Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T23:06:32Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoMolecularInicial.PDF: 9043527 bytes, checksum: ec8797c765bb1bf67e3b219963d610be (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-18T18:23:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoMolecularInicial.PDF: 9043527 bytes, checksum: ec8797c765bb1bf67e3b219963d610be (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-18T18:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoMolecularInicial.PDF: 9043527 bytes, checksum: ec8797c765bb1bf67e3b219963d610be (MD5) Previous issue date: 2010 / O sucesso da parasitemia por Schistosoma mansoni apresenta uma relação direta com a adaptação do parasito a diferentes ambientes e hospedeiros durante um ciclo biológico completo. Um dos mecanismos que estão envolvidos na adaptação do parasito é a expressão estágio específica de um conjunto de genes que são expressos de maneira coordenada, cujo controle pode ser tanto a nível transcricional como traducional. Um bom exemplo destes mecanismos de regulação da expressão gênica estágio-específico é a transição de cercária a esquistossômulo onde a diferenciação e as mudanças morfológicas e bioquímicas acontecem independente de síntese protéica. Vaults são ribonucleoproteínas com 13MDa, altamente conservadas entre eucariotos inferiores e superiores e compostas por um conjunto de três proteínas: Major Vault Protein (MVP), Vault (PolyADP-Ribose) Polymerase (VPARP) e Telomerase-associated Protein (TEP1), além de um pequeno RNA não traduzido. Em células de mamíferos, o papel biológico de Vaults está associado ao fenótipo de resistência a múltiplas drogas, ao transporte núcleo-citoplásmico e a vias de transdução de sinal. Até o momento a função exata deste complexo é desconhecida. A análise genômica comparada mostrou que organismos modelos como Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster não possuem genes codificadores para os constituintes de Vaults, homólogos ao de mamíferos. Entretanto, estas mesmas análises mostraram a existência de genes relacionados à Vaults em S. mansoni. Estas observações levantaram várias questões, dentre elas o envolvimento de Vaults nos mecanismos de adaptação do parasito no hospedeiro mamífero. Desta forma, o objetivo geral desse trabalho foi realizar a caracterização molecular inicial dos constituintes de Vaults em S. mansoni. Através de ferramentas de bioinformática, os possíveis componentes protéicos de Vaults foram recuperados do banco de dados e utilizados na identificação, por homologia, de suas ortólogas em organismos superiores e inferiores, seguida pela análise dos dados recuperados. Os resultados sugerem que os componentes SmMVP e SmTEP-1 são conservados e que a SmVPARP e os vRNAs de S. mansoni permanecem por serem identificados. Os níveis de expressão dos componentes de Vaults foram quantificados utilizando PCR convencional e confirmados por qRTPCR utilizando RNA total de verme adulto, ovos, cercária e esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT) com 3,5 horas, 1, 2, 3, 5 e 7 dias de cultivo in vitro. Os resultados sugerem uma expressão equivalente em todos os estágios evolutivos analisados. Para avaliar se os níveis equivalentes dos transcritos para a SmMVP iriam refletir nos níveis protéicos, foram realizados experimentos de western blot. Os resultados sugerem níveis equivalentes da MVP corroborando com os resultados da analise da expressão gênica ao nível da transcrição. Em conjunto, os resultados sugerem que o complexo Vault pode estar envolvido na regulação de processos celulares relacionados ao sucesso do parasitismo tanto durante a rota de peregrinação como na manutenção da infecção no hospedeiro mamífero. __________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The success of parasitemia by Schistosoma mansoni has a direct relation to the parasite adaptation to different environments and hosts during a complete life cycle. One of the mechanisms that are involved in the adaptation of the parasite is a stage-specific expression of a set of genes that are expressed in a coordinated manner, which can be controlled both the transcriptional and translational levels. A good example of mechanisms for stage-specific gene expression control is the cercariae-schistosomula transition in where the differentiation and morphological and biochemical changes occur independent of protein synthesis. Vaults are a 13MDa ribonucleoproteins, highly conserved between lower and higher eukaryotes and consist of a set of three proteins: Major Vault Protein (MVP), Vault (PolyADP ribose) polymerase (VPARP) and Telomerase-associated protein (TEP1), and a small untranslated RNA. In mammalian cell, the biological role of Vaults is associated with the phenotype of multidrug resistance, nuclearcytoplasmic transport and signal transduction pathways. To date, the exact function of this complex is unknown. The comparative genomic analysis showed that model organisms like Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster does not possess genes coding for Vaults constituents, homologues to the mammalian. However, the same analysis showed the existence of related Vaults genes in S. mansoni. These observations raised several questions, among them the involvement of Vaults in the mechanisms of parasite adaptation in its mammalian host. Thus, the general objective of this work was the initial molecular characterization of the Vaults constituents in S. mansoni. Through bioinformatics tools, the putative Vaults protein components were recovered from database and used by search to identification of this orthologues in higher and lower organisms, followed by analysis of data retrieved. The results suggest that Vaults components SmMVP and SmTEP-1 are conserved and, for another hand SmVPARP and S. mansoni vRNA remain to be identified. The expression levels of the Vaults components were quantified using PCR and confirmed by qRT-PCR using total RNA from adult worms, eggs, cercariae and mechanically transformed schistosomula (MTS) at 3.5 hours, 1, 2, 3, 5 and 7 days of in vitro cultivation. The results suggest an equivalent expression in all developmental stages analyzed. To analyze whether equivalent levels of transcripts from SmMVP can be reflect on the protein levels, we performed western blot experiments. The results suggest equivalent levels of MVP corroborating the results of gene expression at transcriptional levels. Taken together, the results suggest that the Vault complex may be involved in cellular processes that are related to the success of parasitism during both peregrination as a maintenance of the infection in the vertebrate host.