cellulaire lors de la différenciation des mESCs Nup133-/-. Afin de déterminer les domaines de Nup133 requis pour la différenciation des mESCs, nous avons développé une stratégie de sauvetage en établissant des lignées mESCS Nup133-/- qui expriment de manière stable GFP-Nup133, différentes délétions de Nup133 qui n’altèrent pas sa localisation au NPCs (GFP-Nup133DN, DMid, et DC) ou la GFP seule comme contrôle. Des études fonctionnelles ont indiqué que le domaine N-ter (NTD) de Nup133 est requis pour la différenciation des mESCs.Le seul partenaire identifié de Nup133-NTD étant Cenp-F, j’ai décidé de déterminer si l’interaction Nup133/Cenp-F jouait un rôle dans la différenciation des mESCs. En collaboration avec l’équipe de R. Guerois, nous avons simulé in silico l’interaction de Nup133-NTD avec un peptide de Cenp-F que nous avions identifié dans des cribles en double hybride. Cette modélisaton nous a permis de concevoir des mutants affectant la surface d’interaction Nup133/Cenp-F. Nous avons montré que ces mutations empêchent la localisation de Cenp-F à l’EN sans altérer sa présence aux KTs. J’ai également utilisé la stratégie de sauvetage décrite plus haut, pour étudier un mutant de Nup133 qui empêche son interaction avec Cenp-F. Cette étude a montré que l’interaction Nup133/Cenp-F n'est pas requise pour la différenciation in vitro des mESCs. L’étude de Cenp-F a été complétée par la caractérisation d’une mutation de Cenp_F qui affecte sa localisation aux KTs. Nous avons montré que cette mutation altère l’interaction entre Cenp-F et Bub1 mais sans affecter celle avec Nup133. Cette étude a ainsi permis d'identifier Bub1 comme un partenaire direct de Cenp-F requis pour son ancrage aux KTs. / Nuclear pores complexes (NPCs) are macromolecular assemblies anchored in the nuclear envelope (NE) providing the gates that allow and regulate all exchanges between the nucleus and the cytoplasm. Beyond their function in transport, several NPC subunits, the nucleoporins (Nups), have been demonstrated to also play important roles in other cellular processes including cell division and differentiation.The Y-complex, composed of 9 distinct Nups, including Nup133, represents a major structural subunit stably bound to both the cytoplasmic and nuclear faces of the NPCs. Beyond its structural role at nuclear pores, the Y-complex localizes at kinetochores in mitosis, where it is required for chromosome segregation. This kinetochores localization relies on the Ndc80 complex, but also on Nup133/Cenp-F interaction. The Nup133/Cenp-F interaction also contributes to the recruitment of dynein to the NE, a process that is required for the correct centrosomes tethering at the NE in prophase HeLa and for the migration of the nucleus towards the centrosomes prior to mitotic entry in rat brain progenitor cells.Developmental studies previously identified the mouse merm mutant that dies in midgestation (E10.5). In collaboration with the team of E. Lacy, the team of V. Doye showed that the merm mutation leads to the absence of Nup133. Importantly this study further revealed that self-renewal is not impaired in embryonic stem cells (mESCs) derived from merm (Nup133-/-) blastocyst. However, the lack of Nup133 impairs mESC differentiation into postmitotic neurons. How Nup133 contributes to ESCs differentiation remains however unknown.This PhD project aimed at understanding the cellular mechanisms explaining Nup133 contribution to cell division and differentiation.To characterize Nup133-/- mESCs differentiation phenotype, we used two distinct in vitro differentiation protocols, towards either neuroectodermal or mesoendodermal fate. This study revealed that cell number was strongly decreased in Nup133-/- relative to WT in mESC differentiation. However, the few Nup133-/- mESCs that survived displayed, as WT mESCs, a decreased expression of pluripotency markers and acquired differentiated state based on marker expression. FACS analyses did not reveal any major alteration of cell cycle progression but showed increased cell death upon differentiation.To determine which domain of Nup133 is critical for mESC differentiation, we developed a “rescue strategy” using Nup133 alleles deleted for structurally defined domains. Therefore, we established Nup133-/- mESC lines stably expressing GFP-Nup133, GFP-Nup13-ΔN, different ΔC-ter domain (that did not impair the binding of Nup133 to the NPC) or GFP alone as control. Functional studies indicated that while full length and C-ter deleted Nup133 rescue Nup133-/- ESCs defect in differentiation, Nup133-ΔN does not.The only identified partner of Nup133-NTD is Cenp-F. In view of the role of Nup133-NTD in mESC differentiation, I decided to determine if Nup133/Cenp-F interaction contributes to mESC differentiation. In collaboration with R. Guerois' team we simulated in silico the interaction of Nup133-NTD with a short peptide of Cenp-F that we previously identified using yeast-2-hybrid (Y2H) screens. We could thereby design mutants affecting Nup133/Cenp-F contact and show that they prevent Cenp-F localization to the nuclear envelope without altering its kinetochore localization. I then used the “rescue strategy” described above to study a Nup133 mutant specifically impairing its interaction with Cenp-F. This analysis revealed that Nup133/Cenp-F interaction is dispensable for in vitro mESC differentiation. This study on Cenp-F was completed by the characterization of a mutation within an adjacent leucine zipper affecting Cenp-F targeting to kinetochores. We evidenced that this mutation impairs Cenp-F interaction with Bub1 but not with Nup133, identifying Bub1 as a direct kinetochore tether of Cenp-F.

