Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) sont des symbiontes racinaires colonisant la plupart des plantes terrestres, incluant les plantes d'importance agricole. Ils sont des microorganismes clés pour le développement durable de l'agriculture. Cependant leur étude avec les techniques actuelles de culture est difficile. La technique de la culture in vivo en pot impose au champignon de se propager dans du sol, substrat opaque alors que la technique de la culture in vitro lui permet de se propager sur une gélose transparente mais en conditions stériles. Cette dernière technique fonctionne uniquement avec quelques espèces de CMA. La solution idéale aux deux difficultés est de combiner les avantages des deux techniques sans leurs inconvénients. L'utilisation de polymère superabsorbant (PSA) permet de cultiver plusieurs espèces de CMA avec une plante-hôte sur un substrat transparent en conditions non stériles. Il est alors possible d'observer le développement de la symbiose entre la plante et le CMA sans perturber la culture. Quatre espèces de CMA (Funneliformis geosporum, Racocetra fulgida, Rhizophagus irregularis et Sclerocystis sp.) ont ainsi pu être cultivées à partir de monospores. Cette technique a le potentiel de faciliter l'étude des CMA en rendant la culture des CMA plus accessible et d'accroitre éventuellement la qualité (pureté) des cultures de CMA des collections internationales. Cette technique peut également être utilisée ou adaptée pour étudier les relations tripartites Plante-CMA-Bactéries. La culture autotrophique à base de PSA, est simple, peu coûteuse et n'implique pas de manipulation de produits dangereux ni d'équipement de laboratoire dispendieux. / Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are root symbionts colonizing most terrestrial plants, including plants of agricultural importance. They are key microorganisms for the sustainable development of agriculture. However, their study with current culture techniques is not easy. The in vivo pot culture technique requires the fungus to propagate in soil, an opaque substrate while the technique of in vitro culture requires the fungus to propagate on a transparent medium but in sterile conditions. This last technique accommodates only a limited number of species. To improve the culture of AMF, an avenue would be to combine the advantages of both methods without their drawbacks. Here we show that the use of super-absorbent polymer (SAP) allows the cultivation, started from single spores, of four species of AMF (Funneliformis geosporum, Racocetra fulgida, Rhizophagus irregularis and Sclerocystis sp.) with a host plant on a transparent substrate under non-sterile conditions. The single-spore cultures ensured the purity of subsequent cultures. This technique makes it possible to observe the development of the symbiosis without disturbing the culture. It has the potential to facilitate the study of CMA by making their culture more accessible and eventually increase the quality (purity) of CMA cultures in international collections. This technique can also be used or adapted to study tripartite plant-AMF-bacteria relationships. The SAP-based autotrophic culture is simple, inexpensive and does not involve the handling of hazardous materials or expensive laboratory equipment.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La Tara (Caesalpinia spinosa) est une espèce forestière d’une grande importance en raison d’une forte demande sur le marché international pour les tanins présents dans ses gousses, et pour les gommes provenant de ses graines. Malgré son importance économique pour le Pérou, la majeure partie de la production provient de forêts naturelles non aménagées. Ces forêts présentent des problèmes de sol (érosion, faible fertilité, présence d’agents pathogènes, manque d'irrigation), qui conduisent à des rendements faibles. C’est pourquoi dans le présent travail, nous étudions les composantes microbiologiques du sol associé à cette culture, telles que les mycorhizes et les bactéries dont l’utilisation, selon de nombreuses études, s’est révélée être une alternative à l'utilisation d'engrais chimiques. Pour cela, nous avons procédé à l'analyse moléculaire de la diversité des champignons mycorhiziens arbusculaires par la technique de Miseq Illumina, ce qui nous a permis de mettre