Orientador: Alessandra Alves de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niza_Barbara_M.pdf: 2368175 bytes, checksum: 2c97ffad74e7a3e1c33ae99c78818b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira é um importante setor para a economia do país, contribuindo com superávits comerciais e geração de empregos, entretanto, o setor passa por uma grave crise econômica em decorrência do alto custo de produção e do baixo valor pago pela caixa de laranja no Brasil. O principal motivo do alto custo de produção é a alta incidência de pragas e doenças que atingem essa cultura. Dentre as doenças, a Clorose Variegada do Citros (CVC) causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida a seus hospedeiros por cigarrinhas vetoras, é a que até hoje causou mais danos à citricultura brasileira. O mecanismo de patogenicidade da X. fastidiosa permanece não conclusivo porém a hipótese mais aceita está relacionada à facilidade da bactéria em colonizar o hospedeiro, ou seja, em se movimentar e multiplicar dentro dos vasos do xilema da planta infectada, seguido da formação do biofilme. O conhecimento da doença bem como das interações planta-patógeno e vetor-patógeno estão muito avançados para a doença de Pierce (PD), doença causada pela X. fastidiosa em videiras nos Estados Unidos. Esse avanço no conhecimento para PD ocorreu principalmente devido à obtenção de estirpes geneticamente modificadas da bactéria, permitindo a execução de estudos funcionais e de colonização. A implementação da aquisição de X. fastidiosa em sistema de dieta artificial para estudos com o vetor também foi de grande contribuição para esse avanço, uma vez que esse sistema elimina a utilização de plantas fonte para aquisição da bactéria. Em citros, sabe-se que existem fontes de resistência natural à CVC como tangerinas, tangors, limas e limões, entretanto, todas as variedades de laranja doce plantadas no Brasil são suscetíveis a essa doença. Sabe-se também que há uma resposta genética diferente entre um genótipo resistente e o suscetível quando inoculados com X. fastidiosa, porém, não se conhece como se dá a colonização in planta, e se existe uma correlação entre a resposta genética da planta e o comportamento da bactéria. Buscando melhorar o entendimento dos fatores envolvidos no patossistema CVC este trabalho teve como objetivo a obtenção de uma estirpe patogênica de X. fastidiosa de citros transformada com a proteína verde fluorescente (GFP) afim de avaliar sua colonização in planta em genótipos parentais e híbridos de citros, resistentes e suscetíveis, além da implementação da aquisição de X. fastidiosa por cigarrinhas vetores por meio do sistema de dieta artificial. A obtenção do transformante de X. fastidiosa expressando GFP permitiu o acompanhamento da colonização da bactéria nos vasos do xilema de plantas suscetíveis e resistentes e a avaliação mostrou uma colonização diferenciada entre caule e pecíolo. Também foi verificado um padrão diferencial de colonização dos caules de genótipos suscetíveis em relação aos resistentes, no qual a bactéria parece não capaz de se mover em genótipos resistentes, permanecendo aprisionada no xilema primário dessas plantas, sugerindo um possível mecanismo de resistência. A implementação da aquisição de células bacterianas em sistema de dieta artificial foi estabelecida com sucesso para vetor e estirpe de X. fastidiosa em citros, abrindo perspectivas para vários estudos na área de interação vetor-patógeno e transmissão da CVC / Abstract: The citrus agribusiness is an important segment for the country economy, contributing to employment and trade surpluses, however, it is passing through an economic crisis on behalf of the high cost of production and the low price paid by the orange box in Brazil. The main reason for the high cost of production is the high incidence of pests and diseases affecting this crop. Among the diseases, the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is caused by the bacterium Xylella fastidiosa and transmitted to its hosts by sharpshooters, and it is the disease that more damage have been causing to the citrus agribusiness in Brazil. The X. fastidiosa pathogenicity mechanism still not clear but the currently accept hypothesis is related to its facility to colonize the host, in other words, on move and multiply within the xylem vessels of an infected host, followed by the biofilm formation. The knowledge about the disease and the interactions between plant-pathogen and vector-pathogen are advanced for the Pierce disease, which is caused by X. fastidiosa on grapes in the United States. This occurs mainly on behalf of bacterial mutant¿s obtainment, allowing functional and colonization studies, besides the artificial diet system establishment for insect vectors studies, once this system eliminates the use of source plant acquisition, a limiting factor for X. fastidiosa acquisition since its colonization in host plants is random. In citrus, is known that natural resistant sources against CVC exists like tangerine, tangors, limes and lemons, while all the sweet orange varieties grown in Brazil are susceptible. Also, was verified a different genetic response between a resistant and a susceptible genotype when inoculated with X. fastidiosa, although, the colonization process in planta still unkown as well as if there is a correlation between the plant genetic response and the bacterial behavior. In order to better understand the factors involved in the CVC pathosystem, this work had the goal of obtain a pathogenic X. fastidiosa strain from citrus transformed with the green fluorescent protein (GFP) to evaluate its colonization in planta on parent and hybrid citrus genotypes, resistant and susceptible, besides de X. fastidiosa artificial acquisition by the insect vector using the artificial diet system. Was obtained a X. fastidiosa strain transformed with the GFP which allowed the bacterial colonization monitoring within the xylem vessels of resistant and susceptible plants and this evaluation showed a differential colonization of stems and petioles. Was also verified a different stem colonization pattern between resistant and susceptible genotypes on which the bacteria seems to be not able to move in resistant ones, staying contained into the primary xylem of these plants, suggesting a possible mechanism of resistance. The bacterial cells acquisition on artificial diet system was successfully established using a citrus insect vector and bacterial strain, opening perspectives for various studies on vector-pathogen interaction and transmission of CVC / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.

X. fastidiosa é uma bactéria fitopatogênica limitada ao xilema, que tem afetado um grande número de plantas no Brasil e no mundo. Muitos trabalhos já foram realizados sobre esta bactéria, mas pouco se conhece a respeito da adesão, colonização e expressão dos sintomas. Os objetivos deste trabalho foram: a) através do uso da microscopia eletrônica e de luz, determinar e relacionar o número de vasos colonizados de citros, cafeeiro e ameixeira com a sintomatologia em folhas; b) estudar a adesão, migração radial e colonização dos vasos do xilema do pecíolo de folhas de citros pela bactéria; c) estudar algumas variáveis experimentais que afetam a expressão dos sintomas em fumo; d) verificar os sítios de ligação da bactéria em cigarrinhas vetores; e) estudar a adesão e a formação do biofilme por X. fastidiosa em superfície de poliestireno, como uma nova metodologia. Os resultados mostraram em ameixeira e cafeeiro uma relação entre o número de vasos colonizados e a expressão de sintomas necróticos, relação esta que não pode ser observada para citros, o qual apresentava um número de vasos colonizados do pecíolo bem menor que o das outras duas espécies. No estudo da bactéria nos vaso do xilema de citros foi possível verificar as diversas fases do processo de colonização do xilema, bem como a capacidade da bactéria em degradar a parede celular primária da pontuação e migrar para os vasos adjacentes. Neste estudo foi também possível verificar respostas da planta à bactérias caracterizadas pela produção de cristais no lúmen dos vasos do xilema e o acúmulo de goma e hiperplasia de células nas folhas. No estudo com variedades de fumo verificou-se que a cultivar Havana apresentou expressão de sintomas mais intensa que as variedades TNN e RP1 e que o aparecimento dos mesmos não foi influenciado pelo volume de inóculo e pelo local de inoculação, mas sim pela adubação com sulfato de amônio, a qual retardou o aparecimento dos sintomas e reverteu os sintomas inicias em folhas após a aplicação. Em cigarrinhas, células bacterianas com morfologia similar as de X. fastidiosa, foram visualizadas aderidas pela parte lateral na câmara do cibário (sulco longitudinal, parede lateral e membrana do diafragma) de Acrogonia citrina, e Oncometopia facialis, no canal do apodeme de Dilobopterus costalimai e pela parte polar no precibário de O. facialis. Finalmente, no estudo da adesão de X. fastidiosa a película de poliestireno, os resultados revelaram as várias fases da formação do biofilme, aspectos da sua arquitetura, e indicaram que a técnica é uma ferramenta adequada para o estudo da formação do biofilme e também da morfologia das bactérias. Os resultados são discutidos em termos de modelos de adesão e colonização, da bactéria e importância para o conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da bactéria em plantas e transmissão pelos vetores. / X. fastidiosa is a xylem-limited bacterium that has been affecting a high number of plants in Brazil and in the world. A lot of researches were already accomplished on this bacterium, but little is known regarding the adhesion, colonization and expression of the symptoms in plants. The objectives of this work were: a) through the use of electron microscopy and of light microscopy determine and to correlate the number of xylem colonized vessels of petiole of sweet orange, coffee and plum with chlorosis and leaf scorching in leaves; b) study the adhesion, radial migration and colonization of the vessels of the petiole xylem of sweet orange by the bacterium; c) study some experimental variables that affect the expression of symptoms in tobacco; d) verify the retention sites of the bacterium in sharpshooters; d) study the adhesion and biofilm formation by X. fastidiosa on polystyrene surface. The results showed a relationship between the number of colonized vessels in plum and coffee and the expression of necrotic symptoms. However, that relationship was not observed for sweet orange, which presented a number of colonized vessels smaller than the other two species. In the study of the bacterium in the xylem vessels of sweet orange it was possible to verify the several phases of the colonization process of the xylem as well as the ability of the bacterium to degrade the primary cell wall of the pit and migrate to adjacent vessels. It was also