Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielleSM.pdf: 1455943 bytes, checksum: 8efcc0f4d0f0ac8dfc93b332700f07cb (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Four different sponge species were screened using Ouchterlony agarose gel and immunodiffusion tests to identify cross-reactivity with the polyclonal antibody IgG anti-deglicosilated CvL, a lectin from Cliona varians. Crude extract from the sponge Cinachyrella apion showed cross-reactivity and also a strong haemmaglutinating activity towards human erythrocytes of all ABO groups. Thus, it was submitted to acetone fractionation, IgG anti-deglicosilated CvL Sepharose affinity chromatography, and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC-AKTA) gel filtration on a Superose 6 10 300 column to purify a novel lectin. C. apion lectin (CaL) agglutinated all types of human erythrocytes with preference for papainized type A and O erythrocytes. The haemagglutinating activity is independent of Ca2+, Mg2+ and Mn2+ ions, and it was strongly inhibited by the disaccharide D-lactose, up to a minimum concentration of 6.25 mM. CaL molecular mass determined by FPLC-AKTA gel filtration on a Superose 12 10 300 column and SDS gel electrophoresis was approximately 124 kDa, consisting of eight subunits of 15.5 kDa, assembled by hydrophobic interactions. The lectin was relatively heat- and pH-stable. Leishmania chagasi romastigotes were agglutinated by CaL, indicating that lactose receptors could be presented in this parasite stage. These findings are indicative of the physiological defense roles of CaL and its possible use in the antibiosis of pathogenic protozoa / Uma varredura de lectinas foi realizada em extratos prot?icos de quatro esp?cies de esponjas utilizando t?cnicas de imunodifus?o para identificar lectinas imunorreativas ao anticorpo policlonal gerado contra CvL, uma lectina de Cliona varians. O extrato bruto da esponja Cinachyrella apion foi imunorreativo e apresentou atividade hemaglutinante a eritr?citos humanos de todos os grupos do sistema ABO. Assim, ele foi submetido ao fracionamento com acetona, ? cromatografia de afinidade com IgG anti-CvL desglicosilada ligada a Sepharose e ? romatografia de gel filtra??o em uma coluna Superose 6 10 300 GL em istema FPLC-AKTA (Fast Protein Liquid Chromatography) para a purifica??o de uma lectina imunorreativa ao anticorpo IgG anti-CvL. A lectina de C. apion (CaL) aglutinou todos os tipos de eritr?citos humanos, com prefer?ncia por eritr?citos papainizados dos tipos A e O. A atividade hemaglutinante mostrou-se independente dos ?ons Ca2+, Mg2+ e Mn2+, e foi fortemente inibida pelo dissacar?deo D-lactose, at? a concentra??o m?nima de 6,25 mM. A massa molecular da CaL, determinada por gel filtra??o em uma coluna Superose 12 10 300 GL em sistema FPLC-AKTA e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foi de aproximadamente 124 kDa, consistindo de oito subunidades de 15,5 kDa, unidas por intera??es hidrof?bicas. A lectina foi relativamente est?vel em extensas faixas tanto de pH quanto de temperatura. Promastigotos de Leishmania chagasi foram aglutinados por CaL, indicando que receptores de lactose podem estar presentes nesse est?gio do parasita. Esses achados s?o indicativos do papel de defesa fisiol?gica da CaL e do seu poss?vel uso na antibiose de protozo?rios patog?nicos

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LucianaMAR_DISSERT_1-46.pdf: 2781355 bytes, checksum: 034c99a1d83d0efb6ef37be34866f028 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Cancer is a term used to represent a set of more than 100 diseases, including malignant tumors from different locations. The malignancies are the second leading cause of death in the population, representing approximately 17% of deaths of known cause. Strategies that induce differentiation have had limited success in the treatment of established cancers. In this work, a lectin purified from the marine sponge Cinachyrella apion (CaL) was evaluated due to its hemolytic, cytotoxic and antiproliferative properties, besides the ability to induce cell death via apoptosis in tumor cells. The antiproliferative activity of CaL was tested against cell lines, with the highest inhibition of tumor growth for HeLa, reducing cell growth at a dose dependent manner, with a concentration of 10 ?g/mL. The hemolytic activity and toxicity against peripheral blood cells were tested using the concentration of IC50 for both trials and twice the IC50 for analysis in flow cytometry, indicating that CaL is not toxic to these cells. To assess the mechanism of cell death caused by CaL in HeLa cells, we performed flow cytometry and western blotting. The results showed the lectin probably induces cell death by apoptosis activation by pro-apoptotic protein Bax, promoting mitochondrial membrane permeabilization, cell cycle arrest in S phase, with accumulation of cells of approximately 57% in this phase, and acting as both dependent and/or independent of caspases pathway. These results suggest that CaL has the potential to be used as drug treatment against cancer. / O c?ncer ? um termo utilizado para representar um conjunto de mais de 100 patologias, incluindo tumores malignos de diferentes localiza??es. As neoplasias malignas constituem a segunda causa de morte na popula??o brasileira, representando aproximadamente 17% dos ?bitos de causa conhecida. Estrat?gias que induzem ? diferencia??o t?m tido sucesso limitado no tratamento de c?nceres estabelecidos. Neste trabalho, uma lectina purificada da esponja marinha Cinachyrella apion (CaL) foi avaliada quanto ?s suas atividades hemol?tica, citot?xica, antiproliferativa e quanto ? capacidade de indu??o de morte celular pela via de apoptose em c?lulas tumorais. A atividade antiproliferativa de CaL foi testada contra linhagens celulares, com maior taxa de inibi??o do crescimento para a linhagem tumoral HeLa, induzindo a inibi??o de maneira dose dependente na concentra??o de 10 ?g/mL. A atividade hemol?tica e a toxicidade contra c?lulas do sangue perif?rico foram testadas utilizando a concentra??o de IC50 para ambos os ensaios e o dobro da IC50 para a an?lise em citometria de fluxo, indicando que CaL n?o ? t?xica para estes tipos celulares. Para avaliar o mecanismo de morte celular induzida por CaL nas c?lulas HeLa, foi realizada a citometria de fluxo e western blotting. Os resultados mostraram que a lectina induz morte celular por apoptose atrav?s da ativa??o da prote?na pr?-apopt?tica Bax, al?m de promover a parada do ciclo celular na fase S, com ac?mulo de c?lulas de aproximadamente 57% nesta fase, agindo tanto de maneira dependente como independente de caspases. Estes resultados sugerem que a CaL possui potencial para ser utilizado como f?rmaco no tratamento contra o c?ncer.