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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24752号 / 生博第493号 / 新制||生||66(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 福澤 秀哉, 教授 河内 孝之, 教授 中野 雄司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

La micro-algue verte Chlamydomonas reinhardtii est considérée comme un modèle dans l’étude du stress métallique chez les organismes photosynthétiques. Les mécanismes de tolérance au stress induit par le cadmium ne sont pas encore clairement établis. Afin de déterminer ces mécanismes, la localisation subcellulaire et la spéciation chimique in situ du cadmium ont été déterminées chez trois souches de C. reinhardtii exposées au cadmium en condition mixotrophe (CO2 + Acétate) : (i) une souche de type sauvage (wt), (ii) la souche cell-wall less (cw15) qui est déficiente en paroi cellulaire, (iii) la souche pcs1 qui surexprime la phytochélatine synthase (PCS), enzyme ordinairement cytosolique, directement dans son chloroplaste. Pour ce faire, la toxicité du cadmium a été déterminée en mesurant la croissance ainsi que la teneur en chlorophylle et en amidon des micro-algues. Puis, la localisation du cadmium au niveau subcellulaire a été réalisée par trois techniques complémentaires (fractionnement subcellulaire, µXRF, TEM/X-EDS). La spéciation chimique in situ du cadmium a été effectuée par µXAS et XAS. Enfin, l’imagerie élémentaire et isotopique par nanoSIMS a permis de compléter les distributions élémentaires dans la cellule et de déterminer l’impact du cadmium sur les mécanismes d’assimilation du carbone. (i) Les résultats de ce travail montrent que la souche wt est la plus sensible au cadmium des trois avec une diminution de la croissance et de la teneur en chlorophylle. Lorsqu’elle ne présente pas ces signes de toxicité, le cadmium est séquestré dans l’ensemble de la cellule par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. Suite à l’exposition à de fortes concentrations en cadmium, le cadmium intracellulaire est lié majoritairement à des ligands carboxylés probablement induits par le stress oxydatif. De plus, la présence du cadmium dans le pyrénoïde bloque l’assimilation du carbone inorganique (CO2), au profit de l’assimilation du carbone organique (acétate), qui est stocké sous forme d’amidon. (ii) La surexpression de la PCS de la souche pcs1 provoque une production d’amidon importante autour du pyrénoïde et protège la chlorophylle du stress lié au cadmium. Bien que la synthèse de phytochélatines soit potentiellement élevée, la moitié du cadmium intracellulaire est séquestrée par les granules de polyphosphates et l’amidon. (iii) La souche cw15 est la plus tolérante des trois souches et n’accumule pas la totalité du cadmium disponible, contrairement aux cellules possédant une paroi cellulaire. Similairement au wt, le cadmium intracellulaire est séquestré majoritairement par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. L’observation de granules de polyphosphates excrétées par les micro-algues permet l’hypothèse de l’excrétion du cadmium vacuolaire induisant un flux constant de cadmium à travers la cellule. En conclusion, la séquestration du cadmium via des ligands soufre, potentiellement par des polypeptides thiolés, est le mécanisme de tolérance majoritaire mis en place par C. reinhardtii. Néanmoins, la séquestration du cadmium par les granules de polyphosphates semble apporter une plus grande tolérance vis-à-vis du stress lié au cadmium. / The green micro-alga Chlamydomonas reinhardtii is commonly used as a model for the study of the metallic stress in photosynthetic organisms. Tolerance mechanisms against stress induced by cadmium are not well understood. In order to determine these mechanisms, subcellular location and in situ speciation have been determined in three C. reinhardtii strains exposed to cadmium in mixotrophic conditions (CO2 + Acetate) : (i) a wild type strain (wt), (ii) a cell-wall less strain (cw15) which is deficient in cell-wall, (iii) the pcs1 strain which overexpresses the cytosolic enzyme phytochetlatin synthase (PCS) directly in the chloroplast. Cadmium toxicity has been determined by the monitoring of growth and chlorophyll, starch content in micro-algae. Then, cadmium location at subcellular level has been performed using three complementary techniques (subcellular fractionation, µXRF and TEM/X-EDS). In situ cadmium speciation has been studied by µXAS and XAS. Finally, elemental and isotopic imaging by nanoSIMS has allowed to complete elemental distribution in the cells and to determine the impact of cadmium on the assimilation of carbon. (i) The results of this work show that the wt strain is the most sensitive strain to cadmium stress among the three studied