<p>The existence of immune self-tolerance allows the immune system to mount responses against infectious agents, but not against self-molecular constitutes. Although self-tolerance is a robust phenomenon, in some individuals as well as in experimental models, the self-tolerance breaks down and as a result, a self-destructive autoimmune disease emerges. The underlying mechanisms for the development of autoimmune diseases are not known, but genetic, environmental and immunological factors are suggested to be involved. In this thesis, we used murine mercury-induced autoimmunity to test this suggestion.</p><p>In susceptible mice mercuric chloride induces a systemic autoimmune disease characterized by increased serum levels of IgG1 and IgE, production of anti-nucleolar autoantibodies (ANolA) and formation of renal IgG deposits. In contrast, in resistant DBA/2 (H-2^d) mice, none of these characteristics develop after exposure to mercury. By crossing and backcrossing mercury-resistant DBA/2 mice to mercury susceptible strains, we found that the resistance was inherited as a dominant trait in F1 hybrids and that one gene or a cluster of genes located in the H-2 loci determined the resistance to ANolA production, whereas resistance to the other characteristics was found to be controlled by two or three non-H-2 genes.</p><p>We further put forward the “cryptic peptide hypothesis” to investigate whether mercury and another xenobiotic metal use similar pathway(s) to induce the H-2 linked production of ANolA. We found that while mercury stimulated ANolA synthesis in all H-2 susceptible (H-2^s, H-2^q and H-2^f) mouse strains, silver induced only ANolA responses in H-2^s and H-2^q mice, but not in H-2^fmice. Further studies showed that the resistance to silver-induced ANolA production in H-2^fmice was inherited as a dominant trait.</p><p>We next tested the proposition that mercury induces more adverse immunological effects in mouse strains, which are genetically prone to develop autoimmune diseases, using tight-skin 1 mice, an animal model for human Scleroderma. It was found that in this strain, mercury induced a strong immune activation with autoimmune characteristics, but did not accelerate the development of dermal fibrosis, a characteristic in Tsk/1 mice.</p><p>Finally we addressed the Th1/Th2 cross-regulation paradigm by examining if a Th1-type of response could interact with a Th2-type of response if simultaneous induced in susceptible mice. Our findings demonstrated that mercury-induced autoimmunity (Th2-type) and collagen-induced arthritis (CIA) (Th1-type) can interact in a synergistic, antagonistic or additive fashion, depending on at which stage of CIA mercury is administered.</p>

The existence of immune self-tolerance allows the immune system to mount responses against infectious agents, but not against self-molecular constitutes. Although self-tolerance is a robust phenomenon, in some individuals as well as in experimental models, the self-tolerance breaks down and as a result, a self-destructive autoimmune disease emerges. The underlying mechanisms for the development of autoimmune diseases are not known, but genetic, environmental and immunological factors are suggested to be involved. In this thesis, we used murine mercury-induced autoimmunity to test this suggestion. In susceptible mice mercuric chloride induces a systemic autoimmune disease characterized by increased serum levels of IgG1 and IgE, production of anti-nucleolar autoantibodies (ANolA) and formation of renal IgG deposits. In contrast, in resistant DBA/2 (H-2d) mice, none of these characteristics develop after exposure to mercury. By crossing and backcrossing mercury-resistant DBA/2 mice to mercury susceptible strains, we found that the resistance was inherited as a dominant trait in F1 hybrids and that one gene or a cluster of genes located in the H-2 loci determined the resistance to ANolA production, whereas resistance to the other characteristics was found to be controlled by two or three non-H-2 genes. We further put forward the “cryptic peptide hypothesis” to investigate whether mercury and another xenobiotic metal use similar pathway(s) to induce the H-2 linked production of ANolA. We found that while mercury stimulated ANolA synthesis in all H-2 susceptible (H-2s, H-2q and H-2f) mouse strains, silver induced only ANolA responses in H-2s and H-2q mice, but not in H-2f mice. Further studies showed that the resistance to silver-induced ANolA production in H-2f mice was inherited as a dominant trait. We next tested the proposition that mercury induces more adverse immunological effects in mouse strains, which are genetically prone to develop autoimmune diseases, using tight-skin 1 mice, an animal model for human Scleroderma. It was found that in this strain, mercury induced a strong immune activation with autoimmune characteristics, but did not accelerate the development of dermal fibrosis, a characteristic in Tsk/1 mice. Finally we addressed the Th1/Th2 cross-regulation paradigm by examining if a Th1-type of response could interact with a Th2-type of response if simultaneous induced in susceptible mice. Our findings demonstrated that mercury-induced autoimmunity (Th2-type) and collagen-induced arthritis (CIA) (Th1-type) can interact in a synergistic, antagonistic or additive fashion, depending on at which stage of CIA mercury is administered.

