Made available in DSpace on 2018-06-27T18:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Claudia Grigolo Pinto.pdf: 1176064 bytes, checksum: 59a91895834e923c2658353b7e595164 (MD5) Claudia Grigolo Pinto.pdf.txt: 107937 bytes, checksum: 1b0f8213d3d5c275ed204303dd4db6c4 (MD5) Claudia Grigolo Pinto.pdf.jpg: 3006 bytes, checksum: 39d1ff3d9bf0d2f9de94bcb4adf42377 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use of nanoparticles as carriers of drugs has been widely studied. These include cyclodextrins (CDs), cyclic oligosaccharides that allow the formation of inclusion complexes with lipohilic substances such as resveratrol (RSV). RSV is a polyphenol with antioxidant characteristics; when consumed, a great part is excreted, while the remainder is quickly metabolized in the body. The anti-inflammatory, antioxidant and preventive of metabolic diseased properties such as diabetes, stimulate the complexation of RSV to the hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD), thus enabling the increase of the bioavailability of an orally RSV. Hyperglycemia, a marker by which diabetes is diagnosed, promotes increased production of species reactive to oxygen by various routes that lead to cell damage and potentially to cell death. The oxidative stress parameters can be determined through certain techniques. The reduction in the amount or in the activity of endogenous antioxidant defenses is and indicative of oxidant injury and may, therefore, is considered as an excellent marker of oxidative stress. In this context, nanotechnology can contribute to the development of new therapeutic approaches for various diseases, including diabetes. The objective of this study is to investigate the in vivo effects of free and complex resveratrol to HP-β-CD on parameters of oxidative stress, based on the measurements of GSH, TBARS, total content of carbonyls, activity of SOD, CAT and GPx enzymes and determination of total protein in the cerebral cortex, liver, kidney and heart of normal and hyperglycemic rats. For this study, 70 male Wistar rats were used, form the vivarium of the Federal University of Santa Maria, randomly divided into five diabetic groups induced by streptozotocin (STZ), and five non-diabetic groups with seven animals per group. The hyperglycemic and normoglycemic groups daily received, through intragastric gavage, the following substances: water (control groups), free RSV in concentration of 1mg/kg (RSV groups), concentration of HP- β-CD equivalent to that present in complex (HP- β-CD groups), RSV complexed to the cyclodextrin at a concentration of 1 mg/kg body weight (complex groups) and a solution of 15% ethanol (ethanol group). After two months of treatment and 12 hours fasting, the animals were killed by decapitation. According to the data obtained, it was found that treatment with HP- β-CD caused a decrease of endogenous antioxidant molecules. When complexed to RSV, this decrease was lower; indicating a protective effect by RSV to the damage caused by the medium, in this case HP- β-CD. In the measurements of TBARS it was observed that there was a decrease in the RSV group and HP- β-CD, indicating a protective behavior to lipid peroxidation. / O emprego de nanopartículas como carreadores de fármacos vem sendo vastamente estudado. Entre elas, estão as ciclodextrinas (CDs), que são oligossacarídeos cíclicos que permitem a formação de complexos de inclusão com substâncias lipofílicas, como o resveratrol (RSV). O RSV é um polifenol com características antioxidantes; quando consumido, há uma grande parte excretada, enquanto o restante é rapidamente metabolizado no organismo. As propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e preventivas de doenças metabólicas, como o diabetes, estimulam a complexação do RSV à hidróxi-propil-beta-ciclodextrina (HP--CD), possibilitando, dessa forma, o aumento da biodisponibilidade do RSV por via oral. A hiperglicemia, marcador por meio do qual se diagnostica o diabetes, promove aumento na produção de espécies reativas de oxigênio por diversas rotas, que levam a lesões celulares e potencialmente à morte celular. Os parâmetros de estresse oxidativo podem ser determinados através de diversas técnicas. A redução da quantidade ou da atividade das defesas antioxidantes endógenas é indicativa de lesão oxidante, podendo, portanto, ser considerada como excelente marcador de estresse oxidativo. Nesse contexto, a nanotecnologia pode contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para diversas doenças, entre elas o diabetes. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito in vivo do resveratrol livre e complexado à HP-β-CD sobre parâmetros do estresse oxidativo, com base nas medidas de Glutationa reduzida (GSH), espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo total de carbonilas, atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e dosagem de proteínas totais, no córtex cerebral, no fígado, nos rins e no coração de ratos normais e hiperglicêmicos. Para este trabalho, foram utilizados 70 ratos Wistar machos, provenientes do biotério da Universidade Federal de Santa Maria, separados aleatoriamente em cinco grupos diabéticos, induzidos por estreptozotocina (STZ) e cinco grupos não diabéticos, com sete animais por grupo. Os grupos normoglicêmicos e hiperglicêmicos receberam diariamente, por gavagem intragástrica, as seguintes substâncias: grupos controles receberam água, os grupos RSV receberam 1mg/kg de massa corporal, os grupos HP-β-CD receberam concentração de HP-β-CD equivalente àquela presente no complexo, os grupos complexo (RCD) receberam 1mg/kg e os grupos etanol (E) receberam solução de etanol a 15%. Os animais foram mortos, após dois meses de tratamento e com 12 horas em jejum, por decapitação, sem anestesia. De acordo com os dados obtidos, concluiu-se que o tratamento com HP-β-CD provocou uma queda das moléculas antioxidantes endógenas. Quando complexada ao RSV, tal queda foi menor, indicando uma proteção exercida pelo RSV ao dano causado pelo veículo, neste caso a HP-β-CD. Nas medidas de TBARS, observou-se que ocorreu uma queda nos grupos RSV e HP-β-CD o que indica um comportamento de proteção à lipoperoxidação.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T18:42:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ClaudiaGrigoloPinto.pdf: 1229176 bytes, checksum: fb57d89db2a6f400f78549c1b5a04a7c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T18:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ClaudiaGrigoloPinto.pdf: 1229176 bytes, checksum: fb57d89db2a6f400f78549c1b5a04a7c (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / The use of nanoparticles as carriers of drugs has been widely studied. These include cyclodextrins (CDs), cyclic oligosaccharides that allow the formation of inclusion complexes with lipohilic substances such as resveratrol (RSV). RSV is a polyphenol with antioxidant characteristics; when consumed, a great part is excreted, while the remainder is quickly metabolized in the body. The anti-inflammatory, antioxidant and preventive of metabolic diseased properties such as diabetes, stimulate the complexation of RSV to the hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP--CD), thus enabling the increase of the bioavailability of an orally RSV. Hyperglycemia, a marker by which diabetes is diagnosed, promotes increased production of species reactive to oxygen by various routes that lead to cell damage and potentially to cell death. The oxidative stress parameters can be determined through certain techniques. The reduction in the amount or in the activity of endogenous antioxidant defenses is and indicative of oxidant injury and may, therefore, is considered as an excellent marker of oxidative stress. In this context, nanotechnology can contribute to the development of new therapeutic approaches for various diseases, including diabetes. The objective of this study is to investigate the in vivo effects of free and complex resveratrol to HP--CD on parameters of oxidative stress, based on the measurements of GSH, TBARS, total content of carbonyls, activity of SOD, CAT and GPx enzymes and determination of total protein in the cerebral cortex, liver, kidney and heart of normal and hyperglycemic rats. For this study, 70 male Wistar rats were used, form the vivarium of the Federal University of Santa Maria, randomly divided into five diabetic groups induced by streptozotocin (STZ), and five non-diabetic groups with seven animals per group. The hyperglycemic and normoglycemic groups daily received, through intragastric gavage, the following substances: water (control groups), free RSV in concentration of 1mg/kg (RSV groups), concentration of HP--CD equivalent to that present in complex (HP--CD groups), RSV complexed to the cyclodextrin at a concentration of 1 mg/kg body weight (complex groups) and a solution of 15% ethanol (ethanol group). After two months of treatment and 12 hours fasting, the animals were killed by decapitation. According to the data obtained, it was found that treatment with HP--CD caused a decrease of endogenous antioxidant molecules. When complexed to RSV, this decrease was lower; indicating a protective effect by RSV to the damage caused by the medium, in this case HP--CD. In the measurements of TBARS it was observed that there was a decrease in the RSV group and HP--CD, indicating a