Orientador: Elenice Deffune / Banca: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Banca: Wagner José Fávoro / Resumo: Anticorpos monoclonais (mAbs) são ferramentas-chave na investigação de fenômenos biológicos e uma promissora alternativa para o tratamento de muitas doenças, em especial os tumores. A cadeia produtiva de mAbs apresenta pontos cruciais para o desenvolvimento de um produto de qualidade que justifique os altos custos de produção. O procedimento de clonagem celular é a etapa de produção que garante a monoclonalidade das células produtoras, assegurando a especificidade do mAb. Desde os anos 80 existem tentativas de otimização e automação deste procedimento visando a garantia da monoclonalidade e aumento na eficiência de clonagem. A captura celular sob observação direta ao microscópio pode ser considerada a única metodologia de clonagem celular que garante 100% de crescimento monoclonal. Neste trabalho avaliamos indicadores de eficiência de clonagem, tempo de execução e custos de uma metodologia de clonagem celular por micromanipulação em comparação com a metodologia de diluição limitante. Hibridomas murinos secretores de mAbs de diversas especificidades foram clonados em paralelo por ambas as técnicas. Não houve diferença no tempo de execução das metodologias embora a observação dos clones da micromanipulação seja de 4 a 6 vezes mais rápida. A produção de clones por micromanipulação é 4 vezes superior à diluição limitante com redução de 60% no consumo de meio de cultura, o que justifica os custos da metodologia. Concluímos que a clonagem celular por micromanipulação é uma técnica precisa e que garante 100% de crescimento monoclonal podendo vir a substituir a diluição limitante. Esta garantia elimina testes de comprovação da monoclonalidade e reduz o tempo de cultura necessário para obtenção de mAbs. / Abstract: Monoclonal antibodies (mAbs) are outstanding tools for investigating biological phenomena and a promising alternative to treat several diseases, specially tumors. Production of mAbs has settled critical milestones at the production chain which justifies high development costs. Cell cloning procedure is the milestone that guarantees monoclonality and assures antibody specificity. Since the 80's there have been attempts to optimize and automate this procedure aiming to guarantee monoclonality and enhance cloning efficiency. Celular capture under direct microscope observation is the only method considered to guarantee 100% monoclonal growth. On this work we evaluated cloning efficiency, working time and costs of a micromanipulating cloning technique compared with gold-standard limiting dilution. Murine secretor hybridomas of various specificity were cloned by both techniques in parallel. No differences were observed at both working times although observation of micromanipulated clones was 4 to 6 times faster. Cloning efficiency of micromanipulation cloning was 4 times higher than limiting dilution with 60% reduction on media consume what justifies methodology costs. Cell cloning by micromanipulation is a precise procedure that guarantees 100% monoclonal growth and could substitute limiting dilution. This guarantee eliminates additional tests to assure monoclonality and reduces culture working time on mAbs production. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: José Moacir Marin / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa - Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / Abstract: The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector - Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis. / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar a ação da demecolcina na composição de microtúbulos, maturação e desenvolvimento in vitro de oócitos bovinos, submetidos ao tratamento em metáfase I (MI) e metáfase II (MII). No experimento I, observamos que a concentração 0,05æg/mL foi a mais eficaz na indução de enucleação no grupo MI (15,2%) e na formação de protrusão no grupo MII (55,1%). No experimento II, verificamos manifestações da demecolcina em apenas 0,5 h de tratamento, pelo aumento significativo de categorias de oócitos sem microtúbulos. Houve nova polimerização dessas estruturas, quando oócitos expostos à droga em MII, foram cultivados em meio livre desse agente. No experimento III, evidenciamos influência negativa da demecolcina na maturação nuclear de oócitos tratados em MI, durante 12 horas (4,9% de oócitos em MII) e um diferente comportamento quanto à distribuição de grânulos corticais (GC); enquanto no grupo MI houve tendência à antecipação na migração de GC para a periferia, após 2 horas de exposição à droga, no grupo MII, observou-se nesse momento, ação prejudicial da mesma. Ainda, verificamos incompleta expansão das células do cumulus em oócitos expostos à demecolcina por 12 horas. No experimento IV, obtivemos alta eficácia da técnica de enucleação (90,6%) e grande variação quanto ao desenvolvimento até o estádio de blastocisto (12,5 a 47%), não verificando-se ação prejudicial da droga no desenvolvimento embrionário. / Abstract: The aim of this study was to evaluate demecolcine action on microtubules composition, maturation and in vitro development of bovine oocytes, submitted to the treatment in metaphase