possible to verify responses of the plant to the bacterium characterized by the production of crystals in the lumen of the xylem vessels and gum accumulation and hyperplasia in the leaf cells. Regarding the tobacco varieties it was verified that the expression of symptoms is more intense in the cultivar Havana than in the cultivars TNN and RP1. It was also seen that symptoms expression was not influenced by the inoculum volume or the inoculation place, but it was altered by fertilization with ammonium sulfate, which delayed the beginning of the symptoms and reverted the symptoms in leaves after the application. In sharpshooters, bacterial cells exhibiting morphology similar to X. fastidiosa were visualized attached to the lateral side in the cibarium camera (longitudinal, lateral wall and membrane of the diaphragm) of Acrogonia citrina, and Oncometopia facialis, in the apodemal channel of Dilobopterus costalimai, and in the polar part in the pre-cibarium of O. facialis. Finally, in the study of the adhesion of X. fastidiosa on polystyrene surface, the results revealed the several phases of biofilm formation; aspects of its architecture, and it also indicated that the technique is an appropriate tool to study of the formation of biofilms and also of the bacterial morphology. The results are discussed regarding adhesion models, colonization, and distribution of the bacterium in the plant and the importance of knowing the pathogenicity mechanisms of X. fastidiosa and its transmission by the insect vectors.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, não flagelada, agente causal de doenças de importância econômica como a doença de Pierce nas videiras e a clorose variegada dos citros (CVC) nas laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises in silico das sequências promotoras dos genes deste fitopatógeno em uma tentativa de arrecadar novas evidências para o melhor entendimento da dinâmica de regulação transcricional de seus genes, incluindo aqueles envolvidos em mecanismos de patogenicidade e virulência. Para tanto, duas estratégias foram utilizadas para predição de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras do genoma da cepa referência 9a5c, comprovadamente associada à CVC. A primeira, conhecida como phylogenetic footprinting, foi empregada para identificação de elementos regulatórios conservados em promotores de unidades transcricionais ortólogas, levando em consideração o conjunto de genes de X. fastidiosa e 7 espécies comparativas. O critério para identificação de unidades transcricionais ortólogas, isto é, unidades trancricionais oriundas de espécies distintas e cujos promotores compartilham elementos cis-regulatórios, foi paralelamente estudado utilizando-se informações regulatórias das bactérias modelos: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Os resultados obtidos com análise de phylogenetic footprinting nos permitiu acessar a rede regulatória transcricional da espécie de forma compreensiva (global). Foram estabelecidas 2990 interações regulatórias, compreendendo 80 motivos distribuídos nos promotores de 56.8% das unidades transcricionais do genoma de X. fastidiosa. Na segunda estratégia recuperamos informações regulatórias experimentalmente validadas em E. coli e complementamos o conhecimento de dez regulons de X. fastidiosa, através de uma metodologia de scanning (varredura), dos quais algumas interações regulatórias já haviam sido previamente descritas por outros trabalhos. Destacamos os regulons de Fur e CRP, reguladores transcricionais globais, que se mostraram responsáveis pela modulação de genes relacionados a mecanismos de invasão e colonização do hospedeiro vegetal entre outros. Por fim, análises comparativas em regiões regulatórias correspondentes entre cepas foram realizadas e diferenças possivelmente associadas a particularidades fenotípicas foram identificadas entre 9a5c e J1a12, um isolado de citros não virulento, e 9a5c e Temecula1, um isolado de videira causador da doença de Pierce. / Xylella fastidiosa is a gram-negative, non-flagellated bacterium responsible for causing economically important diseases such as Pierce\'s disease in grapevines and Citrus Variegated Clorosis (CVC) in sweet orange trees. In the present work we performed in silico analysis on promoter sequences of protein-coding genes from this phytopathogen, including those involved in virulence and pathogenic mechanisms, in an attempt to better understand the underlying transcriptional regulatory dynamics. Two strategies for cis-regulatory elements prediction were applied on promoter sequences from 9a5c strain genome, a proven causal agent of CVC. The first one, known as phylogenetic footprinting, involved the prediction of regulatory motifs conserved on promoter sequences of orthologous transcription units from X. fastidiosa and a set of 7 comparatives species. The criteria to identify orthologous transcription units, i. e., those from different species and whose promoter sequences share at least one common regulatory motif, was studied based on regulatory information available for model organisms: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The results obtained with the phylogenetic footprinting analysis permitted us to access the underlying transcriptional regulatory network from the species in a comprehensive manner (genome-wide), with a total of 2990 regulatory interactions corresponding to 80 predicted motifs distributed on promoter sequences of 56.8% of all transcription units. In the second strategy regulatory information from E. coli was recovered and used to expand the knowledge of ten regulons in X. fastidiosa, through a scanning process, of which some regulatory interactions were previously described by independent studies. We emphasize some genes related to host invasion and colonization present in the Fur and CRP regulons, two global transcription regulators. Lastly, comparative analysis on corresponding regulatory regions among strains were performed and differences possibly associated to phenotypic variation were identified between 9a5c and J1a12, a non-virulent strain isolated from orange trees, and between 9a5c and Temecula1, a strain associated to Pierce\'s disease on grapevines.