Glucocorticoids are effective immunosuppressive and anti-inflammatory agents, but some aspects of stress appear to be proinflammatory. This study investigates this apparent paradox as it applies to stress exposure and the development of arthritis in a rat strain that has subnormal hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) responsiveness. Female Lewis rats were subjected to 1 week of rotating, psychological stressors for 5 h daily, beginning 7 days following inoculation with type [I collagen. The collagen-induced arthritis (CIA) group exposed lo stress showed reduced ankle width increase (p < 0.001) and decreased hindlimb severity scores (p < 0.001). At sacrifice, 2 days following stress termination, no differences in either measure remained and there was no difference in hind paw volume. However, the area of the tibia invaded by stroma, as quantitated by image analysis, was reduced in the stressed rats (p < 0.05). In animals exposed to stress, adrenal weights were increased (p < 0.005) and plasma corticosterone levels were elevated at sacrifice (p < 0.02). Both injected groups had significantly larger adrenal (p < 0.005) and lower thymus weights (p < 0.05) than did uninjected controls. Likewise, both CIA groups had reduced glucocorticoid receptor immunoreactivity in synovial membranes compared to controls (p < 0.001), suggesting that the Lewis rat's HPA deficiency may be intensified by glucocorticoid receptor downregulation during the induction of CIA. These data indicate that the responsiveness of the HPA axis to psychological stress in this strain is sufficient to alter disease progression.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20971号 / 医博第4317号 / 新制||医||1026(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 濵﨑 洋子, 教授 松田 秀一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Base teórica: A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica onde a inflamação crônica da sinóvia articular e a subsequente erosão óssea e da cartilagem resultam em destruição articular, dor e incapacidade funcional. Apesar dos recentes progressos no tratamento da AR, estes ainda apresentam limitações e significativos efeitos adversos, salientando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Plantas da família das Amarilidáceas apresentam em seus bulbos um conjunto de alcaloides muito característicos e exclusivos com atividades farmacológicas, tais como atividade antiviral, anti-inflamatória e atividade anticolinérgica. A montanina é um alcaloide isolado da Rhodophiala bífida, uma planta da família das amarilidáceas utilizada na medicina popular, mas nunca antes testada como terapia para doenças inflamatórias. Objetivo: Avaliar o efeito da montanina como uma terapia anti-inflamatória in vivo em dois modelos de artrite e in vitro sobre a proliferação de linfócitos e sobre a invasão de fibroblastos sinoviais (FLS). Métodos: Artrite induzida por antígeno (AIA) foi realizada em camundongos Balb/C com albumina bovina sérica metilada e a nocicepção e a migração de leucócitos para a articulação do joelho foram os parâmetros avaliados. Artrite induzida por colágeno (CIA) foi realizada em camundongos DBA/1J e o desenvolvimento e severidade da artrite foi avaliado através de escore clínico, nocicepção articular e escore histológico. Montanina foi administrada via intraperitoneal, duas vezes ao dia. A proliferação de linfócitos estimulados por concanavalina A (conA) foi realizada pelo método de MTT e invasão de FLS em 24 horas foi avaliada em um sistema de insertos de Matrigel. Resutados: A administração de montanina diminuiu a migração articular de leucócitos (p0,001) e a nocicepção (p0,01) em camundongos com AIA. Em camundongos com CIA, o tratamento com montanina reduziu a severidade da artrite e o dano articular avaliado pelos escores clínico (p0,01) e histológico (p0,05) e melhorou a nocicepção articular (p0,05), sem causar nenhum dano hepático. Além disso, montanina inibiu in vitro a proliferação de linfócitos estimulados com conA (p0,01) e diminuiu a invasão de FLS (p0,05) em 54%, com uma ação independente de citotoxicidade. Conclusão: Esses resultados indicam que a montanina pode ser explorada para se tornar um possível fármaco para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, como a AR. / Background: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune and systemic disease where the chronic inflammation of articular synovia and the subsequent bone and cartilage erosion results in joint destruction, pain and functional disability. Despite recent progress in RA treatments, its still have limitations and significant side effects, emphasizing the need of new therapeutic strategies. Amaryllidaceae plants presenting at its bulbs a set of very characteristics and exclusives alkaloids with pharmacological activities such as antiviral, anti-inflammatory and anticholinergic activity. Montanine is an alkaloid isolated from the