Orientador: José Maurício Sforcin / Banca: Anderson de Sá-Nunes / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Resumo: Nosso grupo tem se dedicado à investigação das ações biológicas da própolis, alecrim-do-campo, capim-limão e cravo-da-Índia. A própolis tem despertado a atenção dos pesquisadores em virtude de suas inúmeras propriedades biológicas, e o alecrim-do-campo é uma das principais fontes deste apiterápico em nossa região. Já o capim-limão e o cravo-da-Índia têm sido pouco avaliados no tocante à sua ação imunomoduladora. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito imunomodulador do extrato e respectivos compostos isolados da: própolis (ácidos cumárico e cinâmico), do alecrim-do campo (ácido cafeico), do cravo-da-Índia (eugenol) e do capim-limão (citral) sobre a produção de citocinas (IL-1, IL-6 e IL-10) por macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Em protocolos com LPS, macrófagos foram incubados ora com os produtos naturais supracitados em diferentes concentrações e posteriormente desafiados com LPS; ora desafiados com LPS e posteriormente incubados com os produtos naturais. A dosagem das citocinas foi realizada através da técnica de ELISA. A própolis exerceu ação moduladora sobre a resposta imune e inflamatória, e os ácidos cinâmico e cumárico podem estar envolvidos em sua ação imunomoduladora. O alecrim-do-campo e o ácido cafeico também demonstraram efeito imunomodulador quanto à produção de citocinas. O capim-limão exerceu efeito inibitório sobre a produção de citocinas, sendo este efeito mais pronunciado em ensaios com o citral. Resultados semelhantes foram observados com o cravo-da-Índia e o eugenol. Nossos resultados sugerem que o potencial imunomodulador dos produtos naturais merece ser melhor explorado em futuras investigações, avaliando sua eficiência em doenças inflamatórias / Abstract: Our group has been investigating the biological action of propolis, "alecrim-do-campo", lemongrass and clove. Propolis has attracted the researchers' attention due to its several biological properties, and "alecrim-do-campo" is its main vegetal source in our region. However, little is known concerning lemongrass and clove immunomodulatory action. The goal of this work was to evaluate the immunomodulatory effect of the following extracts and isolated compounds: propolis (coumaric and cinnamic acids), "alecrim-do-campo" (caffeic acid), clove (eugenol) and lemongrass (citral) on cytokines production (IL-1, IL-6 and IL-10) by peritoneal macrophages of BALB/c mice. In LPS protocols, macrophages were incubated either with natural products in different concentrations and then challenged with LPS; or with LPS and then incubated with the natural products. Cytokine concentrations were measured by ELISA. Propolis exerted a modulatory action on the immune and inflammatory response and cinnamic and coumaric acids may be involved in its immunomodulatory action. "Alecrim-do-campo" and caffeic acid also exerted an immunomodulatory action on cytokines production. Lemongrass showed an inhibitory action on cytokines production, mainly in the assays with citral. Similar results were found using clove and eugenol. Our results suggest that the immunomodulatory potential of the natural products should be investigated in further studies, evaluating their efficacy in inflammatory diseases / Mestre

Orientador: Iveraldo dos Santos Dutra / Banca: Júlio Cesar de Freitas / Banca: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: Raul José Silva Girio / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: Foi avaliado pelo teste de ELISA indireto a resposta humoral para as toxinas botulínicas tipos C e D em animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais. Empregou-se duas vacinas bivalentes C e D (vacina 1 e vacina 2) e duas polivalentes contendo ainda os toxóides botulínicos tipos C e D (vacina 3 e vacina 4). Para análise foram realizadas seis colheitas de sangue ao longo do experimento, nos dias 0, 42, 75, 160, 250 e 342 após a vacinação. A imunidade passiva em bezerros até os 90 dias de idade, filhos de mães vacinadas com diferentes toxóides comerciais foram avaliados em 75 bezerros, agrupados de acordo com a vacina utilizada na mãe (B1, B2, B3 e B4). Para análise foram realizadas 3 colheitas de sangue, nos dias 5 (± 2), 45 e 90 dias após o nascimento. A avaliação da resposta humoral de bovinos vacinados em diferentes faixas etárias também foi realizada empregando-se uma vacina antibotulínica bivalente (C e D) comercial. Para análise, 90 bovinos foram divididos em 3 grupos de acordo com a faixa etária; animais com idade inferior a 2 anos, entre 2 e 5 anos e superior a 5 anos. Na avaliação da resposta humoral de animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais, para a toxina tipo C, as vacinas 1, 2, 3 e 4 não apresentaram diferenças significativas aos 42 dias da primeira dose. Aos 75 dias, a vacina 1, foi superior às vacinas 3 e 4, induzindo maior produção de anticorpos nos animais, porém não diferiu da vacina 2. Aos 160 dias houve queda na quantidade de anticorpos em todos os grupos, não havendo mais diferenças significativas entre as quatro vacinas testadas. Para a toxina tipo D, aos 42 dias da vacinação, não houve diferenças significativas entre as vacinas 1, 2 e 4, que apresentaram neste momento, valores superiores a vacina 3. No entanto, quando avaliadas aos 75 dias, a vacina 1 apresentou maior produção de anticorpos, diferindo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To compare the efficiency of an "in house" ELISA test, standardized to measure antibody C and D from Clostridium botulinum, a