en évidence une prépondérance de Gloméracées parmi lesquelles les Rhizophagus spp. étaient retrouvés dans 70% des séquences. En outre, la dépendance de la Tara vis-à-vis de la mycorhization a été démontrée car, après avoir testé la mycorhization contrôlée de la Tara par Rhizophagus irregularis, il a été constaté que la croissance de Caesalpinia spinosa était considérablement améliorée, ainsi que l'absorption d'éléments nutritifs tels que l'azote (N) et le phosphore (P). Pour vérifier la capacité à noduler de la Tara, différents milieux de culture ont été utilisés ainsi que différentes conditions de croissance, en serre et in vitro. Ces expérimentations ont toutes montré que les racines de Tara ne présentaient pas de nodules, confirmant que cette légumineuse de la sous-famille des Caesalpinioideae est non nodulante. Par conséquent et afin d’étudier la diversité des rhizobia présents dans le sol de la plantation de Tara, nous avons utilisé en serre une plante-piège, le pois (Pisum sativum) car c’est une légumineuse nodulante et de plus est traditionnellement associée à la culture de Tara. Les rhizobia identifiés moléculairement se sont révélés très spécifiques et différents des rhizobia présents dans les sols extérieurs à la plantation de Tara. Plus particulièrement, ces rhizobia se sont révélés être phylogénétiquement proches de R. etli, R. phaseoli, R. pisi et R. leguminosarum. Enfin, un test d'inoculation contrôlée (in vitro) a été réalisé sur des plantules de pois, avec ces bactéries préalablement piégées et isolées du pois. Il a été observé que les rhizobia piégés à partir des sols collectés entre deux lignes de Tara et sur la ligne de plantation de Tara, ont stimulé la croissance du pois par rapport aux rhizobia présents dans les sols collectés à l'extérieur de la plantation. / The Tara (Caesalpinia spinosa) is a forest species of great importance due to its high demand in the international market for the tannins present in its pods and its seeds’ gum. Despite its great importance for Peru, most of the production comes from unmanaged natural forests. These forests present soil problems (e.g., erosion, low fertility, pathogens, lack of irrigation), which cause low yields. Therefore, in the present work we seek to study the soil components associated with Tara plantation , such as mycorrhizae and bacteria that have proved to be an alternative for reducing the use of chemical fertilizers in similar context (Aboubacar et al., Flores Chavez 20015, E and Saif 1987, Dia et al. 2010; Bilgo et al., 2013) . We used molecular analysis of the arbuscular diversity by the Miseq Illumina technique that allowed to verify the arbuscular diversity with a preponderance of Glomeraceae among which the Rhizophagus spp were found to be present in 70% of the sequences. In addition, the dependence of the Tara on obligatory mycorrhization was demonstrated, after testing the controlled mycorrhization of the Tara by the Rhizophagus irregularis. We found that the growth of this crop was significantly improved, as well as the absorption of nutrients such as nitrogen (N) and phosphorus (P).To check the nodulation of the Tara, different culture media were used (JenSen, sand mixture with Tara plantation soil, attapulgite mixture with Tara plantation soils) in greenhouse and in vitro condition. We did not manage to find rhizobial nodules in the roots which let us think that Tara is a non-nodular legume. Therefore, we used Pisum sativum as a trap plant to study the diversity of rhizobia present in the soil of the Tara plantation since this legume is often associated with Tara crop. The rhizobia found in the trap plant were very specific and different from the rhizobia present in soils outside the Tara plantation. Likewise, these rhizobia found to be phylogenetically close to R. etli, R. phaseoli, R. pisi and R. leguminosarum. Finally, we inoculated the trapped bacterias (in vitro) in Pisum sativum with the bacterias previously trapped and isolated from the pea (which grew in the green house); where it was observed that the rhizospheric bacteria of the zones IL (soil collected between two lines) and L (soil collected from the same line) from the plantation of Tara stimulated the growth of this crop with respect to the bacteria present in soils collected outside of the plantation (OP zone).