strains with a growth and chlorophyll content decrease. When wt cells do not show signs of toxicity, cadmium is mainly sequestered in the whole cell by thiolated ligands and in polyphosphate granules. After an exposure to high concentration of cadmium, intracellular cadmium is mainly bound to carboxylated ligands, probably induced by oxidative stress. Moreover, cadmium located in the pyrenoid blocks inorganic carbon (CO2) assimilation and increases organic carbon (acetate) assimilation which is stored as starch. (ii) The overexpresssion of PCS in the pcs1 strain induces a strong production of starch around the pyrenoid and proctects the chlorophyll against cadmium stress. Although the synthesis of phytocheltins was potentially strong, half of the intracellular cadmium is sequestered in polyphosphate granules and in starch. (iii) Unlike cell-walled cells, the cw15 strain is the most tolerant strain and does not accumulate the totality of available cadmium. Similarly to wt strain, intracellular cadmium is mainly sequestered by thiolated ligands and in polyphosphate granules. The observation of polyphosphate granules excreted by the micro-algae allows the hypothesis of the excretion of vacuolar cadmium, inducing a constant flux of cadmium through the cells. In conclusion, cadmium sequestration by sulfur ligands, potentially by thiolated polypeptides, is the main tolerance mechanism implemented by C. renhardtii. However, cadmium sequestration in polyphosphate granules seems to allow a better tolerance against cadmium stress.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser. Includes bibliographical references.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

L'électrocoagulation (EC) est une méthode électrochimique non spécifique couramment utilisée pour le traitement de l'eau et des eaux usées. Dans ce travail, l’EC est d'abord étudiée comme une technique classique de traitement des eaux usées dédiée à l'élimination des protéines de lactosérum de l'eau pour laquelle les mécanismes d'élimination sont expliqués et un modèle est développé. Ensuite, l'utilisation de l’EC est étendue à la séparation et à la purification d’acides gras volatils issus de la fermentation acidogénique. Dans cette deuxième étude, les effets des paramètres opératoires sur l'efficacité et le coût de l’EC sont discutés. En outre, l’EC est utilisée pour la récolte de deux espèces de microalgues de leur milieu de culture. En ce qui concerne la récolte de Chlamydomonas reinhardtii, la méthodologie de la surface de réponse est utilisée et deux modèles permettant de prédire respectivement l'efficacité de la récupération et le coût opératoire sont développés. La récolte d’une autre espèce de microalgues, Chlorella vulgaris, est étudiée en utilisant l’EC respectivement en mode discontinu et continu. En mode discontinu, les effets des principaux paramètres de fonctionnement sur l'efficacité du processus sont expliqués et les mécanismes de récupération sont discutés. Dans l'étude en mode continu, la méthodologie de la surface de réponse est utilisée et un modèle permettant de prédire l’efficacité de récupération des microalgues est développé. Enfin, la comparaison des performances de l'EC en mode continu avec et sans échange de polarité aux performances de l'EC en mode discontinu est effectuée. / Electrocoagulation (EC) is a non-specific electrochemical method usually used for water and wastewater treatment. In this work, EC is firstly investigated as a conventional wastewater treatment technique for the removal of whey proteins from water, where the mechanisms of removal are explained and a model on whey proteins elimination is developed. Then, EC use is extended for the separation and purification of volatile fatty acids issued from acidogenic fermentation. In this second study, the effects of operating parameters on EC efficiency and cost are discussed. Moreover, EC is used for the harvesting of two microalgae species from their culture medium. In the study that concerns recovering Chlamydomonas reinhardtii, response surface methodology (RSM) is employed and two models for predicting recovery efficiency and operating cost are developed. The harvesting of the other microalgae species Chlorella vulgaris is studied using EC in the batch and continuous modes. In the batch mode, the effects of the main operating parameters on the process effectiveness are explained along with discussing the mechanisms of recovery. In the continuous mode study, response surface methodology (RSM) is applied and a model for predicting microalgae recovery is developed. Finally, comparison of EC performance in continuous mode with and without polarity exchange (PE) to EC performance in batch mode is carried out.

Les nanoparticules (NPs) d'Ag sont très utilisées dans le secteur de la santé, dans l'industrie alimentaire et dans les produits de consommation pour leurs propriétés antimicrobiennes. Le grand rapport surface sur volume des NPs d'Ag permet une augmentation importante du relargage d'Ag comparé au matériau massif et donc une toxicité accrue vis à vis des micro-organismes sensibles à cet élément. Ce travail de thèse présente une évaluation des propriétés antimicrobiennes de petites NPs d'Ag (<20 nm) enrobées dans des matrices de silice sur la photosynthèse d'algues vertes. Deux techniques d'élaboration par voie physique ont été utilisées pour fabriquer ces nanocomposites: (i) l'implantation ionique à basse énergie et (ii) la pulvérisation d'Ag couplée avec la polymérisation plasma. Les propriétés structurales et optiques de ces nanostructures ont été étudiées par microscopie électronique à transmission, réflectivité et ellipsométrie. Cette dernière technique, couplée à un modèle basé sur l'approximation quasi-statique de type Maxwell-Garnett, a permis la détection de petites variations dans la taille et la densité des NPs d'Ag. Le relargage d'argent de ces NPs d'Ag enrobées dans des diélectriques a été mesuré par spectrométrie de masse après immersion dans de l'eau tamponnée. La toxicité à court terme de l'Ag sur la photosynthèse d'algues vertes, Chlamydomonas reinhardtii, a été évaluée par fluorométrie. L'enrobage des nanoparticules dans un diélectrique réduit leur interaction avec l'environnement, et les protège d'une oxydation rapide. La libération d'Ag bio-disponible (impactant sur la photosynthèse des algues) est contrôlée par la profondeur à laquelle se trouvent les NPs d'Ag dans la matrice hôte de silice. Cette étude permet d'envisager le design de revêtements à effet biocide contrôlé. En couplant les propriétés antimicrobiennes de ces NPs d'Ag enrobées à leur qualité d'antenne plasmonique, ces nanocomposites peuvent être utilisés pour détecter et prévenir les premières étapes de la formation de biofilms sur des surfaces. Ainsi, une dernière partie de ce travail est dédiée à l'étude de la stabilité et de l'adsorption de protéines fluorescentes Discosoma rouges recombinantes (DsRed) sur ces surfaces diélectriques avec la perspective du développement de dispositifs SERS. / Silver nanoparticles (AgNPs) because of their strong biocide activity are widely used in health-care sector, food industry and various consumer products. Their huge surface-volume ratio enhances the silver release compared to the bulk material, leading to an increased toxicity for microorganisms sensitive to this element. This work presents an assessment of the biocide properties on algal photosynthesis of small (<20 nm) AgNPs embedded in silica layers. Two physical approaches were used to elaborate these nanocomposites: (i) low energy ion beam synthesis and (ii) combined silver sputtering and plasma polymerization. These techniques allow elaboration of a single layer of AgNPs embedded in silica films at defined nanometer distances (from 0 to 7 nm) beneath the free surface. The structural and optical properties of the nanocomposites were studied by transmission electron microscopy, reflectance spectroscopy and ellipsometry. This last technique, coupled to modelling based on the quasi-static approximation of the classical Maxwell-Garnett formalism, allowed detection of small variations over the size and density of the embedded AgNPs. The silver release from the nanostructures after immersion in buffered water was measured by inductively coupled plasma mass spectrometry. The short-term toxicity of Ag to the photosynthesis of green algae, Chlamydomonas reinhardtii, was assessed by fluorometry. Embedding AgNPs reduces their interactions with the buffered water, protecting the AgNPs from fast oxidation. The release of bio-available silver (impacting on the algal photosynthesis) is controlled by the depth at which AgNPs are located for the given host silica matrix. This provides a procedure to tailor the biocide effect of nanocomposites containing AgNPs. By coupling the controlled antimicrobial properties of the embedded AgNPs and their quality as plasmonic antenna, these coatings can be used to detect and prevent the first stages of biofilm formation. Hence, the last part of this work is dedicated to a study of the structural stability and adsorption properties of Discosoma recombinant red (DsRed) fluorescent proteins deposited on these dielectric surfaces with perspectives of development of SERS devices.