protective behavior to lipid peroxidation. / O emprego de nanopartículas como carreadores de fármacos vem sendo vastamente estudado. Entre elas, estão as ciclodextrinas (CDs), que são oligossacarídeos cíclicos que permitem a formação de complexos de inclusão com substâncias lipofílicas, como o resveratrol (RSV). O RSV é um polifenol com características antioxidantes; quando consumido, há uma grande parte excretada, enquanto o restante é rapidamente metabolizado no organismo. As propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e preventivas de doenças metabólicas, como o diabetes, estimulam a complexação do RSV à hidróxi-propil-beta-ciclodextrina (HP--CD), possibilitando, dessa forma, o aumento da biodisponibilidade do RSV por via oral. A hiperglicemia, marcador por meio do qual se diagnostica o diabetes, promove aumento na produção de espécies reativas de oxigênio por diversas rotas, que levam a lesões celulares e potencialmente à morte celular. Os parâmetros de estresse oxidativo podem ser determinados através de diversas técnicas. A redução da quantidade ou da atividade das defesas antioxidantes endógenas é indicativa de lesão oxidante, podendo, portanto, ser considerada como excelente marcador de estresse oxidativo. Nesse contexto, a nanotecnologia pode contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para diversas doenças, entre elas o diabetes. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito in vivo do resveratrol livre e complexado à HP-β-CD sobre parâmetros do estresse oxidativo, com base nas medidas de Glutationa reduzida (GSH), espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), conteúdo total de carbonilas, atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e dosagem de proteínas totais, no córtex cerebral, no fígado, nos rins e no coração de ratos normais e hiperglicêmicos. Para este trabalho, foram utilizados 70 ratos Wistar machos, provenientes do biotério da Universidade Federal de Santa Maria, separados aleatoriamente em cinco grupos diabéticos, induzidos por estreptozotocina (STZ) e cinco grupos não diabéticos, com sete animais por grupo. Os grupos normoglicêmicos e hiperglicêmicos receberam diariamente, por gavagem intragástrica, as seguintes substâncias: grupos controles receberam água, os grupos RSV receberam 1mg/kg de massa corporal, os grupos HP-β-CD receberam concentração de HP-β-CD equivalente àquela presente no complexo, os grupos complexo (RCD) receberam 1mg/kg e os grupos etanol (E) receberam solução de etanol a 15%. Os animais foram mortos, após dois meses de tratamento e com 12 horas em jejum, por decapitação, sem anestesia. De acordo com os dados obtidos, concluiu-se que o tratamento com HP-β-CD provocou uma queda das moléculas antioxidantes endógenas. Quando complexada ao RSV, tal queda foi menor, indicando uma proteção exercida pelo RSV ao dano causado pelo veículo, neste caso a HP-β-CD. Nas medidas de TBARS, observou-se que ocorreu uma queda nos grupos RSV e HP-β-CD o que indica um comportamento de proteção à lipoperoxidação.

Orientadores: Eneida de Paula, Angelica de Fatima de Assunção Braga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T00:44:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_DanieleRibeirode_D.pdf: 2753467 bytes, checksum: 296240a6f2747532a1c84600d6c877c5 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Dentre os fármacos usados para aliviar ou eliminar a dor, encontram-se os anestésicos locais (AL). Esses compostos, capazes de bloquear a excitação-condução em nervos periféricos, têm duração de ação relativamente curta e toxicidade para os sistemas nervoso central e cardiovascular. Com a finalidade de prolongar a duração de ação e reduzir a toxicidade sistêmica dos AL, pesquisas com diferentes tipos de sistemas carreadores têm sido desenvolvidas. Essas novas formulações, denominadas de liberação lenta, possibilitam a liberação controlada e evitam picos plasmáticos dos AL, prolongando a analgesia e reduzindo sua toxicidade. Neste trabalho objetivamos preparar, caracterizar (quanto a encapsulação ou complexação, estabilidade e liberação da droga) e avaliar in vitro (toxicidade celular) e in vivo, a atividade farmacológica (latência, intensidade, duração de ação e toxicidade local) de novas formulações anestésicas de liberação controlada, comparando-as com os fármacos disponíveis no mercado. Os AL de escolha foram as amino-amidas cíclicas: Bupivacaína (BVC), Mepivacaína (MVC) e Ropivacaína (RVC), bastante utilizadas em clínica médica e odontológica. Os sistemas carreadores de drogas adotados foram lipossomas unilamelares grandes (LUV de 400nm, compostos de fosfatidilcolina e colesterol) e as ciclodextrinas: ß-CD ou