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse (D.R.Min.) -- Université du Québec à Chicoutimi, programme en association avec l'Université du Québec à Montréal, 2006. / Bibliogr.: f. 150. Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Une énorme partie du phosphore (P) soluble ajouté sous forme d’engrais chimiques et de fumiers précipite dans le sol et devient non disponible aux plantes. Par ailleurs, l’utilisation excessive des engrais chimiques n’est pas compatible avec l’agriculture moderne qui se veut durable, ni avec l’agriculture biologique. De plus, ces pratiques ont été effectuées sans tenir compte de la microflore présente au niveau de la mycorhizosphère ce qui conduit à des applications pouvant être onéreuses et néfastes. En effet, les microorganismes bénéfiques du sol, notamment les bactéries solubilisant les phosphates (BSP) et les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA), ont une influence importante sur la fertilité des sols et la productivité végétale. Une nouvelle approche basée sur le piégeage des BSP au niveau de l’hyphosphère du CMA Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, préalablement inoculé avec des suspensions de microorganismes telluriques, a permis d’isoler des BSP compétentes capables de dissoudre efficacement le phosphate de roche (PR) d’origine ignée en milieu liquide. Les travaux ont ensuite permis de prouver l’importance du synergisme entre les hyphobactéries (Burkholderia anthina Ba8 et Rhizobium miluonense Rm3) et le mycélium extraracinaire des CMA Ri dans l’amélioration de la solubilisation des phosphates in vitro. L’étude approfondie des mécanismes qui pourraient être impliquées dans cette interaction montre que les hyphobactéries, principalement la souche B. anthina Ba8, adhèrent fortement à la surface des hyphes et aussi à celle du PR. Il est fortement probable que les interactions décrites ainsi que les caractéristiques bénéfiques aux plantes exprimées par les BSP sont responsables de l’amélioration de la croissance, de la nutrition phosphatée et du rendement en matière fraîche et sèche chez le maïs cultivé en serre, coinoculé avec les BSP et les CMA Ri et fertilisé avec le superphosphate ou le PR du Québec. / Soluble phosphorus (P) fertilizers added to soil rapidly precipitate, forming sparingly soluble phosphates, not available to plants. Furthermore, the excessive use of chemical fertilizers to compensate soil P deficiency is not considered sustainable and it leads to costly and potentially harmful applications. Many reports confirmed that beneficial soil microorganisms, including phosphate-solubilizing bacteria (PSB), have a significant influence on soil fertility and crop productivity. Indeed, PSB can also improve phosphate rock (PR) efficiency when directly applied to soil. However, most published works on PSB overlooked the possible interaction between PSB and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), which are ubiquitous in cultivated plants. A new approach based on the trapping of PSB strongly attached to the hyphosphere of AMF Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198, previously inoculated with microbial soil suspensions was developed to isolate relevant PSB able to mobilize P from a low reactive igneous PR more efficiently than those directly isolated from the same rhizosphere soil samples. An in vitro study demonstrated that the synergism between hyphobacteria (Burkholderia anthina Ba8 and Rhizobium miluonense Rm3) and Ri hyphae highly improved the solubilisation of PR. Our results go beyond the existing studies and showed specific mechanisms involved on PSB-AMF interactions. Indeed, hyphobacteria, mainly B. anthina Ba8, strongly adhere to Ri hyphal surfaces and PR particles forming a structured biofilm. Under greenhouse conditions, the direct application of PSB and AMF Ri as biostimulants for sustainable corn production showed that these beneficial microorganisms improve growth and P uptake of corn fertilized with superphosphate or Quebec PR.