I (MI) and metaphase II (MII). In the experiment I, we observed that 0.05æg/mL was the most efficient concentration to induce the enucleation in group MI (15.2%) and protrusion formation in group MII (55.1%). In experiment II, we verified demecolcine manifestations already after 0.5 hour of treatment, supported by the significant increase of categories of oocytes without microtubules. There was new polymerization of these structures when oocytes exposed to the drug in MII were cultured in agent-free medium. In experiment III, we evidenced negative influence of demecolcine on nuclear maturation of oocytes treated on MI for 12 hours (4.9% of oocytes in MII) and a different behavior for cortical granules (CG) distribution; while in MI group there was a tendency for the anticipation of CG migration to periphery, after 2 hours of drug exposition, in the MIII group, was observed a harmful effect of the drug. Moreover, we verified incomplete expansion of cumulus cells in oocytes exposed to demecolcine for 12 hours. In experiment IV, we got high effectiveness of enucleation technique (90.6%) and wide variation for development to the blastocyst stage (12.5 to 47%), and no harmful effects of the drug on embryonic development were observed. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: José Antonio Visintin / Resumo: O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3 machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100æg/mL Estreptomicina e 3,0æg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem. Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm3. For culture, the bottoms of two culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin and 3 g/ml amphotericin B were added with the bottles raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO2 in air, the bottles were moved to a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO2 in air until the beginning of confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage were performed. Two passages were performed before freezing. For the second passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular cycle at the moment cells achieved confluence...(Complete abstract, click electronic address below) / Mestre

Orientador: Antonio Baldo Geraldo Martins / Banca: Dalmo Lopes de Siqueira / Banca: João Alexio Scarpare Filho / Banca: Fabíola Vitti Môro / Banca: Teresinha de Jesus Deléo Rodrigues / Resumo: Esse trabalho teve por objetivo fornecer informações sobre aspectos morfológicos da semente; determinar a possibilidade de clonagem da variedade Duke 7 por alporquia; avaliar influência da época no pegamento da enxertia em abacateiro das variedades 'Hass' e 'Fortuna' e caracterizar, por estudos anatômicos e morfológicos, mudanças na gema vegetativa à florífera, para duas variedades de abacate 'Hass' e 'Fortuna'. As sementes são monoembriônicas e exalbuminosas, de germinação hipógea e a emergência das plântulas ocorreu 33 dias após a semeadura; a raiz primária é longa e de coloração branca e as raízes secundárias são curtas e filiformes; os cotilédones são maciços e de coloração rosada sendo que foi possível observar a presença de múltiplos caulículos na semente de abacate, originados do colo; os frutos são do tipo baga; as sementes apresentam policaulia; o início da estabilização da emergência de plântulas ocorre na oitava semana. Não houve enraizamento dos alporques; o período mais indicado para o sucesso da enxertia, é de modo geral, compreendido entre os meses de novembro e dezembro para ambas as variedades 'Hass' e 'Fortuna'. A transição entre a fase vegetativa e a reprodutiva ocorre no mês de maio, quando há diminuição da temperatura; a evocação floral ocorre um mês após, caracterizado pelo formato arredondado das gemas; a iniciação da inflorescência ocorre dois meses após a transição, no mês de julho. / Abstract: This work aimed to study morphological aspects of seeds; determine the cloning possibility of Duke 7 cultivar by air layering; evaluate the influence of the season on grafting of Hass and Fortuna avocado cultivars and to characterize by anatomical and morphological studies the modifications on vegetative to flowering bud. The seeds are monoembryonic, the germination is hypogea and the emergence of seedlings occurred 33 days after planting; the main root is long, white and the secondary roots are short; the cotiledons are hard and pink; the seeds presented polystems it was observed the presence of many small stems on avocado seed; the fruit is a berry. The stabilization of seed emergency occurred with eight weeks. There was no rooting in the air-Iayerings; the season more indicated for grafting is between November and December for both cultivars. The change from vegetative to reproductive phase was in May, when there is lower temperatures; the floral evocation occurs one month after, characterized by the rounded format of buds; the initiation of the inflorescence occurs after two months of the transition, in July. / Doutor

