Next generation sequencing based methods allow us to identify active genes and potential regulatory elements rapidly across the genome, but an outstanding challenge is to unravel which regulatory elements control which genes. This is problematic because regulatory elements control genes over huge distances (over 1 million base pairs) and they have an unpredictable distribution around the genes they influence. In order to enhance transcription the protein complexes at distal regulatory elements make physical contact with the promoter. These interactions can be detected using Chromosome Conformation Capture (3C) technology and the position of regulatory elements can be deduced from these data. However, these methods are either low throughput or low resolution and they are prone to bias. In this 3C techniques were specifically developed to determine the interactions between regulatory elements and gene promoters promoter. The focus has been the development of Next Generation Capture-C, which allows many genetic loci and samples to be analysed simultaneously, with greater sensitivity and accuracy than has previously been possible. High resolution data can be produced from as few as 100,000 cells, and single-nucleotide polymorphisms can be used to generate allele-specific tracks. Nanostring technology has also been developed for analysis of 3C libraries, as this allows interaction profiles to be determined without PCR or sequencing bias. The Nanostring data show remarkable correlation with the interaction profiles generated by NG Capture-C.

No description available.

Veränderungen in der lokalen Chromatinstruktur beeinflussen die dynamische Regulation von Genen, welche für die Differenzierung notwendig sind. PU.1 ist ein Master-Transkriptionsfaktor in der Hämatopoese und wird streng reguliert, um ein zelllinienspezifisches Expressionsmuster zu erzielen. Hohe Konzentrationen von PU.1 sind für myeloische Differenzierung erforderlich. In B-Zellen wird PU.1 mittelstark exprimiert und muss aktiv runterreguliert werden, um eine Ausdifferenzierung der multipotenten Vorläuferzellen zu T-Zellen zu ermöglichen. Derzeit ist wenig über die Regulierung von PU.1 in T-Zellen bekannt. Darüber hinaus wurde eine abnormale Expression von PU.1 in verschiedenen Leukämieerkrankungen beobachtet. Mittels eines genome-wide Chromatin-Interaktions-Screens konnten wir einen cis-Repressor mit insulierender Kapazität identifizieren, welcher mittels eines Chromatinloops die Promotoraktivität von PU.1 in T-Zellen, jedoch nicht in myeloischen oder B-Zellen blockiert. Sowie Looping als auch Insulation erfordern die Bindung des Chromatin-Regulatorprotein CTCF. Im Gegensatz zu normalen myeloischen Zellen finden wir, dass Krebszellen aus myeloischen Leukämie Patienten diese T-Zell-spezifische repressive Chromatinstruktur aufweisen, was einen räumlichen Kontakt des Insulator mit dem PU.1 Promotor ermöglicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschrieben das CTCF gesteuerte „long distance looping“ als ein neuer molekularer epigenetischer Mechanismus, um Transkriptionsfaktor PU.1 in T-Zellen runterzuregulieren, und zeigen zum ersten mal, dass Krebszellen die Chromatinstruktur anderer Zelllinien imitieren können, um die Expression von Differenzierungsgenen zu blockieren. / Alterations in the local chromatin structure orchestrate the dynamic regulation of differentiation promoting genes. PU.1 is a master transcription factor in hematopoiesis. PU.1 gene must be tightly regulated to achieve lineage specific expression pattern. High levels of PU.1 are required for myeloid commitment: it is expressed at intermediate level in B-cells and must be actively silenced to permit T cell development from early multipotent progenitors. However, little is known of how PU.1 is regulated in T-cells. Moreover, aberrant PU.1 expressions have been observed in multiple leukemias. Using a genome-wide chromatin interaction screen we identified a cis-repressor with insulating capacity that undergoes long-distant chromatin looping to block PU.1 promoter activity in T cells but not myeloid or B cells. Looping and repression requires binding of the chromatin regulator protein CTCF. In contrast to normal myeloid cells, we found that cancer cells from myeloid leukemia patients adopt the T cell specific repressive chromatin structure bringing the insulator into spatial contact with the PU.1 promoter. These results identify CTCF controlled long-distant insulator looping as a novel mechanism to silence lineage-opposing transcription factor expression, and reveal that cancer cells can mimic the chromatin confirmation of another lineage to block expression of differentiation driving genes.