L'utilisation des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) pourrait constituer une alternative potentielle aux traitements fongicides conventionnels pour lutter contre les maladies cryptogamiques des plantes. Notre travail a consisté à étudier l'éventuel effet protecteur de la mycorhization arbusculaire chez le blé tendre (triticum aestivum L.) contre Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt), un champignon biotrophe responsable de l'oïdium, une maladie affectant les parties aériennes de la plante. L'inoculation mycorhizienne du blé avec le CMA Funneliformis mosseae (FM), en conditions controlées et optimisées, nous a permis d'obtenir parallèlement à un taux de mycorhization de 38% des plants de blé, une amélioration significative de la biomasse et un taux de protection contre Bgt estimé à 78%. Ces résultats suggèrent l'induction d'une résistance systémique des réactions de défense du blé par mycorhization (Mycorrhiza-Induced Resistance, MIR). Cette protection serait liée à une accumulation de composés phénoliques et de preoxyde d'hydrogène dans les cellules épidermiques des feuilles de blé mycorhizé, au niveau du site de pénétration de Bgt. Une surexpression des gènes POX, PAL, CH11 et NPR1 codant pour des marqueurs de défense a également été mise en évidence dans les feuilles en absence d'infection par Bgt. Enfin, nos travaux ont également souligné l'intégration de divers paramètres pour optimiser l'utilisation des CMA comme agents de biocontrôle chez le blé. La meilleure protection contre l'oïdium a été obtenue aec un apport en phosphore réduit de 5 fois par rapport à celui préconisé au champ et un inoculum mycorhizien à base de Fm, que ce soit chez un cultivar modérément sensible ou un cultivar plus résistant. / The use of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) could be an innovative alternative to chemicals against fungal plant diseases. Our work aimed at studying the possible protective effect of arbuscular mycorrhization in the bread wheat (Triticum aestivum L.) against Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt), a biotrophic fungi responsible of wheat powdery mildew, a disease affecting the aerial plant organs. Wheat mycorrhizal inoculation by Funneliformis mosseae (Fm), under controlled and optimized conditions, allowed us to obtain concomitantly a micorrhizal rate of 38%, a significant increase of plant biomass and a protection level against Bgt estimated at 78%. These results suggest the induction of systemic wheat defense reactions resulting from mycorrhization (Mycorrhiza-Induced Resistance - MIR). This protection is linked to an accumulation of phenolic compounds and hydrogen peroxide at the Bgt penetration sites in epidermal leaf cells of mycorrhized wheat plants. Up-regulations of POX, PAL, NPR1 and CH11 genes encoding for defense markers were also pointed out in leaves of mycorrhizal wheat in the absence of Bgt infection. Moreover, our study highlighted the importance of taking into account various parameters to optimize the use of AMF as biocontrol agents. The highest protection against powdery mildew was obtained with a 5-fold reduced phosphorus input compared to that recommended in the field and with the mycorrhizal inoculum Fm, in both a moderately susceptible or a more resistant cultuva

L'endosymbiose racinaire entre les plantes et les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) permet aux plantes d'avoir un meilleur accès aux nutriments du sol. Pour cette raison, cette endosymbiose joue un rôle majeur dans les écosystèmes et pour l'agriculture durable. Les étapes clés de la colonisation des racines par les CMA sont: 1) la pénétration des CMA dans le système racinaire à travers les cellules de l'épiderme et du cortex externe, et 2) la formation dans les cellules du cortex interne d'une structure ramifiée appelée arbuscule, qui permet des échanges entre les cellules végétales et les hyphes fongiques. L'établissement de cette symbiose implique une communication entre les deux partenaires. Les plantes produisent des hormones, les strigolactones qui induisent chez les CMA la production de signaux symbiotiques : des lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCO) et des chitooligosaccharides courts (Myc-COs). Les Myc-LCO et les Myc-CO induisent des réponses moléculaires et physiologiques chez les plantes qui sont capables de former des mycorhizes à arbuscules. Cependant, leur rôle exact dans l'établissement des mycorhizes à arbuscules n'est pas connu. La difficulté à cultiver et transformer le partenaire fongique de cette symbiose rend la recherche compliquée du côté fongique. Du côté des plantes, on sait que des membres de la famille des récepteurs kinases à