Les flavonoïdes sont des substances naturelles connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires, anti-cancéreuses ou anti-virales chez l'homme. Chez les végétaux, ils participent notamment à leur protection vis-à-vis d'organismes pathogènes. La voie de biosynthèse des flavonoïdes est l'une des plus étudiées chez les plantes et notamment chez la vigne : Vitis vinifera. Cependant, la ou les enzymes impliquées dans les dernières étapes de biosynthèse conduisant aux anthocyanes et aux proanthocyanidines restent, à ce jour, peu ou pas connues. L’étude que nous proposons a pour but de concevoir des sondes moléculaires d’affinité susceptibles d’interagir avec une ou plusieurs enzymes impliquées dans ces dernières étapes de biosynthèse. Ces sondes, basées sur la technologie émergeante de protéomique chimique : « Activity- and affininity Based Protein Profiling » (ABPP), ont été validées à l’aide d’une enzyme modèle : la leucoanthocyanidine dioxygénase (LDOX). Elles ont ensuite été appliquées à des extraits complexes de protéines issus de Vitis vinifera. / Flavonoids are natural substances known for their anti-inflammatory, anti-cancerous and anti-virals properties in humans. In plants, they are one of the molecules responsible for fighting pathogens. The flavonoid biosynthesis pathway as been greatly studied in plants, especially in that of the grapevine: Vitis vinifera. However, detailed studies of the exact function of the enzymes involved in the last steps of the biosynthesis of anthocyanins and proanthocyanidins remains largely lacking.The study that we propose is to synthesize molecular probes designed to specifically interact with enzymes involved in the last stages of flavonoids biosynthesis. Our probes, based on the emerging chemical proteomic technology, activity- and affinity based protein profiling (ABPP), were validated with a model enzyme: leucoanthocyanidin dioxygenase (LDOX). After which, they were used with complex protein mixtures from Vitis vinifera.

Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse. / Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22733号 / 医博第4651号 / 新制||医||1046(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 萩原 正敏, 教授 岩田 想, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

La tuberculose reste l'une des maladies les plus meurtrières dans le monde et de nouvelles stratégies sont urgemment demandées pour combattre Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent éthiologique de la maladie. Les lipides jouent un rôle important dans le cycle de vie de la bactérie et sont largement présents dans sa membrane et son cytoplasme, où ils peuvent servir en tant que sources de carbone et d'énergie pour favoriser la pathogénicité et la survie pendant les phases d'infection et de persistance. Dans ce contexte, les rôles des enzymes lipolytiques restent mal définis et demandent à être davantage caractérisés. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée à l'étude des douze enzymes de Mtb homologues à la lipase hormono-sensible humaine. Les effets du MmPPOX, un composé oxadiazolone très sélectif de cette famille de protéines, ont été évalués sur les enzymes recombinantes et directement in vivo sur Mtb et M. bovis BCG. Cet inhibiteur a démontré une activité antimycobactérienne, suggérant des rôles métaboliques importants pour ces enzymes. La seconde partie de ce travail a été consacrée à l'étude des mécanismes physico-chimiques dont dépendent fortement les inhibitions des lipases et des carboxylestérases in vivo, comme la présence de substrats et/ou de détergents. La spectrométrie de masse a également été introduite en tant qu'outil rapide et puissant pour caractériser les adduits [enzyme-inhibiteur]. Enfin, nous avons développé une approche de chimie protéomique pour capturer sélectivement des hydrolases à sérine à partir de milieux biologiques complexes. / Tuberculosis remains one of the deadliest diseases in the world and new strategies are urgently needed to combat Mycobacterium tuberculosis (Mtb), its etiologic agent. Lipids play an important part in the lifetime of the bacterium, as they are widely present in the membrane and stored in the cytoplasm, where they could be used as carbon and energy sources to promote pathogenicity and survival during infection and persistence. In this context, roles of lipolytic enzymes are still poorly understood and remain to be characterized. The first part of my work was devoted to the study of twelve Mtb enzymes homologous to the human hormone-sensitive lipase. Effects of MmPPOX, an oxadiazolone compound highly selective for this family of proteins, were investigated using recombinant enzymes and directly tested in vivo using Mtb and M. bovis BCG. This inhibitor demonstrated antimycobacterial activities, suggesting important metabolic roles for these enzymes. The second part of this work was devoted to the study of physico-chemical mechanisms on which lipase and carboxylesterase inhibition could strongly depend in vivo, like presence of substrates and/or detergents. Mass spectrometry was also introduced as a direct and powerful tool to characterize [enzyme-inhibitor] adducts. Finally, we developed chemical proteomics approaches to specifically capture serine hydrolases from complex biological media. We aimed to synthesize a grafted alkylphosphonate inhibitor on a solid support by assaying several grafting strategies and matrices of various chemical natures.

