Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: José Moacir Marin / Resumo: A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / Abstract: The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO - E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / Abstract: The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis / Mestre