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CRISPR/Cas is the prokaryotic adaptive immune response to viral invasion. Its mechanism is reminiscent of the eukaryotic RNA interference. The host actively incorporates short sequences from invading genetic elements (viruses or plasmids) into a region of its genome that is characterized by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and a number of CRISPR-associated (cas) genes. The molecular memory of previous infections can be transcribed and processed into small RNAs (crRNAs) that guide a multiprotein–nucleic acid interference complex to recognize and cleave incoming foreign genetic material. Three pathways (I, II, III) are defined by their protein machinery and target specificity (DNA vs. RNA). In types I and III, the main protagonist of the interference complex is the Cas7 protein. Up to six copies of Cas7 constitute the complex’s main building block that assembles around the crRNA and provides a platform for protein interactions and target binding. During my PhD work, I solved the crystal structures of two Cas7 orthologs from different archaeal species, at 1.8 Å for Thermofilum pendens (Tp) Csc2 and at 2.37 Å for Meth- anopyrus kandleri (Mk) Csm3. The crystal structures of Mk Csm3 and Tp Csc2 were solved by experimental phasing and revealed a core RRM-like domain with a β1-α1-β2-β3-α2-β4 arrangement of secondary structure elements. The core is flanked by three peripheral domains that are defined by insertions within the core. Structural superposition of the RRM-like core domains of Mk Csm3 and Tp Csc2 with the representatives of other Cas families (5/6/7) revealed the highest homology beyond the RRM with a Cas7 family homolog. Thus I showed that Cas7 family proteins share equivalent insertions, forming homologous peripheral domains. Using the information obtained from structural data, I investigated the RNA binding properties Mk Csm3, Tp Csc2 and a Cas7 protein from subtype I-A, Thermoproteus tenax (Tt) Csa2. All orthologs bound RNA in a sequence-independent manner, according to their physiological function of spacer binding. Furthermore, a combined approach consisting of mutation analysis, UV-based protein–RNA crosslinking, mass spectrometry and fluorescence anisotropy mapped the RNA interacting regions to two structurally highly conserved positively charged surfaces. Taken together, this thesis describes a comprehensive structural study of the Cas7 family, defining the family’s structural features. These structural data from single proteins and the mapped RNA binding interfaces agree with protein–RNA interactions observed in the Escherichia coli interference complex.

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Themenschwerpunkte. Ein supramolekulares Projekt beinhaltete die Entwicklung von neuen flexiblen, selbst-aggregierenden Zwitterionen als Bausteine für supramolekulare Polymere. In einem zweiten bioorganischem Teil bestand das Ziel darin, Rezeptoren für Aminosäuren und Dipeptide in Wasser zu entwickeln. Beide Projekte basieren auf dem Guanidiniocarbonylpyrrol als effizientes Bindungsmotiv für die Komplexierung von Carboxylaten in wässrigen Lösungen. Eine notwendige Voraussetzung für die Realisierung dieser Projekte war jedoch zunächst die Entwicklung einer allgemeinen, effizienten und milden Synthese für Guanidiniocarbonylpyrrole. Die bei der zuvor verwendeten Methode aggressiven Reaktionsbedingungen und die problematische Aufreinigung verhinderten eine größere Anwendung dieses Bindungsmotivs in bioorganischen und supramolekularen Projekten. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mir erfolgreich eine neue Syntheseroute zu entwickeln. Hierbei wurde mono-tBoc-Guanidine mit dem Benzylester mittels PyBOP gekuppelt und nach Entschützung der Benzylschutzgruppe wurde die zentrale Zwischenstufe für die weiteren Synthesen, die tBoc-geschützte Guanidinocarbonylpyrrol-Säure erhalten. Durch diese neuartige Synthese war es möglich, eine Reihe von flexiblen Zwitterionen 3-6 herzustellen und deren Selbst-Aggregation und den Einfluß der Kettenlänge und somit Flexibilität der Alkylkette auf Struktur und Stabilität der gebildeten Aggregate in Lösung sowie auch in der Gasphase zu untersuchen. In DMSO deuten NMR-Verdünnungsreihen darauf hin, dass die flexiblen Zwitterionen mit n = 1, 3 und 5 oligomere Strukturen ausbilden. Im Falle von n = 1 werden hoch stabile helicale und Nanometer große Aggregate in der gebildet. In den Gasphasen-Studien wurde die Stabilität und Zerfallskinetik einer Reihe von Natriumaddukten der Dimere von n = 2, 3 und 5 untersucht. Dieses gelang durch die Methode der „infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry“ (IRMPD-FT-ICR MS). Solche Studien ermöglichen möglicherweise in Zukunft das gezielte Design von supramolekularen Bausteinen. Der bioorganische Teil meiner Arbeit setzte sich aus drei Einzelprojekten zusammen. So synthetisierte ich durch eine fünfstufige Synthesesequenz vier neue Arginin-Analoga, die in Zukunft als Ersatz für Arginin in Peptide eingebaut werden können. Als Testreaktion für die Eignung dieser Verbindungen in einer Festphasenpeptidsynthese, wurde ein Tripetid Ala-AA1-Val (AA: Arginin-Analogon) mit einem eingebauten Arginin-Analogon erfolgreich hergestellt. In einem zweiten Projekt habe ich den Einfluß einer zusätzlichen ionischen Wechselwirkung in unserem Bindungsmotiv untersucht. Dazu wurde ein zweifach-kationischer Rezeptor und der dreifach-geladenen Rezeptor synthetisiert und physikalisch-organisch ihre Bindungseigenschaften mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten gegen eine Reihe von Aminosäuren untersucht. Der dreifach-kationische Rezeptor 11 zeigte hierbei herausragende Bindungseigenschaften und war um ca. den Faktor 100 besser als für die bisher bekannten Guanidiniocarbonylpyrrole. Die Assoziationskonstanten waren auch fast reinem Wasser mit bis zu Kass = 2000 noch bemerkenswert hoch. Im dritten Projekt habe ich einen de-novo entwickelten Rezeptor für C-terminale Dipeptide in einer beta-Faltblatt Struktur entwickelt.Dieser Rezeptor wurde mittels NMR and UV-Titrationen untersucht. In 40 % Wasser/ 60 % DMSO waren die Bindungskonstanten zu hoch um überhaupt quantifiziert zu werden. Deshalb wurden die Bindungseigenschaften des Rezeptors mittels UV Titrationen in einer Mischung aus 90 % Wasser mit 10 % DMSO gegen eine Reihe von Dipeptiden und Aminosäuren getestet. Die Bindungsdaten zeigen, dass Rezeptor Dipeptide mit ausgezeichneten Bindungskonstanten (Kass > 10000 M-1) komplexiert. Im Gegensatz dazu bindet der Rezeptor 12 Aminosäuren um den Faktor zehn schlechter (Kass > 1000 M-1). Die Komplexstabilität nimmt hierbei in Abhängigkeit von der Seitenkette des Dipeptids in der Reihe Gly < Ala < Val zu, was sich mit der abnehmenden Flexibilität und zunehmenden Hydrophobizität der Seitenkette erklären lässt. Diese Eigenschaften machen den Rezeptor 12 zu dem besten bisher bekannten Dipeptidrezeptor in wässrigen Lösungen. Innerhalb meiner Arbeit gelang es mir somit, nicht nur eine essentiell wichtige, milde und effiziente Synthese für Guanidinocarbonylpyrrole zu entwickeln, sondern es gelang mir ebenso ein neues Bindungsmotiv für die Komplexierung von Aminosäuren in Wasser zu entwickeln. Zusätzlich konnte noch der Dipeptidrezeptor erfolgreich synthetisiert und untersucht werden. Mit Bindungskonstanten für von Kass > 10000 M-1 ist er der derzeit beste Dipeptidrezeptor in wässriger Lösung. / The present thesis encompasses two parts. The first supramolecular part focuses on the development of new flexible self-assembling zwitterions as building blocks for supramolecular polymers. In the second part, the aim was to develop bioorganic receptors for amino acids and dipeptides in aqueous media. Both research projects are based on the guanidiniocarbonyl pyrrole 1 as a new efficient binding motif for the complexation of carboxylates in polar solution.A necessary requirement for the realization of these research projects was to develop an efficient and mild synthetic approach for the cationic guanidiniocarbonyl pyrroles in general. The harsh reaction conditions of the previously used method and the problematic purification of the cationic guanidinocarbonyl