La maturation de nombreuses protéines requiert une voire plusieurs modification(s) post-traductionnelle(s). Environ 60 oncoprotéines (Ras, Rheb, RhoB, CENP-E, -F) sont activées par une série de modifications post-traductionnelles incluant la prénylation, la protéolyse et la carboxyméthylation. La prénylation est l'ajout d'un groupement isoprénoïde sur le résidu cystéinyle localisé au niveau de la séquence C-terminale tétrapeptidique appelée "boîte CA1A2X" (A1A2: deux acides aminés aliphatiques; X: une méthionine ou une sérine pour la FTase et une leucine ou une isoleucine pour la GGTase-I). Cette réaction est catalysée par une métaloenzyme à zinc, la farnésyltransférase (C15) (FTase) ou la géranylgéranyltransférase (C20) (GGTase-I). La farnésylation apporte l'hydrophobie suffisante pour la localisation cellulaire adéquate de protéines suractivées dans certaines pathologies comme le cancer. Ce disfonctionnement peut être induit soit directement par mutation de la protéine farnésylée soit indirectement par mutation d'un activateur ou inactivateur de la protéine farnésylée. D'intenses études se sont donc focalisées pour concevoir des inhibiteurs de farnésyltransférase (FTis).<br />Actuellement, trois composés, avec une inhibition sélective de la FTase vis-à-vis de la GGTase-I, sont en essais cliniques. Une étude sur des lignées cellulaires cancéreuses a montré que plus de 70% de ces lignées sont sensibles aux FTis, mais leur mécanisme d'action exact reste encore inconnu. Une connaissance précise du nombre de protéines farnésylées et l'élucidation des conséquences de leur farnésylation faciliteraient la découverte de ce mécanisme. Cependant, l'excellente efficacité et la faible toxicité systémique sur des modèles précliniques animaux des FTis présentent ces inhibiteurs comme agents prometteurs dans la thérapie anti-cancéreuse.<br />Une des stratégies pour inhiber cette enzyme consiste à concevoir des peptidomimétiques de la "boîte CA1A2X". La connaissance de la FTase a permis le passage des FTis peptidomimétiques contenant des thiols à des molécules sans thiol, non-peptidiques, pouvant ou ne pouvant pas interagir avec l'atome de zinc. Sur la base de ce modèle et d'études de modélisation moléculaire, nous avons conçu trois séries de composés, dans lesquelles le chélateur de zinc, le 1-(4-cyanobenzyl)-5-méthylimidazole, est constant :<br />- une série dans laquelle l'espaceur est la 4-aminopipéridine-2-carboxylate de méthyle où la partie hydrophobe est substituée,<br />- deux séries où l'espaceur est le 1,4-diazépane substituté ou non par un phényle et dans lesquelles la partie hydrophobe est l'élément de modulation.<br />Les évaluations enzymatique et cellulaire (DU145 et PC3) des composés synthétisés nous ont permis de compléter les relations structure-activité, permettant ainsi de proposer de nouvelles structures. Les protéines associées aux centromères, CENP-E et CENP-F, sont des cibles pertinentes des FTis, puisque leur association fonctionnelle avec le fuseau mitotique nécessite une farnesylation. Nous avons également souhaité évaluer quelques FTis sélectionnés pour leur effet sur les CENP.