Orientador: Joni Augusto Cirelli / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Ary dos Santos Pinto / Banca: Maria Mônica Studart Gurgel Mendes Moreira / Banca: Márcia Pinto Alves Mayer / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar os parâmetros clínicos e microbiológicos periodontais de crianças e adolescentes sob terapia ortodôntica com aparelho fixo ou removíveis. Trinta indivíduos (14,5l1,7 anos - Grupo FIX) que utilizavam aparelhos fixos e 18 que utilizavam aparelho extra bucal removível ou placa de Hawley há pelo menos 6 meses (9,6 l 1,5 anos - Grupo REM) foram comparados a dois grupos controle, constituídos por indivíduos da mesma idade (14,2 l 1,7 anos - Grupo C-FIX e 9,3 l 1,9 anos - Grupo C-REM) que não utlizavam esses dispositivos. Foi analisada a presença de placa bacteriana visível (IP), sangramento gengival (IG), profundidade de sondagem (PS) e perda de inserção clínica (PIC). Amostras de placa bacteriana subgengival foram coletadas e analisadas por meio de sondas de oligonucleotídeos para A. actinomycetemcomitans (Aa), C. rectus, Capnocytophaga sp. E. corrodens, F. nucleatum, F. vincentii, M. micros, Neisseriaceae., P. gingivalis, P. intermedia, espiroquetas, T. forsythensis e Treponema sp. Diferenças significantes (p<0,05) foram observadas entre os grupos FIX e C-FIX quanto aos parâmetros IP (66,8% e 47,7%), IG (43% e 15,6%), e para as prevalências de todas as bactérias avaliadas, exceto as da familia Neisseriaceae. Entre dentes bandados e seus análogos no grupo controle foram encontradas diferenças significantes para os parâmetros PV (80,3% e 58,8%), SM (64,3% e 20,6%) e PS (2,9 mm e 2,5 mm), respectivamente. Entre os grupos REM e C-REM, essas diferenças também foram observadas para IP (58,7% e 14,3%) e IG (19,8% e 8,8%) e para as prevalências de Aa, C. rectus, E. corrodens, Neisseriaceae e espiroquetas. Entre os dentes retentores de grampo e seus análogos no grupo controle verificou-se diferenças significantes para IP (77,8% e 31,3%). Não foi verificado aumento da PS associado a PIC. Também foi avaliada a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The purpose of this study was to compare clinical and microbiological parameters in children and adolescents with and without fixed or removable orthodontic appliances. Thirty subjects (mean age 14.5l1.7 years) treated with fixed appliances and 18 treated with removable appliances for at least 6 months were selected as test groups, FIX and REM, respectively. The control groups were comprised of 30 subjects (mean age 14.2l1.7 years - Group C-FIX) and 18 subjects (mean age 9.3l1.9 years - Group C-REM) that did not receive orthodontic treatment. Clinical evaluations were made for plaque index (PI), gingival index (GI), probing depth (PD) and clinical attachment loss (CAL). Subgingival plaque samples were collected from the patients and analyzed by oligonucleotide probes for the presence of A. actinomycetemcomitans (Aa), C. rectus, Capnocytophaga sp. E. corrodens, F. nucleatum, F. vincentii, M. micros, Neisseriaceae., P. gingivalis, P. intermedia, spirochetes, T. forsythensis and Treponema sp. Additionally, two subgingival dental plaque samples from one subject of each test group were further analyzed by cloning and sequencing the amplified 16S rDNA. Significant differences were noted between FIX and C-FIX for PI (66.8% versus 47.7%), GI (43.8% versus 15.6%) and between the banded teeth in the FIX group and the analogous teeth in the C-FIX group for PI (80.3% versus 58.8%), GI (64.3% versus 20.6%) and PD (2.9 mm versus 2.5 mm). Significant differences were noted between FIX and C-FIX for all targeted bacteria but Neisseriaceae. Results: Significant differences were also noted between REM and C-REM for PI (58.7% versus 14.3%) and GI (19.8% versus 8.8%) and between the clasped teeth in the test group and the analogous teeth in the control group for PI (77.8% versus 31.3%). Significant differences were noted between the REM and C-REM for Aa... (Complete abstract, click electronic address below). / Doutor

Orientadora: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Fernando Luiz de Lucca / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: O presente estudo objetivou clonar e analisar a expressão do gene p28 da amostra Jaboticabal de Ehrlichia canis e avaliar sua utilização no diagnóstico molecular e sorológico da erliquiose canina. A PCR, baseada no gene p28 de E. canis, foi capaz de detectar o DNA de um único parasita entre um bilhão de células. Amostras sangüíneas de cães com suspeita clínica de erliquiose foram testadas pela PCR, baseada no gene p28 e pela nested PCR para detecção do gene 16S rRNA. O fragmento amplificado do gene p28 foi observado em 51,25% (n=41) das 80 amostras examinadas, e todas elas foram positivas para o gene 16S rRNA de E. canis, entretanto, em outros 21,25% (n=17) das amostras apenas o gene 16S rRNA foi detectado. A caracterização molecular do gene p28 mostrou similaridade com outras amostras de E. canis. Para a expressão da proteína recombinante P28, foram testados dois sistemas diferentes com linhagens de Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS e BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. A análise pelo Western-blotting revelou reatividade de várias frações protéicas com anticorpo policlonal anti-E. canis. Porém, quando a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal para detecção de moléculas de histidina, não houve reatividade, mostrando a ausência de expressão da proteína