pyrroles so far prevented a more extensive exploration in bioorganic and supramolecular research. In the course of this work I successfully developed a new synthesis starting with mono tBoc-protected guanidine that was coupled with a benzyl protected pyrrole carboxylic acid. After deprotection of the benzyl group, a key intermediate in the newly developed synthesis, the tBoc-protected guanidinocarbonyl pyrrole acid, was obtained. This new, mild and extremely efficient synthetic approach for the introduction of acyl guanidines is now the standard procedure in our group for the preparation of both solution and solid-phase guanidiniocarbonyl pyrroles. With this facile method at hand, a new class of flexible zwitterions, in which a carboxylate is linked via an alkyl chain to a guanidiniocarbonyl pyrrole cation was synthesized. The self-aggregation and the influence of the length and therefore flexibility of the alkyl spacer on the structure and stability of the formed aggregates were studied in solution and gas phase. In solution the aggregation was studied by NMR-dilution experiments in DMSO which suggest that flexible zwitterions with n = 1, 3 and 5 form oligomers. For n = 1, highly stable helical aggregates with nanometer size are formed. In the gas phase studies the stability and the fragmentation kinetics of a series of sodiated dimeric zwitterions with n = 2, 3 and 5 were investigated. This was done by infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (IRMPD-FT-ICR-MS). These kinds of studies can be used in the future for a more directed design of supramolecular building blocks The bioorganic research part comprises three different projects. In a first project I synthesized four new arginine analogues which can be implemented in peptides as a substitute for arginine. Therefore, I developed the new multi-step synthesis shown below for these arginine analogues. As a test for their application in normal solid phase synthesis, I successfully prepared a tripeptide sequence Ala-AA1-Val (AA: arginine analogue. In a second project I studied the influence of additional ionic interactions within our binding motif. I synthesized a di-cationic and a tris-cationic receptor and evaluated the binding properties via NMR titration experiments against a variety of amino acids. Especially, the tris-cationic receptor was capable to strongly complex amino acids. The association constants were about a factor of 100 higher than those for the guanidiniocarbonyl pyrroles known so far. Even in 90 %water/10 % DMSO the association constants determined by NMR titration were extremely high with values around Kass = 2000 M-1. In the third project I developed a de-novo designed receptor for C-terminal dipeptides in a beta-sheet conformation based on molecular calculations. This receptor was studied in NMR and also UV titration experiments. In 40 % water/ 60 % DMSO the association constants were too strong to be measured by NMR titration experiments. Therefore, the complexation properties of 12 were studied by UV titration in water (with 10 % DMSO added for solubility reasons) with various dipeptides and amino acids as substrates. The data show that 12 binds dipeptides very efficiently even in water with association constants Kass > 10000 M-1, making 12 one of the most effective dipeptide receptors known so far. In contrast to that, simple amino acids are bound up to ten times less efficiently (Kass > 1000 M-1) than dipeptides. In the series of dipeptides studied the complex stability increases depending on the side chains present in the order Gly < Ala < Val which is a result of the decreasing flexibility of the peptide and the increasing hydrophobicity of the side chains. The binding properties of this receptor are superior to any other dipeptide receptor reported so far. Within my thesis I have not only developed an essential, mild and efficient synthetic approach for guanidiniocarbonyl pyrroles in general, but also a new binding motif for the complexation of amino acids 15, 11 and in addition a dipeptide receptor 12 that is superior to all dipeptides receptors known so far.