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, não flagelada, agente causal de doenças de importância econômica como a doença de Pierce nas videiras e a clorose variegada dos citros (CVC) nas laranjeiras. O objetivo do presente trabalho foi realizar análises in silico das sequências promotoras dos genes deste fitopatógeno em uma tentativa de arrecadar novas evidências para o melhor entendimento da dinâmica de regulação transcricional de seus genes, incluindo aqueles envolvidos em mecanismos de patogenicidade e virulência. Para tanto, duas estratégias foram utilizadas para predição de elementos cis-regulatórios em regiões promotoras do genoma da cepa referência 9a5c, comprovadamente associada à CVC. A primeira, conhecida como phylogenetic footprinting, foi empregada para identificação de elementos regulatórios conservados em promotores de unidades transcricionais ortólogas, levando em consideração o conjunto de genes de X. fastidiosa e 7 espécies comparativas. O critério para identificação de unidades transcricionais ortólogas, isto é, unidades trancricionais oriundas de espécies distintas e cujos promotores compartilham elementos cis-regulatórios, foi paralelamente estudado utilizando-se informações regulatórias das bactérias modelos: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Os resultados obtidos com análise de phylogenetic footprinting nos permitiu acessar a rede regulatória transcricional da espécie de forma compreensiva (global). Foram estabelecidas 2990 interações regulatórias, compreendendo 80 motivos distribuídos nos promotores de 56.8% das unidades transcricionais do genoma de X. fastidiosa. Na segunda estratégia recuperamos informações regulatórias experimentalmente validadas em E. coli e complementamos o conhecimento de dez regulons de X. fastidiosa, através de uma metodologia de scanning (varredura), dos quais algumas interações regulatórias já haviam sido previamente descritas por outros trabalhos. Destacamos os regulons de Fur e CRP, reguladores transcricionais globais, que se mostraram responsáveis pela modulação de genes relacionados a mecanismos de invasão e colonização do hospedeiro vegetal entre outros. Por fim, análises comparativas em regiões regulatórias correspondentes entre cepas foram realizadas e diferenças possivelmente associadas a particularidades fenotípicas foram identificadas entre 9a5c e J1a12, um isolado de citros não virulento, e 9a5c e Temecula1, um isolado de videira causador da doença de Pierce. / Xylella fastidiosa is a gram-negative, non-flagellated bacterium responsible for causing economically important diseases such as Pierce\'s disease in grapevines and Citrus Variegated Clorosis (CVC) in sweet orange trees. In the present work we performed in silico analysis on promoter sequences of protein-coding genes from this phytopathogen, including those involved in virulence and pathogenic mechanisms, in an attempt to better understand the underlying transcriptional regulatory dynamics. Two strategies for cis-regulatory elements prediction were applied on promoter sequences from 9a5c strain genome, a proven causal agent of CVC. The first one, known as phylogenetic footprinting, involved the prediction of regulatory motifs conserved on promoter sequences of orthologous transcription units from X. fastidiosa and a set of 7 comparatives species. The criteria to identify orthologous transcription units, i. e., those from different species and whose promoter sequences share at least one common regulatory motif, was studied based on regulatory information available for model organisms: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Escherichia coli. The results obtained with the phylogenetic footprinting analysis permitted us to access the underlying transcriptional regulatory network from the species in a comprehensive manner (genome-wide), with a total of 2990 regulatory interactions corresponding to 80 predicted motifs distributed on promoter sequences of 56.8% of all transcription units. In the second strategy regulatory information from E. coli was recovered and used to expand the knowledge of ten regulons in X. fastidiosa, through a scanning process, of which some regulatory interactions were previously described by independent studies. We emphasize some genes related to host invasion and colonization present in the Fur and CRP regulons, two global transcription regulators. Lastly, comparative analysis on corresponding regulatory regions among strains were performed and differences possibly associated to phenotypic variation were identified between 9a5c and J1a12, a non-virulent strain isolated from orange trees, and between 9a5c and Temecula1, a strain associated to Pierce\'s disease on grapevines.