hidroxipropil ß-CD (HPß-CD). Ensaios de estabilidade física, por fluorescência, revelaram que os lipossomas mantêm o conteúdo encapsulado e que a presença do AL não interfere na permeabilidade dos mesmos, analisada em função do tempo e temperatura. O coeficiente de partição foi calculado e indicou o perfil esperado pelas substituições, i.e., MVC<RVC<BVC (93,132 e 136, respectivamente). Testes de estabilidade química não indicaram mudanças nos índices de peroxidação lipídica em até 4 meses de estocagem (a 4ºC) após encapsulação dos AL. Porém, análises por espalhamento de luz mostraram aumento no tamanho das vesículas após 30 dias de preparação, inviabilizando o uso das mesmas por períodos maiores. A complexação com CDs foi evidenciada através de calorimetria diferencial de varredura, que detectou alterações na temperatura de fusão dos AL puros, bem como perda do pico endotérmico referente à desidratação da cavidade da ciclodextrina, nos sistemas de BVC e RVC complexadas com ß-CD e HPß-CD. Imagens de microscopia eletrônica de varredura confirmaram que há perda da estrutura cristalina dos AL e CDs puros, após a complexação. Experimentos de solubilidade de fases revelaram aumento linear na solubilidade da BVC e RVC em função da concentração de CDs, além de permitir o cálculo da constante de associação entre AL:ß-CD (8,9 e 7,9 M-1) e AL:HPß-CD (14,7 e 10,0 M-1) para BVC e RVC, respectivamente. Através de ensaios in vitro (diálise) observou-se diminuição nas taxas de liberação de BVC e RVC complexadas e de RVC encapsulada em lipossomas, em relação aos AL livres, indicando que a interação com esses carreadores alterou a permeação dos AL através de membranas. Os ensaios de toxicidade, em cultura de fibroblastos e em eritrócitos humanos, revelaram diminuição na toxicidade dos AL após complexação com CDs (BVC e RVC) ou encapsulação em lipossomas (MVC e RVC). Nos ensaios in vivo observou-se que, após o bloqueio do nervo infraorbital em ratos, as formulações lipossomais (MVCLUV e RVCLUV) prolongaram a duração e aumentaram a intensidade da analgesia em relação aos AL livres ou associados a vasoconstritores (no caso da MVC), sugerindo as formulações de AL encapsulados em lipossomas como alternativa ao uso de vasoconstritores em procedimentos cirúrgicos prolongados e manutenção da analgesia pós-operatória, especialmente em Odontologia. Com relação à avaliação do bloqueio motor, a injeção dos AL livres, encapsulados ou complexados alterou, de maneira dose-dependente, a função motora dos animais após bloqueios caudal (injeção intratecal) e do nervo ciático (infiltração) havendo a perda reversível dos reflexos motores em todos os animais testados. Nenhuma das formulações de AL testadas, tanto com ß-CD, HPß-CD ou LUV, prolongou ou intensificou a potência do bloqueio motor induzida por BVC e RVC. No entanto, nos sistemas BVCHPß-CD e RVCHPß-CD observou-se redução significante na latência ou tempo para instalação do bloqueio, indicando um início de ação mais rápido, sem modificar a duração do bloqueio motor, o que é bastante desejável. Já a avaliação do bloqueio sensorial do nervo ciático de camundongos, demonstrou que os sistemas BVCHPß-CD, RVCHPß-CD e RVCLUV e induziram aumento na intensidade e duração da analgesia em relação aos AL livres ou complexados com ß-CD, tornando-os de grande interesse para uso no período pós-operatório. A injeção intratecal de BVCHPß-CD 0,5% também aumentou o limiar de nocicepção dos animais em relação à BVCß-CD e BVC livre, mostrando aumento na potência e duração da analgesia. Esse resultado, em particular, nos permite sugerir que o aumento da potência anestésica (ca 1,5 vezes), obtido com as formulações deve-se, além de ao aumento na concentração total de AL (em água e associado ao carreador) disponibilizada pelas formulações, à menor ligação dos anestésicos com proteínas do líquor e/ou sua menor captação pela circulação; mantendo o AL por mais tempo em contato com a membrana neuronal. Em avaliação neurohistológica encontramos sinais de neurotoxicidade em alguns dos animais tratados com o complexo BVCHPß-CD (a 0.5%de BVC) que não foram observados após injeção de HPß-CD ou BVC, isoladamente. A potencialização do efeito tóxico da BVC pela complexação com HPß-CD deve-se à maior disponibilidade do AL em contato com a membrana neuronal, sugerindo que o uso do complexo em concentrações menores (como 0,25%), reduziria o efeito neurotóxico sem modificar a potência anestésica. Além disto, a análise nefrohistológica não detectou quaisquer indícios de alterações morfofuncionais após o tratamento dos animais com HPß-CD, BVC ou BVCHPß-CD após administração intratecal, confirmando a potencialidade do uso clínico desta