survey to analysis four different commercial vaccines was conducted. The vaccines used were two commercial, bivalent botulinum containing subtypes C and D (vaccine 1 and vaccine 2) and other two polyvalent including subtypes C and D. The first trial was blood samples taken at 0, 42, 75, 160, 250 and 342 days after vaccination, whereas the booster was performed at day 42. The second trial, maternal antibodies were also measured taken blood samples from 1-3 months age steers obtained from vaccinated heifers with the same vaccines described above, and divided into four different groups (B1, B2, B3, B4). The blood samples were taken at days 5, 45 and 90 after birth. Third and last trial was humoral response from vaccinated cattle with different age evaluation performed using the commercial Clostridium botulinum vaccine subtype C and D. For this purpose, 90 animals never vaccinated, were divided into 3 groups: 1 - 2 years old; 2 - animals aged between 2 and 5 years old; 3 - animals 5 years old. The blood samples were taken 30 days after vaccination after second dose of the vaccine. From the first trial, no significant difference was observed when subtype C was search in sera from animals at 42 days after vaccination. However, at 75 days after vaccination, vaccine 1 was able to induce higher levels of antibodies when compared to vaccine 3 and 4. The antibody level was declining after 160 days post vaccination. For subtype D antigen, at 42 days after vaccination, no differences could be observed. However, at 75 day after vaccination, higher levels of antibodies were observed from animals vaccinated with vaccine 1. Comparing the bivalent vaccines, these were able to induce higher antibodies levels at 75 days after vaccination (toxoid C). In addition, the same... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO - E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / Abstract: The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis / Mestre

Orientador: Luiz Fernando de Oliveira e Silva Carvalho / Banca: Geraldo Camilo Alberton / Banca: Luís Antonio Mathias / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar infecção por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Panama e a possibilidade de transmissão aérea de entre leitões desmamados. Seis leitões recém-desmamados e sadios foram igualmente distribuídos na formação dos três grupos experimentais - o grupocontrole, o grupo infectado e o grupo-sentinela. Os animais foram alojados dois a dois em três câmaras de isolamento especialmente projetadas para o estudo, que garantiam não apenas que os animais fossem mantidos completamente isentos de contacto com o ambiente externo mas que o fluxo de ar unidirecional, no sentido animais-controle - animais infectados - animais-sentinela, fosse a única maneira de disseminação do agente. Salmonella Panama com resistência induzida ao ácido nalidíxico (Salmonella PanamaNal+) foi utilizada na preparação do inóculo. Análises microbiológicas de suabes retais dos animais foram realizadas diariamente em todos os animais durante os 14 dias subseqüentes à inoculação, após o que os animais foram eutanasiados e necropsiados, visando análises microbiológicas de amostras de órgãos internos. As análises bacteriológicas iniciaram-se pelo pré-enriquecimento das amostras, em caldo GN-Hajna para as amostras de fezes e a água peptonada tamponada para os órgãos internos. Prosseguiram pelo enriquecimento em caldo Rappaport-Vassiliadis e em Tetrationato Müller Kaufmann para então serem semeadas nos ágares xilose lisina tergitol 4 (XLT4) e verde-brilhante modificado, ambos suplementados com ácido nalidíxico. Colônias características foram submetidas às provas bioquímicas, em ágar tríplice açúcar ferro (TSI) e ágar ferro lisina (LIA) e posteriormente a avaliação sorológica. Amostras de sangue foram colhidas de todos os animais e, submetidas ao teste ELISA... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the experimental infection wich Salmonella serotype Panama and the airborne transmission of among weaned piglets. Six weaned piglets were used and distributed in three groups of animals - group 1 (control), group 2 (infected) and group 3 (sentinels). All animals were housed in three stainless-steel glass isolation cabinets connected by unidirectional airflow air ducts. Animals didn't have contact with the external environment, guaranteeing that airflow was the unique way of the agent's spread. An induced nalidixic acid resistant strain of Salmonella Panama (Salmonella Panama Nal+) were used to induce infection in one of the groups. Bacteriological analyses of rectal swabs were implemented daily within 14 days after inoculation. For bacteriological exams of internal organs animals were euthanized and necropsied. A pre-enrichment in broth GN-Hajna for the fecal samples and in buffered peptone water for the internal organs samples were conducted. Subsequently, samples were transferred to Rappaport-Vassiliadis and Tetrationato Müller Kaufmann. The samples were transferred to the agar xylose-lysine-tergitol 4 (XLT4) and to a modified brilliant green media, both supplemented with nalidixic acid. Characteristic colonies were submitted to the biochemical tests triple sugar iron agar (TSI) and lysine iron agar (LIA) and later to the serological prove. Samples of blood were taken twice - before Salmonella inoculation and before euthanasia of the piglets. Sera was submitted to the ELISA test. Results showed a Salmonella systemic infection in the inoculated animals (infected group), but there were no evidence of Salmonella transmission to the sentinel group. / Mestre