Unter den Techniken der chemischen Proteomik hat Capture Compound – Massenspektrometrie (CCMS) den Vorteil, Interaktionen von Molekülen mit geringer Affinität zueinander effektiv untersuchen zu können. CCMS beruht auf kleinen molekularen Sonden (Capture Compounds, CCs), die aus drei funktionalen Bestandteilen bestehen: die Selektivitätsfunktion, ist ein kleines Molekül, das mit einem Zielprotein eine schwache Wechselwirkung eingeht. Die zweite Funktionalität erlaubt kovalente Anhaftung der molekularen Sonde an Proteine. Der dritte Anteil erlaubt Detektion mit sehr guten Sensitivität; allerdings ist die Quantifizierung weiterhin ein Schwachpunkt dieser Technik. Ziel dieses Projektes ist, eine in CCMS verwendbare Quantifizierungsmethode zu entwickeln. Heutzutage gibt es zahlreiche MS-basierte Quantifizierungsstrategien; unsere beruht auf der Einführung von Lanthanoid-haltigen Labels – Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT). In dieser Arbeit wurde erstmalig die erfolgreiche Verwendung mit Metall- Markern chemoproteomischer Sonden (CCs) zur Detektion und absoluten Quantifizierung von Zielproteinen mit schwacher Wechselwirkung etabliert. Mit den Experimenten an isolierten Enzymen und an lebenden Zellen wurde nachgewiesen, dass Metall-Marker keinen negativen Einfluss auf andere funktionelle Teile chemoproteomischer Sonden haben. CCs, die mit Lanthanoid-Chelaten funktionalisiert sind, zeigen ähnliche Affinität zu ihren Zielproteinen wie die Referenz-Sonden. Zudem erlauben Metall-Marker, die für diese Art molekularer Sonden verwendet werden, die Entwicklung einer element-basierten Technik zur Bilderzeugung. Der herausragende Vorteil der Metall-funktionalisierten CCs kombiniert mit ICP-MS ist, dass diese eine absolute Quantifizierung der Ausbeute der Quervernetzungen ermöglichen. / Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a chemical proteomics technique that has the advantage of addressing low abundant target proteins in lysates as well as in living cells. The CCMS is based on small molecule probes (capture compounds) that consist of three functionalities: a small molecule (quite often it is a drug), which interacts with the target protein; the moiety that allows covalent attachment of the molecular probe to the protein; the one that allows detection. The detection moiety utilized for CCMS can offer high sensitivity; however, the challenge of absolute quantification is still a bottleneck of this technique. Metal Coded Affinity Tagging (MeCAT) is a quantitative approach based on the chemical labeling with lanthanide; it allows obtaining both the structural and quantitative information. In this work for the first time the successful utilization of chemoproteomic probes functionalized with a metal tag for the detection and absolute quantification of target proteins was established. With the experiments both on isolated enzymes and living cells it was determined that MeCAT does not negatively influence other functional parts of the probes; therefore, capture compounds functionalized with lanthanide chelates demonstrate similar affinity to the target as the reference probes. Moreover, metal tags utilized for this type of molecular probes can offer a promising elemental imaging technique. However, to achieve the sufficient resolution multiple metal tags per molecular probe are needed. The striking advantage of the approach of utilization metal functionalized capture compound combined with ICP-MS detection is that it allows absolute quantification of crosslink yield, what cannot be performed with other detection methods applied for this technology.