Rhodophiala bifida, an Amaryllidaceae plant used in alternative medicine but never before tested as a therapy for inflammatory diseases. Objective: To evaluate the effect of montanine as an in vivo anti-inflammatory therapy in two arthritis models and in vitro on lymphocytes proliferation and fibroblast-like synoviocytes (FLS) invasion. Methods: Antigen-induced arthritis (AIA) was performed in Balb/C mice with methylated bovine serum albumin and nociception and leukocytes migration into the knee joint were evaluated. Collagen-induced arthritis (CIA) was performed in DBA/1J mice and arthritis development and severity were assessed by clinical scoring, articular nociception and histological scoring. Montanine was administered intraperitoneally twice a day. Lymphocyte proliferation stimulated by concanavalin A in 48 hours was performed with MTT assay and FLS invasion in 24 hours was assayed in a Matrigel-coated transwell system. Results: Administration of montanine decreased leukocyte articular migration (p0.001) and nociception (p0.01) in mice with AIA. In mice with CIA, treatment with montanine reduced severity of arthritis and joint damage assessed by clinical (p0.01) and histological score (p0.05) and ameliorates articular nociception (p0.05), without causing any hepatic damage. Moreover, montanine inhibited in vitro lymphocyte proliferation stimulated with ConA (p0.01) and decreased FLS invasion by 54% (p0.05), with an action independent of cytotoxicity. Conclusion: These findings suggest that montanine can be explored to become a possible medicament to treat inflammatory and autoimmune diseases such as arthritis.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica, inflamatória, sistêmica, com manifestações autoimunes articulares e extra-articulares, como fraqueza e atrofia muscular. Apesar de terem profundo impacto funcional, os mecanismos envolvidos nesses processos em músculo esquelético têm sido pouco estudados. O objetivo desse trabalho foi descrever o envolvimento muscular e vias moleculares em um modelo experimental de artrite e em um modelo de atrofia por desuso. Ratas Wistar, 8-12 semanas foram separadas em três grupos: controle (CO), imobilizado com bota de cobre (IM) e artrite induzida por colágeno bovino tipo II (CIA). A locomoção espontânea e o peso dos animais foram avaliados semanalmente. As articulações tíbio-társicas e os músculos gastrocnêmicos foram processados e corados com hematoxilina-eosina (HE). Imunoblot foi realizado para quantificar MuRF- 1, miogenina e anti-LC3. O nível de significância foi considerado quando p<0,05. A análise histológica das articulações confirmou a severidade da doença. Na locomoção espontânea houve uma diferença significativa na distância, velocidade, número de vezes em pé e número de descanso com redução no grupo CIA, quando comparado ao grupo controle, de 90%, 90%, 75% e aumento de 70%, respectivamente. O peso corporal total, o peso do músculo gastrocnêmio, e o peso relativo do músculo reduziram 20%, 30% e 20% nos animais CIA, quando comparado ao grupo controle. A análise histopatológica identificou no músculo de CIA: atrofia de fibras perifasciculares, infiltrado inflamatório, fibras atróficas do tipo 2 e edema. A área seccional da miofibra estava reduzida em torno de 30% no grupo CIA e 60% no IM. Na quantificação proteína demonstrou aumento da expressão em 70% das proteínas MuRF-1 e miogenina no grupo CIA quando comparado ao grupo controle, resultado não observado em IM. Na quantificação da proteína LC3 não houve diferença entre os grupos. Esse estudo demonstrou que o desenvolvimento da artrite experimental está associado com perda de peso e da mobilidade, atrofia muscular e degradação muscular nesses animais. Pela primeira vez foi demonstrado que a atrofia muscular na artrite está associada com a própria doença e não com a imobilidade, visto que o grupo IM, apesar de atrofia mais muscular mais marcada, não apresentou ativação das vias de atrofia (MuRF-1 e miogenina) que foram observadas no grupo CIA. / Objective: Although causing great functional impact, the mechanisms of muscle wasting in RA have been poorly studied. The objective of this study is to describe the muscular involvement in an experimental model of arthritis and its pathways and compare with disuse atrophy. Methods: Female Wistar rats were separated in three groups: control (CO), collageninduced arthritis (CIA) and immobilized (IM). Spontaneous locomotion and weight were evaluated weekly. Gastrocnemius muscle was evaluated by histology and immunoblotting to measure LC3, MuRF-1 and myogenin expression. Significance was considered at p<0.05 level. Results: Histological analysis of the joint confirmed the severity of the arthropathy. There was significant difference in spontaneous locomotion (distance, velocity, number of times standing and number of times resting) in CIA group. Animal body weight, gastrocnemius muscle weight and relative