In the context of quantum mechanical calculations, the properties of non-adiabatic coupling in a small system, the Shin-Metiu model, is investigated. The transition from adiabatic to non-adiabatic dynamics is elucidated in modifying the electron-nuclear interaction. This allows the comparison of weakly correlated electron-nuclear motion with the case where the strong correlations determine the dynamics. The studies of the model are extended to include spectroscopical transitions being present in two-dimensional and degenerate four-wave mixing spectroscopy. Furthermore, the quantum and classical time-evolution of the coupled motion in the complete electron-nuclear phase space is compared for the two coupling cases. Additionally, the numerically exact electron flux within the weak coupling case is compared to the Born-Oppenheimer treatment. In the last part of the thesis, the model is extended to two dimensions. The system then possesses potential energy surfaces which exhibit a typical 'Mexican hat'-like structure and a conical intersection in the adiabatic representation. Thus, it is possible to map properties of the system onto a vibronic coupling (Jahn-Teller) hamiltonian. Exact wave-packet propagations as well as nuclear wave-packet dynamics in the adiabatic and diabatic representation are performed. / Im Rahmen quantenmechanischer Rechnungen werden die Eigenschaften nicht-adiabatischer Kopplungen in einem kleinen Modellsystem, dem Shin-Metiu Modell, untersucht. Die Fallunterscheidung zwischen adiabatischen und nicht-adiabatischen Prozessen wird durch eine Parameterisierung der Elektronen-Kernwechselwirkung realisiert. Dies ermöglicht den Vergleich zwischen korrelierter und unkorrelierter Elektronen-Kernbewegung. Innerhalb dieser zwei Extrema werden die Eigenfunktionen betrachtet und der Einfluss nicht-adiabtischer Kopplungen auf diese analysiert. Es wird gezeigt, dass im Fall einer schwachen Kopplung die Eigenfunktionen als adiabatisches Produkt dargestellt werden können, soweit die adiabatischen elektronischen Eigenfunktionen voneinander entkoppelt sind und unterschiedlichen elektronischen Charakter besitzen. Auf der anderen Seite sind die adiabatischen elektronischen Eigenfunktionen und die Vibrationseigenfunktionen im Bereich einer starken Kopplung miteinander gekoppelt, und es zeigt sich, dass die Eigenfunktionen in der diabatischen Darstellung eine zur adiabatischen äquivalente, aber intuitivere Beschreibung darstellen. Anhand dieser Ergebnisse wird eine Diabatisierung und ein Vergleich zwischen exakter Elektronen-Kernpropagation und der Propagation im diabatischen Bild durchgeführt. Dieser Vergleich ist in sehr guter Übereinstimmung und zeigt, dass der Ansatz der Diabatisierung für unkorrelierte Elektronen-Kernbewegungen hinreichend ist und gleichzeitig klassifiziert er die Wellepacket-dynamik im Bereich starker Kopplungen als diabatisch. Die theoretischen Untersuchungen des eindimensionalen Modells werden auf spektroskopische Übergänge erweitert, welche lineare und nichtlineare System-Feld Wechselwirkungen beinhalten. Ein Vergleich zwischen zweidimensionalen Spektren bezüglich schwach und stark gekoppelter Elektronen-Kern Dynamik zeigt, dass im Fall schwacher Kopplungen, die Spektren durch analoge Rechnungen im Rahmen der Born-Oppenheimer Näherung reproduzierbar sind. Es zeigt sich, dass diejenigen Teile des Spektrums, welche auf gleiche Weise nicht reproduzierbar sind, elektronisch gemischten Zuständen, aufgrund starker nicht-adiabtischer Kopplungen, zuzuordnen sind. Die Möglichkeit, das System zwischen schwacher und starker Kopplung zu variieren, erlaubt es Vibrationskohärenzen und elektronischen Kohärenzen in zweidimensionalen Spektren zu analysieren. Dazu werden die zweidimensionalen Spektren als Funktion der Populationszeit betrachtet. Es ergibt sich, dass im Fall schwacher Kopplungen die Kohärenzen während der Populationszeit Vibrationskohärenzen zugeordnet werden können. Im Gegensatz dazu ergeben sich im Bereich starker Kopplungen, aufgrund des gemischten elektronischen Charakters der Zustände, Kohärenzen vibronischer Art. Als weitere Methode wird die Degenerierte-Vier-Wellen-Mischen Spektroskopie (FWM) untersucht. Diese ist in der Lage Grundzustandsdynamiken und Dynamiken im angeregten Zustand separat zu verfolgen. Sowohl für negative als auch für positive Verzögerungszeiten werden die zwei verschiedenen Kopplungsszenarien untersucht und der Zusammenbruch dieser Methode bezüglich der nicht möglichen Trennung der Grundzustandsdynamik und Dynamik im angeregten Zustand innerhalb der adiabatischen Beschreibung betrachtet. Als weiterer Aspekt, wird die quantenmechanische und klassische Zeitentwicklung der gekoppelten Elektronen-Kernbewegung im vollständigen Phasenraum für verschiedene Kopplungsstärken verglichen. Im Fall schwacher Kopplung stimmt im Kurzzeitverhalten die klassische Berechung mit der quantenmechanischen gut überein. Dies kann auch im Fall starker Kopplungen gezeigt werden, was die weitere Schlussfolgerung zulässt, dass die Dynamik im Bereich starker Kopplungen hauptsächlich in einem diabatischen Zustand stattfindet. Das zeigt, dass die klassische Bewegung sehr ähnlich zu der diabatischen quantenmechanischen Bewegung verläuft. Als Konsequenz reproduziert eine klassische Bewegung im vollständigen Phasenraum eine quantenmechanische, bei der nicht-adiabatische Kopplungen stark involviert sind. Als letzte Betrachtung des eindimensionalen Shin-Metiu Modells, wird der Elektronenfluss im schwach gekoppelten Fall untersucht und der numerisch exakt berechnete Fluss mit dem in der Born-Oppenheimer Näherung verglichen. Innerhalb der üblichen Definition verschwindet der Elektronenfluss im Rahmen der Born-Oppenheimer Näherung. Durch die Verwendung der Kontinuitätsgleichung für den Elektronenfluss ergibt sich jedoch ein nicht-verschwindender Elektronenfluss. Weiter wurde ein Reflektionsprinzip hergeleitet, welches den Elektronenfluss auf den Kernfluss abbildet und umgekehrt. Zum Abschluss der Untersuchungen des eindimensionalen Shin-Metiu Modells wird das System auf zwei Dimensionen erweitert. Dabei zeigt sich, dass die adiabatischen Potentialflächen des Modells eine typische 'Mexican-hat' Topologie aufweist. Daraus ergibt sich, dass es möglich ist das System auf einen vibronischen (Jahn-Teller) Hamiltonian zurückzuführen. Im Zuge dessen wird das zweidimensionale System hinsichtlich der exakten Elektronen-Kerndynamik, sowie der Dynamik in den adiabatischen und diabatischen Anschauungen betrachtet. Die durchgeführten Rechnungen zeigen, dass das Passieren eines Wellenpaketes durch eine Konische Durchschneidung als eine diabatische Dynamik klassifiziert werden kann, wobei ein effizienter adiabatischer Populations-transfer stattfindet. Dieser Prozess kann sehr gut im diabatischen Bild reproduziert werden. Des Weiteren wird eine Wellenpaketdynamik um eine Konische Durchschneidung herum betrachtet und als adiabatische Dynamik klassifiziert. Der interessante Aspekt der geometrischen Phase, die mit dem Umrunden einer Konischen Durchschneidung assoziiert ist, wird mit der Rotation der elektronischen Wellenfunktion verknüpft. Zusätzlich wird hier das Auftreten der geometrische Phase in Autokorrelationsfunktionen und den daraus abgeleiteten Spektren charakterisiert. Die geometrische Phase wird zusätzlich als Mischungswinkel der Transformation zwischen dem diabatischen und adiabatischen Bild explizit berechnet. Zusammenfassend zeigen die Rechnugen an den verwendeten Modellsystemen viele fundamentale Aspekte der korrelierten Elektronen-Kerndynamik, obwohl sie auf lediglich zwei Partikel begrenzt sind.

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