La chromatographie bidimensionnelle préparative suscite de plus en plus d'intérêt dans l'élucidation d'échantillons complexes car elle permet de collecter un grand nombre de molécules à haute pureté et quantitée récupérée. Bien que la chromatographie liquide (LC) soit souvent choisie en deuxième dimension, la chromatographie de partage centrifuge (CPC) à de multiples avantages qui en font une technique de choix pour la première dimension. Dans le but de purifier plusieurs molécules d’intérêt dans les matrices végétales, le couplage «comprehensive» CPCxLC représente une technique à fort potentiel. Après avoir expliqué son intérêt et les enjeux liés à la séparation préparative en mode «comprehensive», le développement d’une telle séparation est étudiée selon trois axes. Tout d’abord, une purification de deux molécules d’intérêt dans la plante Edelweiss est réalisée à l’échelle industrielle grâce à la réalisation de cartographies 2D au laboratoire. Cette application permet de montrer l’intérêt du couplage et de mettre en évidence les verrous liés aux conditions de transfert total des fractions en deuxième dimension. Dans une deuxième partie, la séparation CPCxLC en mode « comprehensive » est développée avec le transfert total de l’échantillon en deuxième dimension pour la purification de cinq composés cibles présents dans la plante Edelweiss. Les points clés de la séparation CPCxLC, à savoir le temps d’échantillonnage et le transfert en deuxième dimension, sont étudiés au regard du couplage LCxLC afin de garantir une qualité de séparation permettant la récupération totale des composés. Enfin, la troisième partie consiste à la mise en place d’une méthodologie de sélection des systèmes CPCxLC basée sur l’évaluation quantitative du potentiel des systèmes bidimensionnels à apporter de la distance entre les pics. Cette procédure de sélection est développée sur l’échantillon Cyclopia genistoides avec l’objectif d’isoler huit composés cibles / Preparative two-dimensional chromatography is gaining interest in the elucidation of complex samples as it allows the collection of a large number of molecules with high recovered purity and quantity. While the second dimension is often selected to be liquid chromatography (LC), centrifugal partition chromatography (CPC) is a technique with multiple advantages representing a suitable first dimension. In order to purify several molecules of interest in plant matrices, the comprehensive CPCxLC represents a technique with high potential. After explaining its interest and the issues related to the preparative separation in comprehensive mode, the development of such a separation is studied according to three axes. Firstly, a purification of two targeted molecules in Edelweiss plant is carried out at industrial scale thanks to the realization of 2D-contour plot. This application allows to expose the interest of the separation and to highlight the locks related to the conditions of total transfer of the fractions in second dimension. In a second part, the comprehensive CPCxLC separation is developed with the total transfer of the sample in second dimension applied to the purification of five target compounds from Edelweiss plant. The key points of the CPCxLC separation, namely the sampling time and the second dimension transfer, are studied with regard to the LCxLC separation in order to ensure a separation quality allowing the total recovery of the compounds. Finally, the third part consists in the implementation of a CPCxLC system selection methodology based on the quantitative evaluation of the potential of two-dimensional systems to generate distance between peaks. This selection procedure is developed on the sample Cyclopia genistoides with the objective of isolating eight target compounds

Les procédés multi-colonnes de chromatographie ont connu depuis quelques années un développement tel qu'ils sont devenus des standards industriels à toutes échelles, depuis celle des produits pharmaceutiques à haute valeur ajoutée jusqu'à celle des grands intermédiaires chimiques. La spécificité du présent travail consiste à étudier, pour ces procédés, l'influence d'un gradient d'élution. Il s'agit de faire varier au cours du temps la force éluante de la phase mobile. L'objectif est d'augmenter la productivité et le taux de récupération d'un produit à haute valeur ajoutée, tout en répondant à des contraintes de pureté. L'utilisation d'un gradient de solvant, courante en chromatographie analytique, fait l'objet d'un intérêt plus récent en chromatographie préparative. Les applications visées concernent des séparations de mélanges complexes où l'espèce cible a une affinité intermédiaire pour le support solide par rapport à celle des autres espèces, ce qui est souvent le cas lors de la purification de biomolécules issues de matières premières naturelles ou issues des biotechnologies. Dans ce cas, la séparation conduit à trois fractions, des impuretés faiblement retenues, la fraction intermédiaire et des impuretés fortement retenues. Pour notre étude, un mélange modèle, peu coûteux et non toxique, de cinq acides aminés a été choisi. Ces acides aminés ont été choisis en tenant compte de leur caractère apolaire et hydrophobe. Les séparations ont été réalisées par chromatographie en phase inverse. Dans un premier temps, une étude expérimentale, réalisée à l'aide d'une chaîne HPLC, a permis de déterminer les paramètres des isothermes d'adsorption de chaque acide aminé pour différentes teneurs en solvant organique de l'éluant. Une loi empirique a permis de relier le facteur de rétention k à la composition de la phase mobile (K = f (xméthanol)). Un travail de modélisation/simulation, reposant sur l'approche d'une cascade de mélangeurs, a ensuite permis de simuler les séparations obtenues dans le cas d'une seule colonne, puis dans le cas d'un système multi-colonnes. L'utilisation des lois reliant les facteurs de rétention k à la concentration en modifieur a alors permis de réaliser des simulations pour différents gradients de solvants. Dans le cas d'une seule colonne, le gradient a été optimisé en minimisant la durée de la séparation et en respectant une contrainte sur la résolution des pics des 2 espèces les plus difficiles à séparer. Une bonne adéquation a été observée entre les simulations et les résultats expérimentaux obtenus avec un gradient sur une seule colonne. Des expérimentations numériques ont alors été réalisées dans le cas du système multi-colonnes. Les paramètres opératoires optimaux ont été déterminés dans le cas du mélange étudié. Ces réglages seront ainsi utilisés lors de la validation expérimentale qui sera réalisée sur l'unité pilote. Cette unité comporte trois colonnes. Il s'agit d'un procédé séquentiel cyclique. Pour le mode opératoire retenu, chaque cycle comporte 8 étapes. A chaque étape les alimentations et soutirages des différentes colonnes sont modifiées. Pour le soutirage qui correspond à la fraction de l'espèce cible, les critères étudiés seront la pureté et le taux de récupération / Multi-column chromatographic processes have known, for a few years, a development on all scales, from high added value pharmaceutical products to major chemical intermediates. The specificity of the present work is to study the influence of a gradient elution for these processes. It consists in varying the eluent strength of the mobile phase over the time. The aim is to increase the productivity and the recovery ratio of a high added value product, while satisfying the constraints of purity. Solvent gradient is currently used in analytical chromatography and presents a recent interest in preparative chromatography. The applications concern separations of complex mixtures where the target species has an intermediate affinity for the solid phase compared to other species, which is often the case during the purification of biomolecules extracted from natural raw materials or resulting from biotechnologies. In this case, separation leads to three fractions, impurities weakly retained, an intermediate fraction and impurities strongly retained. For our study, a model mixture, inexpensive and nontoxic, of five amino acids was selected considering their nonpolar and hydrophobic character. The separations were carried out by reversed phase chromatography. An experimental study using a HPLC system was first carried out with single-element solution of each amino acid in isocratic mode. This enabled to determine adsorption isotherm parameters. An empirical law giving the retention factor as a function of eluent composition was determined (K = f (xmethanol)). A work of modeling / simulation, assuming linear isotherm and based on the mixed cells approach, permitted to simulate the separations obtained in the case of a one-column process, then in the case of a multi-column system. The use of retention factors laws allowed to carry out simulations for different solvent gradients. In the case of a single column, a simple methodology was developed to calculate the optimal solvent gradient. The gradient was optimized by minimizing the separation time and by respecting a constraint on the peaks resolution of the two species which are the most difficult to separate. A really good adequacy was observed between simulations and the experimental results. Numerical experimentations, executed in the case of the multi-columns process, made it possible, yet, to find the optimal operating parameters in the case of the studied mixture. These settings will be applied in the experimental validation which will be realized on the pilot unit. This unit has three columns. It is a cyclic sequential process. For the selected operating mode, each cycle contains eight steps. At each step, inlets ant outlets streams of different columns are switched. The criteria for the target species fraction are purity and recovery

La chromatographie à contre courant (CCC) est une technique de purification chimique préparative quitravaille avec un système biphasique liquide. Une phase est la phase mobile, l'autre phase est la phasestationnaire. Il n'y a aucun support solide: un champ de force centrifuge est utilisé pour maintenir en place laphase stationnaire. Ce travail est une contribution à l'étude de la purification préparative par CCC. Après uneimportante étude bibliographique des procédés de purification en continu tant en CCC qu'autres, il est montréque la méthode dite "multi-dual-mode", ou MDM, est une solution possible. Elle consiste à utiliser le fait queles deux phases liquides peuvent servir de phase stationnaire: il suffit d'inverser le sens de circulation et lanature de la phase mobile (méthode dual-mode). Le mélange est séparé de façon classique pendant untemps chronométré, puis on inverse le rôle des phases: la phase mobile devient stationnaire et vice versa eton inverse également le sens de circulation (ascendant devient descendant ou vice versa). On sort lescomposants du mélange soit d'un coté de la colonne CCC, soit de l'autre. La méthode est mise en oeuvrepour purifier le Bleu de Coomassie en le débarassant des ses composés polaires (d'un coté) et apolaire (del'autre coté de la colonne et en accumulant dans la colonne la fraction de polarité intermédiaire, fractiond'intérêt. Une nouvelle colonne hydrostatique de petit volume (30 mL) a également été testée: elle permetde tester un nouveau système liquide très rapidement. / Counter-current chromatography (CCC) is a preparative purification technique that works with the twoliquid phases of a biphasic liquid system. One phase is used as the mobile phase when the other phase isused as the stationary phase. There is no solid support: centrifugal fields are used to obtain a support-freeliquid stationary phase. This work contains an exhaustive bibliographic study of what can be found in theliterature concerning continuous chromatographic processes. The multi-dual-mode (MDM) process was foundto be the best one able to purify large amount of crude mixtures. The MDM method starts with a classicalseparation of the mixture followed by a switch of both the liquid phase nature and the flowing direction. Themobile phase flowing e.g. in a descending direction becomes the stationary phase. The previous stationaryphase becomes the mobile phase flowing in the ascending direction (or vice versa). The purified compoundsof the introduced mixture are eluted at one side of the column or the other according to their polarity. TheMDM method was used to purify a crude sample of Coomassie Blue: the polar part of the dye was eluted atthe column top (or head) and the apolar part at the column bottom (or tail) while the essential part of the dyewas trapped inside the CCC column. The work also presents a new small volume (30 mL) hydrostatic CCCcolumn. It is shown that this column could be used to test quickly the potential of a given biphasic liquidsystem.