formulação anestésica / Abstract: Local anesthetics (LA) are among the different classes of pharmacological compounds used to attenuate or to eliminate pain. These drugs, which are able to reversibly block the excitation/transmission of the nerve impulse in axons have a relatively short action and a significant toxicity to the Central Nervous and Cardiovascular systems. In order to prolong the time of action and to reduce the systemic toxicity of LA, many investigations have been carried out with LA in drug-delivery systems. These novel formulations, called long-acting local anesthetics, allow the controlled release - avoiding high plasmatic concentrations to be reached ¿ in such a way that they prolong analgesia as well as they reduce LA¿s intrinsic toxicity. Our aim was to prepare, to characterize (the encapsulation, stability and drug-release) and to evaluate - both in vitro (cellular toxicity) and in vivo (latency, intensity and duration of anesthesia as well as local toxicity) the pharmacological activity of new drug-delivery systems for LA, in comparison to the commercially available anesthetics. We have chosen the cyclic amino-amide anesthetics Bupivacaine (BVC), Mepivacaine (MVC) and Ropivacaine (RVC), since they are largely used in medicine and dentistry. The drug-carrier systems used were large unilamellar liposomes (400 nm LUV, composed by phosphathidylcholine and cholesterol) and cyclodextrins: ß-CD and hydroxypropyl (HPß-CD). Stability tests showed that liposomes were able to keep their content and that LA incorporation did not change their permeability at different times and temperatures. Partition coefficients were measured and indicated the profile expected from the substitution degree, i.e. MVC < RVC < BVC (P values = 93, 132 and 136, respectively). Chemical stability was evaluated through oxidative tests and no changes in the lipid oxidation levels were observed up to 4 months after preparation and storage at 4ºC, with and without LA. Nevertheless, light-scattering measurements revealed an increase in the vesicles size after 30 days, restraining the use of the liposome formulations for a longer time. LA complexation with CDs was evidenced by Differential Scanning Calorimetry, which runs detected changes in the fusion temperature of the pure LA, as well as loss of the characteristic endothermic peak of dehydration of the cyclodextrin¿s (ß-CD and HPß-CD) cavity following complexation with BVC and RVC. Electron microscopy images revealed that LA:CD complexation leads to disappearance of the typical crystal structures of pure LA and CD, what was not noticed with juxtaposition (or physical mixture) of the compounds. Kinetic studies showed that complexation equilibrium is reached in a few hours, while phase-solubility tests detected an enhance in the water solubility of BVC and RVC in the presence of increasing CD concentrations, also allowing calculation of the association constants between LA:ß-CD (8.9 and 7.9 M-1) and LA:HPß-CD (14.7 and 10.0 M-1) for BVC and RVC, respectively. In vitro dialysis equilibrium tests disclosed a decrease in the release of BVC and RVC after complexation with HPß-CD or ß-CD as well as for liposomal RVC, when compared to free LA molecules, in a clear demonstration that the interaction with the carriers changed LA permeation through the membranes. Toxicity tests in vitro, including fibroblast cells culture and human erythrocyte hemolysis, have registered a decrease in the LA toxicity after complexation with both CDs (BVC and RVC) or encapsulation in liposomes (MVC and RVC). In vivo tests have shown, using the infraorbital nerve blockade test in rats, that liposomal formulations (MVCLUV and RVCLUV) prolonged the action and enhanced the intensity of the analgesia effect of free LA, as well as of vasoconstrictor associated-LA preparations (for MVC), suggesting that liposomal LA formulations could possible replace vasoconstrictors use in long-lasting surgical procedures or at the post-operatory period, specially for dentistry purposes. Motor blockade tests revealed that all the samples used: free, CD-complexed or liposome-encapsulated LA changed in a dose-dependent manner the motor function of the animals after caudal (intrathecal) or sciatic (infiltrative) injection, leading to the reversible loss of motor answer in all animals studied. None of the LA formulations tested (with ß-CD, HPß-CD or LUV), were able to prolong or to intensify the motor blockade induced by BVC and RVC. However, both BVCHPß-CD and RVCHPß-CD systems significantly reduced the latency for the motor blockade, indicating a fast onset of action, without changing the overall motor blockade, what is highly