muscle weight decreased 20%, 30% and 20% in CIA rats. Inflammatory infiltration, swelling and type 2 fiber atrophy was present in CIA gastrocnemius muscles, with reduced cross-sectional area by 30%, and 60% in IM. Imunoblotting analysis demonstrated increased expression of myogenin and MuRF-1 in CIA muscles by about 70%, while in IM remained similar to control. Conclusions: This study demonstrated that the development of experimental arthritis is associated to decreased mobility, weight loss, muscle atrophy, increased expression of markers of muscle proteolysis and regeneration. For the first time it is demonstrated that muscle atrophy in arthritis is associated with the disease itself, and not simply due to decreased mobility, since immobilized group presented no activation of the same atrophy pathways.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica, inflamatória, sistêmica, com manifestações autoimunes articulares e extra-articulares, como fraqueza e atrofia muscular. Apesar de terem profundo impacto funcional, os mecanismos envolvidos nesses processos em músculo esquelético têm sido pouco estudados. O objetivo desse trabalho foi descrever o envolvimento muscular e vias moleculares em um modelo experimental de artrite e em um modelo de atrofia por desuso. Ratas Wistar, 8-12 semanas foram separadas em três grupos: controle (CO), imobilizado com bota de cobre (IM) e artrite induzida por colágeno bovino tipo II (CIA). A locomoção espontânea e o peso dos animais foram avaliados semanalmente. As articulações tíbio-társicas e os músculos gastrocnêmicos foram processados e corados com hematoxilina-eosina (HE). Imunoblot foi realizado para quantificar MuRF- 1, miogenina e anti-LC3. O nível de significância foi considerado quando p<0,05. A análise histológica das articulações confirmou a severidade da doença. Na locomoção espontânea houve uma diferença significativa na distância, velocidade, número de vezes em pé e número de descanso com redução no grupo CIA, quando comparado ao grupo controle, de 90%, 90%, 75% e aumento de 70%, respectivamente. O peso corporal total, o peso do músculo gastrocnêmio, e o peso relativo do músculo reduziram 20%, 30% e 20% nos animais CIA, quando comparado ao grupo controle. A análise histopatológica identificou no músculo de CIA: atrofia de fibras perifasciculares, infiltrado inflamatório, fibras atróficas do tipo 2 e edema. A área seccional da miofibra estava reduzida em torno de 30% no grupo CIA e 60% no IM. Na quantificação proteína demonstrou aumento da expressão em 70% das proteínas MuRF-1 e miogenina no grupo CIA quando comparado ao grupo controle, resultado não observado em IM. Na quantificação da proteína LC3 não houve diferença entre os grupos. Esse estudo demonstrou que o desenvolvimento da artrite experimental está associado com perda de peso e da mobilidade, atrofia muscular e degradação muscular nesses animais. Pela primeira vez foi demonstrado que a atrofia muscular na artrite está associada com a própria doença e não com a imobilidade, visto que o grupo IM, apesar de atrofia mais muscular mais marcada, não apresentou ativação das vias de atrofia (MuRF-1 e miogenina) que foram observadas no grupo CIA. / Objective: Although causing great functional impact, the mechanisms of muscle wasting in RA have been poorly studied. The objective of this study is to describe the muscular involvement in an experimental model of arthritis and its pathways and compare with disuse atrophy. Methods: Female Wistar rats were separated in three groups: control (CO), collageninduced arthritis (CIA) and immobilized (IM). Spontaneous locomotion and weight were evaluated weekly. Gastrocnemius muscle was evaluated by histology and immunoblotting to measure LC3, MuRF-1 and myogenin expression. Significance was considered at p<0.05 level. Results: Histological analysis of the joint confirmed the severity of the arthropathy. There was significant difference in spontaneous locomotion (distance, velocity, number of times standing and number of times resting) in CIA group. Animal body weight, gastrocnemius muscle weight and relative muscle weight decreased 20%, 30% and 20% in CIA rats. Inflammatory infiltration, swelling and type 2 fiber atrophy was present in CIA gastrocnemius muscles, with reduced cross-sectional area by 30%, and 60% in IM. Imunoblotting analysis demonstrated increased expression of myogenin and MuRF-1 in CIA muscles by about 70%, while in IM remained similar to control. Conclusions: This study demonstrated that the development of experimental arthritis is associated to decreased mobility, weight loss, muscle atrophy, increased expression of markers of muscle proteolysis and regeneration. For the first time it is demonstrated that muscle atrophy in arthritis is associated with the disease itself, and not simply due to decreased mobility, since immobilized group presented no activation of the same atrophy pathways.