Die räumliche Organisation des Chromatins im Zellkern ist für die Regulierung der Genexpression von großer Bedeutung. Genomische Varianten können die räumliche Organisation jedoch stören und Fehlbildungen und Krankheiten verursachen. In diploiden Genomen sind die meisten genomischen Varianten heterozygot und beeinflussen hauptsächlich das homologe Chromosom, auf dem sie sich befinden. Daher ist eine allelspezifische Analyse wichtig, erweist sich aber mit aktuellen Methoden zur Erfassung der Chromatinkonformation als äußerst schwierig. Erstens ist der Haplotyp, der die Verteilung unterschiedlicher Allele über die homologen Chromosomen beschreibt, oft unbekannt. Zweitens ist, insbesondere in Genomen mit geringer Variantendichte, wie dem menschlichen Genom, eine eindeutige Zuordnung der sequenzierten Genomabschnitte (Reads) zu ihrem Ursprungschromosom häufig nicht möglich, was die Erstellung haplotypspezifischer Chromatinkontaktmatrizen von guter Qualität verhindert. Genome Architecture Mapping (GAM) ist eine vielversprechende neue Methode mit dem Potential zur haplotypspezifischen Analyse der Chromatinkonformation. In dieser Dissertation zeige ich zunächst, dass GAM-Daten wertvolle Haplotypinformationen enthalten. Dann stelle ich GAMIBHEAR vor, einen graphenbasierten Ansatz, der die von GAM-Daten abgeleiteten Phaseninformationen nutzt, um genaue und vollständige Haplotypen zu rekonstruieren. Schließlich stelle ich Co-Phasing vor, eine neue Read-Phasing-Strategie, die erstmalig die eindeutige Zuordnung von variantenfreien Reads zu ihrem homologen Ursprungschromosom ermöglicht und somit auch die Erstellung detaillierter haplotypspezifischer Chromatinkontaktmatrizen in Maus und Mensch. Im Gegensatz zu früheren Erkenntnissen belegen meine Ergebnisse große Unterschiede in der räumlichen Organisation homologer Chromosomenkopien und ermöglichen erstmals einen sehr detaillierten Einblick in die haplotypspezifische Chromatinkonformation des menschlichen Genoms. / The spatial organization of chromatin in the nucleus plays an essential role in precise gene expression. Genomic variants can disrupt this spatial organization, potentially causing malformations and diseases. In diploid genomes, most genomic variants are heterozygous and mainly influence the homologous chromosome they reside on. Studying the effects of these variants in an allele-specific manner is crucial but has proven challenging using current state-of-the-art techniques. First, the haplotype describing the distribution of variant alleles over the homologous chromosomes is often unknown. Second, especially in genomes with a low variant density, such as the human genome, most sequencing reads map to genomic regions that are identical between homologous chromosomes, making it difficult to determine their origin. Thus, the read-phasing efficiency is insufficient to generate haplotype-specific chromatin contact matrices of good quality. Genome Architecture Mapping (GAM) is a promising new method for haplotype-specific analysis of chromatin conformation. In this thesis, I first demonstrate the ability of GAM data to provide valuable haplotype information. Then, I introduce GAMIBHEAR, a graph-based approach that leverages the GAM-derived phase information to infer accurate and complete haplotypes. Finally, building on GAMIBHEAR, I present Co-Phasing, a novel read-phasing strategy that allows for the unique assignment of variant-free reads to their homologous chromosome of origin and thus enables the creation of detailed haplotype-specific chromatin contact matrices in mouse and human. In contrast to previous findings, my results show significant differences in the spatial organization of homologous chromosomes and provide the first detailed view of haplotype-specific chromatin conformation in the human genome.

No description available.