desirable for a LA. Evaluation of the sensorial blockade in the sciatic nerve of mice demonstrated that BVCHPß-CD and RVCHPß-CD, as well as RVCLUV formulation increased the intensity and duration of the analgesia effect, when compared to free or ß-CD-complexed LA, revealing that those systems can be of great interest at the post-operatory period. Intrathecal injection of 0.5% BVCHPß-CD enhanced the animals¿ nonciceptive limiar in relation to BVCß-CD and free BVC, revealing an increase in the analgesia potency and duration of action. This result allowed us to suggest that the enhance in the nonciceptive effect (ca 1.5 times) observed with the new LA formulations can be attributed, not only to the increase in total LA concentration available to the nerve fibers, but also to the lower protein-binding of the LA molecules, as well as to their lower clearance; altogether, these mechanisms keep the LA for a longer time in contact with the neuronal membrane. Morphological analysis of nervous¿ system cells disclosed neurotoxic signals in part of the animals treated with 0.5% BVCHPß-CD that were not observed if HPß-CD or BVC, alone, were used. The rise in the BVC toxic effect observed after complexation with HPß-CD can be explained by the enhanced availability of the LA molecules in contact with the neuronal membrane, what lead us to suggest that employment of the complex, at lower BVC dosages (0.25% for instance) could reduce the neurotoxic effect without changing the anesthetic potency. Besides, nephro-histological images did not detect any sign of morpho-functional alterations after intrathecal treatment of the animals with HPß-CD, BVC or BVCHPß-CD substantiating the potentiality of the clinical use of that LA formulation / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T12:15:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braga_MarioAntonio_M.pdf: 2842926 bytes, checksum: f402efe6ac374c0c0a33cc9d3c87fbd5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A clonidina (CND) é um composto imidazólico que foi sintetizado em 1960 e utilizado inicialmente como descongestionante nasal por sua ação vasoconstritora. Após o início do uso clínico deste fármaco, foram observados efeitos sistêmicos surpreendentes como hipotensão arterial, sedação e bradicardia. Como consequência de seu efeito hipotensor, este fármaco foi utilizado com eficácia no tratamento da hipertensão arterial durante 25 anos. Com a elucidação do seu mecanismo de ação, outras indicações foram sendo propostas na prática clínica e assim o fármaco ganhou expressivo interesse na anestesiologia, sendo utilizado como medicação pré-anestésica, adjuvante na anestesia geral, anestesia regional e pós-operatória, inclusive em pacientes pediátricos. Apesar da amplitude de indicações no tratamento da dor e anestesia, o fármaco apresenta reações adversas, tornando-se necessário manipular suas propriedades físico-químicas no intuito de aperfeiçoar seu efeito terapêutico e diminuir reações adversas. Neste trabalho objetivamos veicular a CND em hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-?-CD), com o intuito de otimizar a ação do fármaco, reforçando seu uso na prática clínica como analgésico e adjuvante na anestesia infiltrativa. Para este fim complexos de inclusão da CND com o carreador proposto foram preparados e caracterizados; além disso, o efeito anestésico in vivo da CND livre e complexada, associada ao anestésico local bupivacaína, foi avaliado pelo teste de tail-flick, após injeção intratecal em ratos Wistar. Uma relação estequiométrica 1:1 (CND:HP-?-CD) foi determinada e o tempo de equilíbrio foi de 24 horas. O complexo foi caracterizado por medidas de calorimetria exploratória diferencial, difração de raios-X, microscopia eletrônica de varredura e cinética de liberação. Estes ensaios forneceram indícios da associação da CND com a HP-?-CD, haja visto a diferença entre os picos endotérmicos, padrões de difração, padrão de cristalinidade e retardo em liberação, respectivamente. Os ensaios de ressonância magnética nuclear de hidrogênios mostraram baixa afinidade entre a CND e a HP-?-CD (Ka = 20 L/M-1), porém foi possível evidenciar os detalhes moleculares da inserção do anel aromático na cavidade da HP-?-CD. Apesar disso, o efeito anestésico do complexo CND:HP-?