P28. / Abstract: The aim of this study was to clone and express the p28 gene of Ehrlichia canis Jaboticabal strain and evaluate its application in molecular and serological diagnosis of canine ehrlichiosis. The p28-based PCR was able to detect E. canis DNA of one parasite among one billion cells. Blood samples from dogs for which a diagnosis of canine ehrlichiosis was suspected were tested by p28-based PCR and by 16S rRNA-based nested PCR. Amplified fragment from p28 gene were observed in 51.25% (n=41) among 80 assayed samples and all of this positive samples were also positives for 16S rRNA gene of E. canis, however in 21.25% (n=17) only 16S rRNA gene was detected. The molecular characterization of p28 gene showed similarity with others strains of E. canis. Expression of P28 recombinant protein was tested with two different systems and in Escherichia coli BL21(DE3), BL21 Star(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysS and BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strains. After expression induction, Westernblotting showed reactivity of some protein fractions against anti-E. canis antibodies. However, when samples were incubated with anti-histidine monoclonal antibodies, they did not react, demonstrating non-expression of P28 protein. / Doutor

Resumo: O mal-do-fio (ou queima-do-fio) é uma doença causada pelo fungo Basidiomiceto Ceratobasidium sp., que afeta diversas plantas frutíferas nativas ou cultivadas. A doença ocorre com mais freqüência em zonas de alta precipitação e temperaturas elevadas, típicas de regiões de florestas tropicais como a Amazônia e a Mata Atlântica. Em São Paulo, recentemente detectou-se a ocorrência do mal-do-fio, em caquizeiro na região de Mogi das Cruzes. Essa doença pode- se tornar importante com a expansão do cultivo de fruteiras no Estado. A maioria das pesquisas sobre o patossistema focalizou a epidemiologia e o controle do fungo. Entretanto a etiologia do patógeno ainda não está totalmente definida, especialmente para populações do fungo infectando caqui e chá no Estado de São Paulo. Há também pouca informação sobre a divergência genética entre populações do patógeno de hospedeiros distintos como caqui e chá. O primeiro objetivo deste trabalho foi determinar o posicionamento filogenético global de populações de Ceratobasidium sp. do caqui e do chá, em relação a espécies de Ceratobasidium sp. descritas no mundo. Foram analisadas seqüências de DNA da região ITS-5.8S do rDNA, inferindo-se a história dos alelos ou haplótipos deste lócus, por meio de métodos filogenéticos, cladísticos e coalescentes. Observou-se que uso de C. noxium é apropriado para denominar espécies associadas ao mal-do- fio em caqui e chá, apesar de C. noxium do caqui e do chá constituírem populações filogeneticamente independentes, as quais denominamos de Grupo Diospyrus e Grupo Camellia. Este estudo trouxe uma contribuição importante para a compreensão das relações filogenéticas e biologia de populações de C. noxium em caqui e chá. Uma vez esclarecidas as questões filogenéticas, o segundo objetivo deste trabalho foi testar a patogenicidade cruzada de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The white-thread blight is a disease caused by the Basidiomycete fungus Ceratobasidium sp. that affects several native or cropped tree fruits. This disease frequently occurs in zones of high precipitation and high temperatures typical of the tropical forest regions such as the Amazon and the Atlantic Forest. In São Paulo, the occurrence of the white-thread blight was detected only recently on kaki orchards closer to Mogi das Cruzes. That disease can become important with the expansion of the fruit trees cropping areas in the State. Most of the researches about the pathosystem has focused on the epidemiology and control of fungus. However the etiology of the pathogen is not totally defined yet, especially for the fungus populations infecting kaki and tea in São Paulo State. There is also little information available about the biological and genetic divergence between pathogen populations from distinct hosts, such as kaki and tea. The first objective of this research was to determine the global phylogenetic placement of populations of Ceratobasidium from kaki and tea, considering the species of Ceratobasidium described throughout the world. Sequences of the ITS-5.8S region of the rDNA were analyzed, inferring the alleles or haplotypes history for this locus, by phylogenetics, cladistisc and coalescent methods. We observed that the use of C. noxium is appropriate to denominate the fungus species associate with the white-thread blight on kaki and tea, despite the fact that C. noxium from kaki and tea constitutes phylogenetically independent populations, which we denominate Diospyrus and Camellia groups. This study brought an important contribution for the understanding of the phylogenetics and population biology of C. noxium infecting kaki and tea. Once the phylogenetics subjects have been cleared, the second objective of this work was to test the cross-pathogenicity... (Complete abstract, access electronic address below) / Orientador: Paulo Cezar Ceresini / Coorientador: Alcebíades Ribeiro Campos / Banca: Adriana Zanin Kronka / Banca: Cézar Junior Bueno / Mestre