domaines lysin (LysM-RLK) perçoivent des LCO et des CO produits par divers microorganismes et sont donc de bons candidats pour percevoir des Myc-LCO et des Myc-CO. La plupart des recherches sur les mycorhizes à arbuscules sont réalisées chez des légumineuses, espèces chez lesquelles plusieurs duplications de gènes codant les LysM-RLK ont eu lieu. J'ai donc utilisé lors de mon doctorat des Solanaceae (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida et Nicotiana benthamiana) pour étudier le rôle de deux récepteurs putatifs de Myc- LCO, codés par les gènes LYK10 et LYK4. Ces deux gènes, physiquement proches l'un de l'autre dans les génomes de la plupart des dicotylédones, proviennent probablement d'une ancienne duplication en tandem. En utilisant une approche biochimique, nous avons montré que SlLYK10 de S. lycopersicum est capable de lier des LCO avec une haute affinité. De plus, j'ai montré que le promoteur de SlLYK10 est exprimé dans l'épiderme et le cortex externe avant la colonisation par les CMA, puis dans des cellules contenant des arbuscules au cours de la colonisation par les CMA. Enfin, des approches de génétique inverse chez la tomate et le pétunia ont permis de démontrer que LYK10 contrôle la pénétration des CMA dans les racines et la formation des arbuscules. Ces résultats suggèrent que LYK10 perçoit les LCO et active chez les plantes la machinerie nécessaire à la pénétration de CMA dans les cellules végétales et à la formation des arbuscules. / The root endosymbiosis between plants and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) allows the plants to have a better access to soil nutrients. For this reason this endosymbiosis plays a major role in ecosystems and in sustainable agriculture. The key steps for AMF colonization are: 1) the AMF penetration in the root system through crossing epidermal/outer cortical cells, and 2) the formation of a branched inner cortex structure called arbuscules that permits exchanges between plant cells and fungal hyphae. The establishment of this symbiosis involves communication between the two partners of the symbiosis. Plants produce strigolactones, hormones that induce in AMF the production of symbiotic signals : lipo-chitooligosaccharides (Myc-LCOs) and short chitooligosaccharides (Myc-COs). Both Myc-LCOs and Myc-COs induce plant molecular and physiological responses known to be associated with the formation of arbuscular mycorrhiza (AM). However, theit exact role in AM establishment is unknown. The difficulty to grow and transform the fungal partner of this symbiosis makes the research complicated on the fungal side. On the plant side, members of the lysin motif receptor-like kinase (LysM-RLK) family are known to perceive LCOs and COs produced by various microorganisms and are thus good candidates to perceive Myc-LCOs and Myc-COs. Most of the laboratory researches on AM conducted worldwide are performed on legumes where the LysM-RLK family has encountered several gene duplications. During my PhD I used Solanaceae species (Solanum lycopersicum, Petunia hybrida and Nicotiana benthamiana) to study the role of two candidate Myc-LCO receptors encoded by the genes LYK10 and LYK4. These two genes are physically close to each other in genomes of most of the dicotyledons and likely originate from of an ancient tandem duplication. By using a biochemical approach, we showed that S. lycopersicum SlLYK10 is able to bind LCOs with high affinity. Moreover, I showed that SlLYK10 promoter is expressed in epidermis/outer cortex before AMF colonization and also in arbuscule-containing cells during colonization. Finally, reverse genetic approaches in tomato and petunia allowed demonstrating that LYK10 controls AMF penetration into the roots and arbuscule formation. Taken together, these results suggest that LYK10 perceive LCOs and induce/activate the plant machinery required for AMF penetration into plant cells. Altogether this strongly suggests that LCOs play a role in AMF perception by plant during AM establishment. By using the same approaches, we found that N. benthamiana NbLYK4, as its orthologs in legumes and other dicotyledons, also binds LCOs with high affinity and is involved in AM establishment and plant defence. NbLYK4-silenced plants showed reduced responses to defence elicitors and increased colonization by pathogens and AMF. This led to the hypothesis that LYK4 perceives LCOs and locally inhibits plant defence during AMF colonization. This strongly suggests that Myc-LCOs are able to regulate plant defence. In conclusion, at least two proteins are involved non-redundantly in LCO perception in Solanaceae, LYK10 and LYK4 and regulates complementary plant machineries required for AMF colonization.

Les champignons endomycorhiziens arbusculaires (MA) forment des relations symbiotiques avec la majorité des espèces végétales terrestres. Leur rôle écologique dans la productivité et la stabilité des agrosystèmes sont connus depuis de nombreuses années. Plusieurs études ont montré que ces symbiotes augmentent la croissance végétale et la résistance des plantes aux stress biotiques et abiotiques. Malgré le potentiel avéré de la symbiose MA pour augmenter durablement la productivité des agrosystèmes dans le cadre d’une agriculture à faibles apports d’intrants, cette biotechnologie est encore sous exploitée. Ce constat résulte essentiellement de difficultés techniques pour produire en quantité un inoculum fongique de qualité et un manque de connaissance concernant les facteurs biologiques régulant la réceptivité des sols à l’inoculation des champignons MA. Les principaux objectifs de ces travaux sont d’optimiser les performances d’un inoculum MA. (1), en associant le champignon MA avec des bactéries PGPR ou MHB. Cette stratégie vise à promouvoir l’établissement et le fonctionnement de la symbiose MA. En effet, ces bactéries bénéfiques aux plantes peuvent augmenter la croissance végétale, directement en fournissant à la plante des composés bénéfique (phytohormone, etc), et indirectement en réduisant ou prévenant les effets délétères de phytopathogènes ou en augmentant l’établissement de la symbiose MA. (2), par la gestion des cultures, notamment par l’association céréales/légumineuses en culture intercalaire. Les légumineuses sont souvent dépendantes des associations symbiotiques avec les champignons MA, et ceux-ci peuvent participer dans la nutrition azotée et phosphatée de la plante. (3), par l’amendement en composé ou organique. Ces amendements peuvent être solubilisés et dégradés par des bactéries et ainsi promouvoir la nutrition végétale sans augmenter la disponibilité de P et N dans le sol. (4), en développant des inocula complexes associant bactéries bénéfiques, champignons MA et amendement, l’ensemble contenu dans un gel d’alginate. / Arbuscular Mycorrhizal fungi (AM) are ubiquitous microorganisms forming symbiotic relationships with the majority of terrestrial plant species. Their ecological functions in the productivity and stability of agroecosystems have been recognized for many years. Many studies have shown that these symbionts improved plant growth and plant resistance to biotic and abiotic stresses. Despite the proven potential of mycorrhizal symbiosis to sustainably improve the productivity of agroecosystems under low input agriculture, this biotechnology is still under exploited. This failure mainly results from technical difficulties to mass-produced fungal inoculum of high quality and a lack of knowledge about the biological factors regulating the soil receptivity of AM inoculation. The main objectives of our studies are to optimize the performance of an AM fungal inoculum. (1), by combining the AM fungus with Plant Growth Promoting Rhizobacteria, or Mycorrhizal Helper Bacteria. This strategy aims to promote the establishment and the functioning of the mycorrhizal symbiosis. Indeed, this plant beneficial bacteria may affect plant growth through two different pathways, directly by providing to the plant some beneficial compounds (i.e. phytohormones, etc), indirectly, by reducing or preventing the deleterious effects of phytopathogens or by improving the establishment of the mycorrhizal symbiosis. (2), by plant management with the association of cereal/leguminous in intercropping. Leguminous are often dependent of AM association and AM fungi may participate to promote N and P plant uptake. (3), by amendment of mineral or organic compounds. These amendments can be degraded slowly by bacteria and promote plant nutrition without increase P and N soil availability. (4), by development of complex inocula associating beneficial bacteria, AM fungi and amendment, based on the entrapment of these inocula in alginate gels