-CD, avaliado em animais, foi pronunciadamente superior ao dos fármacos CND e bupivacaína, isoladamente, indicando a viabilidade desta formulação para uso associado a anestésicos locais, na anestesia operatória / Abstract: Clonidine (CND) is an imidazole compound synthesized in 1960 and originally used as a nasal decongestant for its vasoconstrictor action. After initial clinical use, unexpected systemic effects were observed as hypotension, bradycardia and sedation. As a consequence of its hypotensive effect, this drug has been successfully used in the treatment of hypertension for over 25 years. With the elucidation of its mechanism of action, other indications were proposed in clinical practice. CND has gained significant interest in anesthesiology, being used as an adjuvant to general and regional anesthesia, during surgery or in the postoperative period, even in children. Despite its breadth of indications in the treatment of pain and anesthesia, CND has adverse reactions, making it necessary to manipulate its physicochemical properties in order to improve the therapeutic efficacy and decrease adverse reactions. In this work we proposed to complex clonidine with hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-?-CD) in order to optimize drug action enhancing its use as an analgesic adjuvant in infiltration anesthesia. For that, in addition to the preparation and characterization of a CND:HP-?-CD, inclusion complex, we evaluated the in vivo anesthetic effect of free and complexed CND, associated with the local anesthetic bupivacaine. A 1:1 stoichiometric ratio (CND:HP-?-CD) was determined after an equilibrium time of 24 hours. The complex was characterized by differential scanning calorimetry, X-ray diffraction, scanning electron microscopy and release kinetics. These trials provided evidences for the inclusion complexation of CND in HP-?-CD, considering the differences between endothermic peaks, diffraction patterns, standard crystallinity and sustained release, respectively. Nuclear magnetic resonance experiments revealed a low binding constant between clonidine and HP-?-CD (Ka = 20 L/M-1) but provided molecular details on the insertion of the aromatic ring inside the HP-?-CD macromolecular cavity. Despite that, the anesthetic effect of clonidine:HP-?-CD complex in animals was considerably higher than that evoked by clonidine and bupivacaine alone, pointing out the future use of this drug delivery formulation in association with local anesthetics, for surgical anesthesia procedures / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestre em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Orientadores: Eneida de Paula, Leonardo Fernandes Fraceto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_RobertaAlineFrancode_M.pdf: 1479897 bytes, checksum: 3c9af4bda36adc886426ab930c957a40 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A dor desempenha um papel biológico muito importante como indicador da presença de um estímulo nocivo, que pode representar dano real ou potencial ao organismo; entretanto, não é interessante que essa sinalização persista além das necessidades fisiológicas a ponto de tornar-se um incomodo, podendo dificultar o desempenho das atividades normais, comprometer a qualidade de vida do indivíduo e impedir a realização de práticas cirúrgicas curativas. Os anestésicos locais são fármacos empregados para alívio da dor aguda ou crônica, pois bloqueiam a condução do estímulo nervoso em membranas neuronais. Dentre eles, está a Tetracaína (TTC) um amino-éster de grande utilidade na prática clínica, empregado em procedimentos que requerem anestesia tópica, como aqueles oftalmológicos que necessitam de intervenções na córnea. As limitações do uso clínico da TTC está relacionadas à sua baixa estabilidade química (hidrólise da ligação éster por esterases plasmáticas) e sua toxicidade sistêmica. Sistemas de liberação modificada de fármacos, que empregam carreadores como ciclodextrinas, constituem uma alternativa para aumentar o tempo de ação anestésica e diminuir a toxicidade. As ciclodextrinas são capazes de formar complexos de inclusão com diversos fármacos, alterando propriedades como a solubilidade aquosa, o que torna esses oligosacarídeos cíclicos promissores para este tipo de aplicação. Neste trabalho, estudamos a complexação da TTC com beta-ciclodextrina (?-CD) e hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP-?-CD) em pH fisiológico e sua influência na toxicidade celular e efeito antinociceptivo, induzidos por aquele anestésico, objetivando a preparação de novas formas farmacêuticas. Para caracterização dos complexos de inclusão TTC:?-CD e TTC:HP-?-CD foram empregados métodos espectroscópicos (Ressonância Magnética Nuclear, fluorescência, absorção UV/VIS), difração de raios-X e calorimetria diferencial de varredura. A partir das análises realizadas, encontrou-se que a estequiometria de complexação da TTC com ambas as ciclodextrinas é de 1:1. A constante de associação aparente da TTC, determinada por DOSY-NMR, é de 777 M-1 e 2243 M-1, para ?-CD e HP-?