Base teórica: A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica onde a inflamação crônica da sinóvia articular e a subsequente erosão óssea e da cartilagem resultam em destruição articular, dor e incapacidade funcional. Apesar dos recentes progressos no tratamento da AR, estes ainda apresentam limitações e significativos efeitos adversos, salientando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Plantas da família das Amarilidáceas apresentam em seus bulbos um conjunto de alcaloides muito característicos e exclusivos com atividades farmacológicas, tais como atividade antiviral, anti-inflamatória e atividade anticolinérgica. A montanina é um alcaloide isolado da Rhodophiala bífida, uma planta da família das amarilidáceas utilizada na medicina popular, mas nunca antes testada como terapia para doenças inflamatórias. Objetivo: Avaliar o efeito da montanina como uma terapia anti-inflamatória in vivo em dois modelos de artrite e in vitro sobre a proliferação de linfócitos e sobre a invasão de fibroblastos sinoviais (FLS). Métodos: Artrite induzida por antígeno (AIA) foi realizada em camundongos Balb/C com albumina bovina sérica metilada e a nocicepção e a migração de leucócitos para a articulação do joelho foram os parâmetros avaliados. Artrite induzida por colágeno (CIA) foi realizada em camundongos DBA/1J e o desenvolvimento e severidade da artrite foi avaliado através de escore clínico, nocicepção articular e escore histológico. Montanina foi administrada via intraperitoneal, duas vezes ao dia. A proliferação de linfócitos estimulados por concanavalina A (conA) foi realizada pelo método de MTT e invasão de FLS em 24 horas foi avaliada em um sistema de insertos de Matrigel. Resutados: A administração de montanina diminuiu a migração articular de leucócitos (p0,001) e a nocicepção (p0,01) em camundongos com AIA. Em camundongos com CIA, o tratamento com montanina reduziu a severidade da artrite e o dano articular avaliado pelos escores clínico (p0,01) e histológico (p0,05) e melhorou a nocicepção articular (p0,05), sem causar nenhum dano hepático. Além disso, montanina inibiu in vitro a proliferação de linfócitos estimulados com conA (p0,01) e diminuiu a invasão de FLS (p0,05) em 54%, com uma ação independente de citotoxicidade. Conclusão: Esses resultados indicam que a montanina pode ser explorada para se tornar um possível fármaco para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, como a AR. / Background: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune and systemic disease where the chronic inflammation of articular synovia and the subsequent bone and cartilage erosion results in joint destruction, pain and functional disability. Despite recent progress in RA treatments, its still have limitations and significant side effects, emphasizing the need of new therapeutic strategies. Amaryllidaceae plants presenting at its bulbs a set of very characteristics and exclusives alkaloids with pharmacological activities such as antiviral, anti-inflammatory and anticholinergic activity. Montanine is an alkaloid isolated from the Rhodophiala bifida, an Amaryllidaceae plant used in alternative medicine but never before tested as a therapy for inflammatory diseases. Objective: To evaluate the effect of montanine as an in vivo anti-inflammatory therapy in two arthritis models and in vitro on lymphocytes proliferation and fibroblast-like synoviocytes (FLS) invasion. Methods: Antigen-induced arthritis (AIA) was performed in Balb/C mice with methylated bovine serum albumin and nociception and leukocytes migration into the knee joint were evaluated. Collagen-induced arthritis (CIA) was performed in DBA/1J mice and arthritis development and severity were assessed by clinical scoring, articular nociception and histological scoring. Montanine was administered intraperitoneally twice a day. Lymphocyte proliferation stimulated by concanavalin A in 48 hours was performed with MTT assay and FLS invasion in 24 hours was assayed in a Matrigel-coated transwell system. Results: Administration of montanine decreased leukocyte articular migration (p0.001) and nociception (p0.01) in mice with AIA. In mice with CIA, treatment with montanine reduced severity of arthritis and joint damage assessed by clinical (p0.01) and histological score (p0.05) and ameliorates articular nociception (p0.05), without causing any hepatic damage. Moreover, montanine inhibited in vitro lymphocyte proliferation stimulated with ConA (p0.01) and decreased FLS invasion by 54% (p0.05), with an action independent of cytotoxicity. Conclusion: These findings suggest that montanine can be explored to become a possible medicament to treat inflammatory and autoimmune diseases such as arthritis.