Les travaux de cette thèse portent sur le développement de nouvelles méthodologies de purification des peptides pharmaceutiques par chromatographie de partage centrifuge (CPC) dans le but de l'introduction de cette technique comme outil de R&D mais surtout de production en milieu industriel. Le caractère original de ces travaux porte essentiellement sur l'introduction de nouveaux systèmes de solvants et la mise au point de nouveaux procédés de purification en mode CPC co-courant. Les différents aspects liés à l'industrialisation des différents procédés de purification ont également été étudiés.La première partie des travaux a consisté en l'étude de quelques nouveaux aspects de l'intérêt de l'application du mode co-courant en chromatographie de partage centrifuge. Une méthodologie originale de purification des peptides tensioactifs non ioniques en mode CPC co-courant a été mise au point. Cette méthodologie a permis de résoudre les problèmes de perturbations hydrodynamiques et de perte de phase stationnaire engendrés par le caractère tensioactif de ces molécules et a été appliquée avec succès à la purification d'une cyclosporine modifiée douée d'une activité anti-virale et faiblement soluble dans les solvants usuellement utilisés en CLHP. Une étude fondamentale de l'effet du peptide sur le comportement hydrodynamique des deux phases lors de la séparation et la visualisation des modèles d'écoulement au sein de la colonne CPC a permis la mise en évidence du role de la ciclosporine modifiée dans la perturbation de la composition des phases du système chromatographique. D'autres aspects de l'intérêt du mode co-courant en CPC ont été étudiés lors de cette étude, notamment l'amélioration de la robustesse et de la résolution de la séparation.La seconde partie des travaux a porté sur le développement de nouveaux systèmes biphasiques de solvants particulièrement adaptés à la purification des peptides hydrophobes non-ioniques, notamment les intermédiaires de synthèse protégés, qui sont très faiblement solubles dans la plupart des solvants communs utilisés en chromatographie. Deux gammes quaternaire et quinaire de systèmes biphasiques de solvants, ainsi qu'un système biphasique ternaire ont été introduits. L'originalité de ces systèmes porte sur l'usage de solvants verts à fort caractère solvatant tel que le Methyl-THF et le cyclopentyl methyl ether (CPME). Les systèmes développés ont été efficacement utilisés pour la purification en CPC d'une exénatide protégée de 39 acides aminés et d'un peptide protégé de 8 acides aminés intermédiaire de la synthèse de la bivalirudine. Ces systèmes devraient être utiles pour une utilisation générale en CPC pour la séparation des peptides synthétiques hydrophobes libres ou protégés. / The work presented in this thesis deals with the development of new methodologies for the purification of pharmaceutical peptides by centrifugal partition chromatography (CPC) in order to introduce this technique as a tool for R & D but also in industrial production. The original character of this work relies on the introduction of new solvent systems and the development of new purification processes based on the co-current CPC mode. The different aspects of the process intensification and industrialization have also been studied.In the first part of the work, a study of some new aspects of the interest of the application of the stationary phase co-current mode in CPC is described. An original method for the purification of non-ionic tensioactive peptides in the co-current CPC mode was developed. This method has been successfully applied to the purification of a modified cyclosporine showing a therapeutic interest. This particular elution mode, taking advantage of the liquid nature of the stationary phase, appears to be an efficient solution to get round some hydrodynamic instabilities that sometimes appears during a purification intensification by CPC. A fundamental study of the effect of the peptide on the hydrodynamic behavior of the two phases in the separation and visualization of flow patterns within the CPC column allowed highlighting the role of the peptide in the disruption of phases composition of the chromatographic system. Other aspects of the interest of the co-current mode in CPC were investigated in this study, including the improvement of the efficiency and the resolution of the separation.The second part of the work focused on the development of new biphasic solvent systems particularly suitable for the purification of hydrophobic non-ionic peptides, including protected intermediates, which are very poorly soluble in the most common solvents used in chromatography. Two new scales of biphasic solvent systems showing a wide range of polarity and a ternary biphasic system were introduced to overcome solubility problems often encountered with synthetic hydrophobic protected peptides. The originality of these systems relies on the use of green solvents with high solvating character such as Methyl-THF and cyclopentyl methyl ether (CPME). The developed systems have been effectively used for the purification in CPC of a 39mer protected exenatide and and a 8mer protected peptide intermediate of bivalirudin synthesis.