-CD respectivamente, indicando uma forte interação entre as moléculas de anestésico e das ciclodextrinas, em pH fisiológico. Os dados de proximidade espacial, determinados por RMN (1DROESY) revelaram interações entre os hidrogênios Hh e Hi, (que fazem parte do anel aromático da TTC) e hidrogênios da cavidade interna das ciclodextrinas, permitindo assim propor a geometria dos complexos de inclusão da TTC com ambas ciclodextrinas. Ensaios in vitro, em cultura de fibroblastos da linhagem 3T3, mostraram aumento na viabilidade celular após complexação da TTC com ?-CD e HP-?-CD, em relação à TTC em solução. Testes de atividade biológica, de bloqueio do nervo infraorbital em ratos, demonstraram aumento significativo do tempo de duração da anestesia nos animais tratados com os complexos TTC:?-CD e TTC:HP-?-CD (40 min e 40 min), em relação ao grupo tratado com 0,5% de TTC livre (30 min). Os resultados obtidos neste estudo demonstram a formação de complexos de inclusão com forte interação entre TTC e ?-CD e HP-?-CD; indicam ainda que a utilização destes complexos de inclusão é promissora como forma farmacêutica alternativa para este anestésico, devido ao aumento da duração da anestesia (pois os complexos apresentaram maior eficácia quando comparados à TTC livre nas mesmas doses), ou ainda a diminuição da toxicidade (atingindo a mesma eficácia da TTC livre, com menores concentrações de TTC complexada). / Abstract: Pain plays an important biological role as a sign of the presence of a noxious stimulus, that denotes actual or potential damage to the body. However, it is not interesting this signal to persist beyond the physiological point, to become a nuisance that impairs the performance of normal activities, the quality of life or prevents the procedure of healing surgical practices. Local anesthetics are used for the relief of acute or chronic pain since they block the conduction of the painful stimulation in neuronal membranes. Among them is Tetracaine (TTC) an amino ester useful in clinical procedures requiring local anesthesia such as those ophthalmic ones with intervention in the cornea. The clinical use of TTC is limited by its low chemical stability (hydrolysis of the ester bond by plasma esterases) and systemic toxicity. The use of drug-delivery systems, in carriers such as cyclodextrins is a good approach to improve the duration of action and to diminish the toxicity of local anesthetics. Cyclodextrins are suitable for this type of application since these cyclic oligosaccharides are able to form inclusion complexes with several drugs improving their water solubility. Here we have studied the complexation of TTC with beta (?-CD) and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-?-CD) and its influence in cell toxicity and antinociceptive effects induced by that anesthetic, aiming the development of new pharmaceutical forms. TTC and ?-CD or HP-?-CD inclusion complexes were characterized using spectrophotometric methods (Nuclear Magnetic Resonance, fluorescence, UV-VIS absorption), X-ray Diffraction and Differential Scanning Calorimetry. A 1:1 stoichiometry of complexation was found for both complexes. The association constant determined by DOSY was 777 M-1 and 2.243 M-1 for TTC complexation with ?-CD and HP-?-CD, respectively, indicating a strong association between the anesthetic and both cyclodextrins, at physiological pH. The nuclear overhauser NMR data (ROESY) had disclosed trough the space proximities between hydrogens Hh and Hi - at the aromatic ring of TTC - and hydrogens from the inner cavity of the cyclodextrins, allowing us to suggest the geometry of TTC:?-CD and TTC:HP-?-CD complex formation. In vitro culture tests on 3T3 fibroblasts cells revealed an increase in cell viability after TTC complexation with ?-CD and HP-?-CD, in comparison to the effect of free TTC. Biological activity was assessed in rats, through the infraorbital nerve blockade test. The results revealed a significant increase in the duration of anesthesia in animals treated with TTC:?-CD and TTC:HP-?-CD (40 min and 40 min), in comparison to a solution of 0.5% tetracaine (30 min). The results presented here demonstrate the formation of strong associated inclusion complexes between TTC and ?-CD and HP-?-CD. The in vivo results allow us to consider those complexes as promising pharmaceutical forms to increase the duration of anesthesia induced by tetracaine (since both complexes showed higher anesthetic potency when compared to free TTC at equivalent doses) or to diminish its toxicity (since the same activity can be achieved with lower concentrations of the complexed TTC formulations). / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular