La séparation et la purification de biomolécules à partir de milieux bruts, végétaux ou biologiques, est un sujet vaste etcomplexe. De sa compréhension et de son développement dépendent des enjeux industriels, et notamment le completdéveloppement des procédés biotechnologiques, les procédés de séparation, ou downstream processes, constituant environ 80% des coûts totaux de ces procédés. Ce travail se veut une contribution à ces problématiques. Il a été motivé par des résultatsobtenus au préalable dans le laboratoire qui montraient qu’il est possible de récupérer une protéine de très grande taille àpartir d’un milieu réel végétal par l’application d’une seule opération chromatographique (Kerfai, 2011). Suite à ce résultat,des hypothèses ont été énoncées, auxquelles ce travail essaie de répondre : quel(s) mécanisme(s) peuvent expliquer cerésultat ? Existe-t-il une localisation spécifique pour la fixation de la molécule sur l’échangeur d’ions qui rend plus simple etefficace sa récupération lors de l’étape d’élution ? Ainsi, notre objectif a été de progresser dans la connaissance des aspectsfondamentaux de la chromatographie d’échange d’ions appliquée à la séparation des protéines à partir d’un milieu brut.Notamment, l’influence de la présence d’autres protéines dans le milieu a été analysée, et ce dans le cas particulier deprotéines de poids moléculaire très différents, comme c’était le cas dans le travail précédemment cité. Des approches variées,théoriques et expérimentales à différentes échelles sur des milieux réels ou synthétiques, ont été appliquées et parfoisdéveloppées, pour essayer de répondre à ces questions. A l’échelle du procédé, une méthode statistique d’analyse desdonnées (Analyse en Composantes Principales ou ACP) a été menée, dont l’exploitation reste délicate. A l’échelle dulaboratoire, l’étude de l’équilibre et de la cinétique d’échange d’ions a été menée sur des solutions synthétiques de deuxprotéines : la sérum albumine bovine (BSA) (en tant que protéine de référence, couramment étudiée) et la ferritine (protéinede stockage du fer) de point isoélectrique proche de celui de la BSA mais de masse molaire plus élevée. Les résultatsmontrent que des modèles relativement classiques peuvent être appliqués, y compris pour les protéines de très grandes tailles,pour expliquer les aspects cinétiques de l’échange. Le couplage des flux de matière des protéines à l’intérieur des particulesde l’échangeur est très probable, malgré des diffusivités très différentes. Interpréter les résultats d’équilibre reste bien plusardu. La concentration en sel ou la présence de la BSA n’ont que très peu d’effet sur la rétention de la ferritine à l’équilibre.En revanche, la présence de la ferritine affecte très fortement la rétention de la BSA (pourtant plus favorable). Parmi lesphénomènes suggérés dans la littérature, l’effet Vroman a été recherché, mais il n’a pas été constaté dans le système pour lesconditions de travail utilisées. Les isothermes d’adsorption en conditions compétitives n’ont pas pu être simulées par lesmodèles habituels (comme l’isotherme multi-constituants de Langmuir), alors que celles des protéines seules sont tout à faitclassiques. En outre, un blocage partiel des pores de la résine par la ferritine reste probable, empêchant la diffusion de laBSA. Afin de vérifier ce dernier point, une méthodologie a été développée afin d’observer à l’échelle microscopique lesprofils de concentration des éléments représentatifs du système (P, Fe, Cl…) dans les particules. Cette méthode qui se trouveà un stade très avancé de développement, n’a pas encore permis de conclure faute de sensibilité suffisante des sondes àdisposition. / Bioseparations from crude media, vegetable or biological, is a large and complex subject. Future industrial issues depend ontheir understanding and development, namely for biotechnological processes as downstream processes represent up to 80 %of their total cost. This work hopes to contribute to these general questions. It is justified by previous results obtained in thelaboratory showing that it is possible to recover a high molecular weight (HMW) protein from a complex vegetal juice in justone chromatographic operation. Hypotheses have been formulated, to which this work tries to answer: what mechanism couldexplain this behaviour? Is-there a specific location inside particles for the uptake of such protein, facilitating the recoveryduring elution step? Our objective has been to progress on the knowledge of fundamental questions concerning ion-exchangechromatography and their applications for proteins recovery from complex media. The effect of the other proteins in solutionhas been analysed, specifically in the situation where both proteins have a very different molecular weight, as in the previouscited work. Theoretical and experimental approaches, at various scales, have been applied or developed on real or syntheticsystems in order to answer some of these questions. At the process scale, a statistical method for data analysis (PrincipalComponent Analysis or PCA) has been applied. The complete interpretation of its results remains very hard. At thelaboratory scale, equilibrium and kinetics of ion exchange have been studied for synthetic solutions of two proteins: bovineserum albumin (BSA) (as reference protein widely studied), and ferritin (iron storage protein) having similar isoelectric pointas BSA but with higher molecular weight. Classical models for ion-exchange kinetics can explain the experimental results,even for HMW proteins. Mass transfer fluxes seem to be coupled for both proteins, even if they have usually very differentdiffusivities. The interpretation of equilibrium results is much more difficult. Equilibrium uptake of ferritin is not, or lightly,influenced by salt concentration or BSA content. Nevertheless, the presence of ferritin in the medium affects strongly BSAequilibrium uptake (however more favourable). Among the phenomena suggested in the literature, the Vroman effect hasbeen researched but it does not take place under the experimental conditions applied. Simulation of multi-componentisotherms has not been possible by classical models (such as multi-component Langmuir isotherm), while protein isothermsin single solution are standard. Besides, a partial blockage of the resin pores by ferritin is possible, preventing BSA diffusion.Therefore, a methodology has been developed at the microscopic scale, with the aim to observe concentration profiles forrepresentatives elements (P, Fe, Cl …) inside particles. The method, well developed, does not allow to conclude for themoment, because the probes used were not sensible enough.

Ce travail étudie l'intérêt de l'ajout d'hydrolysats de levure dans un procédé de culture de cellules CHO productrices d'anticorps en vue, d'une part, de déterminer leur condition d'utilisation et leur rôle, et, d'autre part, de caractériser les composés actifs. Pour répondre à ces objectifs, une démarche intégrant des études cinétiques, des stratégies de fractionnement et l'analyse biochimique des hydrolysats et de leurs fractions a été développée. En premier lieu, il a été montré que les hydrolysats de levure présentent des effets significatifs sur les cultures selon leur composition et les conditions d'ajout. De même, des effets synergiques ont été mis en évidence par le mélange d'hydrolysats générés à partir de différents procédés. D'autre part, des études cinétiques ont permis de corréler l'influence positive des hydrolysats sur la croissance cellulaire à l'amélioration du métabolisme énergétique. Dans un deuxième temps, la nature biochimique et le rôle des composés actifs ont été étudiés par la mise en oeuvre d'un procédé de nanofiltration membranaire et la reconstitution de mélanges de molécules contenues dans un extrait de levure (EXL). Ces résultats ont mis en évidence l'intérêt des di- et tri-peptides pour approvisionner le métabolisme énergétique et de molécules non nutritives, de poids moléculaire supérieur à 500 Da, pour stimuler la vitesse spécifique de croissance des cellules. Finalement, le rétentat issu de la nanofiltration de l'EXL a été fractionné à l'aide de divers procédés chromatographiques, unitaires ou associés, pour caractériser les propriétés physico-chimiques des composés actifs. L'effet des fractions sur la culture de cellules a alors souligné l'intérêt des molécules chargées positivement, et plus particulièrement, des peptides hydrophiles et cationiques pour stimuler la croissance des cellules. Ainsi, nos travaux permettent de mieux appréhender les mécanismes d'action des hydrolysats de levure sur les cellules CHO productrices d'anticorps et proposent des voies d'optimisation pour la simplification d'additifs complexes dans les milieux de culture dédiés à la culture de cellules animales / This work studies the interest of the addition of yeast hydrolysates in culture medium of CHO cell producing antibody, to determine the operating conditions and their role, but also to improve the characterization of active compounds. In this way, an integrated approach including kinetic studies, fractionation strategies and biochemical analysis of hydrolysates and of their fractions was developed. First, we showed that yeast hydrolysates exhibited various properties depending on their composition and the operating conditions. In addition, synergistic effects were observed with different hydrolysate mixtures. Besides, kinetic studies underlined that the positive influence of hydrolysates on cell growth is correlated with energetic metabolism improvement. Then, the biochemical nature and the role of active compounds were studied by the implementation of a nanofiltration process and the reconstitution of mixtures of molecules contained in a yeast extract (YE). The results highlighted the interest of di- and tri-peptides to supply energetic metabolism, and of non-nutritive molecules, exhibiting a molecular weight greater than 500 Da, to stimulate the specific cell growth rate. Finally, the retentate fraction of nanofiltrated YE was fractionated by various chromatographic processes to characterize the physico-chemical properties of active compounds. The effect of fractions on cell culture emphasized the positive effect of positively charged molecules, especially hydrophilic and cationic peptides, to stimulate the cell growth. Thus, our work provides important insights in yeast hydrolysate mechanisms on CHO cells and suggests procedures to simplify such a complex additive of media dedicated to mammalian cell culture