Les polyphénols sont des métabolites secondaires d’origine végétale. Ces substances naturelles connues pour leurs pouvoirs antioxydants et anti-radicalaires, contribuent à la protection de la santé humaine notamment contre les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, mais également contre certains cancers et diabètes. Dans certains cas, ces effets biologiques bénéfiques pour la santé pourraient également être liés à une interaction spécifique polyphénol-protéine peu étudiée à ce jour par manque d’outils moléculaires adaptés. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont consisté à concevoir, à synthétiser et à évaluer des sondes moléculaires polyvalentes porteuses de polyphénols comme substrats d’affinité pour l’analyse des interactions polyphénol-protéine. Dans ce contexte, de nombreuses sondes arborant différents types de polyphénols ont été synthétisées. Ces différentes sondes pourront être utilisées en protéomique chimique du type "Affinity-Based Protein Profiling" (ABPP) pour identifier au sein d’un mélange complexe de protéines, une protéine ayant une affinité spécifique pour un polyphénol donné. Ces mêmes sondes permettront également d’étudier de manière qualitative les interactions d’un polyphénol avec une protéine donnée en temps réel par la technique de résonance plasmonique de surface (SPR). / Polyphenols are plant secondary metabolites. These natural substances, known for their antioxidant and anti-free radical properties, generally contribute to the protection of human health not only against cardiovascular and neurodegenerative diseases, but also against certain cancers and diabetes. In some cases, these beneficial biological effects could also be related to specific polyphenol-protein interactions. However, studying this type of interactions has suffered from the lack of adequate molecular tools. The work carried out during this thesis has included designing, synthesizing and evaluating modulable polyfunctional molecular probes carrying polyphenols as affinity substrates to analyze polyphenol-protein interactions. In this context, various probes harboring different kinds of polyphenols were synthesized. These probes could be used in chemical proteomics following an “Affinity-Based Protein Profiling” approach (ABPP) to identify a protein within complex protein mixtures, which has a specific affinity with a given polyphenol. These probes will also allow studying the interactions of a polyphenol with a given protein in real time in a qualitative way by surface plasmon resonance (SPR).

<p>A significant development in mass spectrometry instrumentation and software in the past decade has led to its application in solving complex biological problems. One of the emerging areas is Chemical Proteomics that involves design and use of chemical reagents to probe protein functions in ‘a live cell’ environment. Another aspect of Chemical Proteomics is the identification of target proteins of a drug or small molecule. This is assisted by photoreactive groups, which on exposure to UV light, covalently link the target proteins that can be purified by affinity-based enrichment followed by mass-spectrometric identification. This phenomenon of Photoaffinity labeling (PAL) has been widely used in a broad range of applications. Herein, we have designed chemical tools to study Zika endocytosis and phosphoproteomics.</p> <p>Zika virus has attracted the interest of researchers globally, following its outbreak in 2016. While a significant development has been made in understanding the structure and pathogenesis, the actual mechanism of Zika entry into host cells is largely unknown. We designed a chemical probe to tag the live virus, leading to the identification of the virus receptors and other host factors involved in viral entry. We further validated neural cell adhesion molecule (NCAM1) as a host protein involved in early phase entry of Zika virus into Vero cells.</p> <p>The second aspect is the development of the DIGE (Difference Gel Electrophoresis) technology for phosphoproteomics. Phosphoproteins are known to be involved in various signaling pathways and implicated in multiple diseased states. We designed chemical reagents composed of titanium (IV) ion, diazirine and a fluorophore, to covalently label the phosphoproteins. Cyanine3 and cyanine5 fluorophores were employed to reveal the difference in phosphorylation between samples for the comparative proteomics. Thus far, we have successfully demonstrated the labeling of standard phosphoproteins in both simple and complex protein mixtures, and the future efforts are towards applying the technology to identify phosphoproteins in a cell lysate.</p>