Les milieux biologiques bruts, provenant des opérations de transformation de biomasse sont souvent caractérisés à la fois par leur caractère polluant et par un potentiel de valorisation important. Le développement de procédés adaptés au traitement de tels milieux complexes présente ainsi beaucoup d’intérêt. Les jus verts générés par la déshydratation de la luzerne (Medicago Sativa) sont caractérisés par une forte teneur en protéines. Outre leur valeur nutritionnelle importante, ces protéines ont des applications potentielles dans plusieurs domaines, notamment environnemental de part leur teneur élevée en Ribulose 1,5 Bisphosphate Carboxylase Oxydase (Rubisco), enzyme responsable de la fixation du CO2 chez les plantes. Dans ce travail la séparation sélective de la Rubisco à partir du jus de luzerne industriel centrifugé par chromatographie d’échange d’ions a été étudiée. Dans un premier temps une méthode d’analyse qualitative et quantitative a été mise au point pour la détection et la quantification de la Rubisco en solution et ainsi le suivi du procédé de séparation. Dans un deuxième temps, le procédé de séparation a été étudié en colonne, en lit fixe et en lit expansé, en utilisant le support échangeur d’anions Q Hyper Z et l’effet de la dilution du milieu sur la capacité dynamique du procédé a été analysé dans les deux cas. Les résultats obtenus ont montré que les deux modes de contact permettent d’avoir des capacités dynamiques de rétention du même ordre de grandeur que celles de la littérature. Après élution, la Rubisco a été concentrée jusqu’à 21 fois et les fractions produites étaient caractérisées par un grand degré de pureté. Par ailleurs, des études d’équilibre et cinétique d’échange ont été initiées dans ce travail et ont démontré que malgré la taille importante de la protéine d’intérêt (560 kDa) les limitations stériques à son transfert ne sont pas plus importantes que dans le cas de protéines plus simples et plus petites et que le support Q Hyper Z présente effectivement une grande affinité pour la protéine. Enfin une première approche théorique a été conduite pour la compréhension des interactions entre la protéine et l’échangeur dans ce milieu complexe. Elle a permis de confirmer l’importance de la prise en compte de la présence d’autres biomolécules dans le milieu sur la rétention de la Rubisco, peut être même plus que celle des sels / Biological raw material derived from bio-refinery processes, is often considered a source of pollution but it seems also to be a promising alternative to potential material recovery. The development of suitable processes for handling such complex biological material has so many concerns. Green juice produced from mechanical dehydration of Alfalfa (Medicago sativa) is an excellent source of protein with high nutritional quality. Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (Rubisco) is the most abundant protein in the green juice, with potential applications in many fields, such as human nutrition, pharmaceuticals, environmental… The aim of this study is to isolate and recover Rubisco produced from an industrial alfalfa green juice, by ion exchange chromatography process. First of all, a qualitative and quantitative analytical method was developed to provide reliable information about Rubisco content monitoring in the separation process. In a second step, the separation process was performed in fixed and expanded bed, using the anion exchanger Q Hyper Z. In both cases, the effect of the dilution of the green juice on the dynamic capacity of the columns was studied. The results showed that the dynamic capacity retention was similar in both columns to those reported in literature. After elution step, Rubisco was concentrated 21 times and produced with high level of purity. Furthermore, kinetic of ion exchange study was initiated. Despite the large size of the protein (560 kDa), steric limitations to mass transfer were not very significant when compared to those of conventional small proteins. The support Q Hyper Z showed an excellent affinity for the protein recovery. Finally, a first theoretical investigation has been conducted for understanding the retention mechanism between the protein and the separation column. This study shows the importance of taking into account the presence of other bio-molecules in order to perform the retention of Rubisco, perhaps even more than that of salts