Base teórica: A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune sistêmica onde a inflamação crônica da sinóvia articular e a subsequente erosão óssea e da cartilagem resultam em destruição articular, dor e incapacidade funcional. Apesar dos recentes progressos no tratamento da AR, estes ainda apresentam limitações e significativos efeitos adversos, salientando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Plantas da família das Amarilidáceas apresentam em seus bulbos um conjunto de alcaloides muito característicos e exclusivos com atividades farmacológicas, tais como atividade antiviral, anti-inflamatória e atividade anticolinérgica. A montanina é um alcaloide isolado da Rhodophiala bífida, uma planta da família das amarilidáceas utilizada na medicina popular, mas nunca antes testada como terapia para doenças inflamatórias. Objetivo: Avaliar o efeito da montanina como uma terapia anti-inflamatória in vivo em dois modelos de artrite e in vitro sobre a proliferação de linfócitos e sobre a invasão de fibroblastos sinoviais (FLS). Métodos: Artrite induzida por antígeno (AIA) foi realizada em camundongos Balb/C com albumina bovina sérica metilada e a nocicepção e a migração de leucócitos para a articulação do joelho foram os parâmetros avaliados. Artrite induzida por colágeno (CIA) foi realizada em camundongos DBA/1J e o desenvolvimento e severidade da artrite foi avaliado através de escore clínico, nocicepção articular e escore histológico. Montanina foi administrada via intraperitoneal, duas vezes ao dia. A proliferação de linfócitos estimulados por concanavalina A (conA) foi realizada pelo método de MTT e invasão de FLS em 24 horas foi avaliada em um sistema de insertos de Matrigel. Resutados: A administração de montanina diminuiu a migração articular de leucócitos (p0,001) e a nocicepção (p0,01) em camundongos com AIA. Em camundongos com CIA, o tratamento com montanina reduziu a severidade da artrite e o dano articular avaliado pelos escores clínico (p0,01) e histológico (p0,05) e melhorou a nocicepção articular (p0,05), sem causar nenhum dano hepático. Além disso, montanina inibiu in vitro a proliferação de linfócitos estimulados com conA (p0,01) e diminuiu a invasão de FLS (p0,05) em 54%, com uma ação independente de citotoxicidade. Conclusão: Esses resultados indicam que a montanina pode ser explorada para se tornar um possível fármaco para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, como a AR. / Background: Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune and systemic disease where the chronic inflammation of articular synovia and the subsequent bone and cartilage erosion results in joint destruction, pain and functional disability. Despite recent progress in RA treatments, its still have limitations and significant side effects, emphasizing the need of new therapeutic strategies. Amaryllidaceae plants presenting at its bulbs a set of very characteristics and exclusives alkaloids with pharmacological activities such as antiviral, anti-inflammatory and anticholinergic activity. Montanine is an alkaloid isolated from the Rhodophiala bifida, an Amaryllidaceae plant used in alternative medicine but never before tested as a therapy for inflammatory diseases. Objective: To evaluate the effect of montanine as an in vivo anti-inflammatory therapy in two arthritis models and in vitro on lymphocytes proliferation and fibroblast-like synoviocytes (FLS) invasion. Methods: Antigen-induced arthritis (AIA) was performed in Balb/C mice with methylated bovine serum albumin and nociception and leukocytes migration into the knee joint were evaluated. Collagen-induced arthritis (CIA) was performed in DBA/1J mice and arthritis development and severity were assessed by clinical scoring, articular nociception and histological scoring. Montanine was administered intraperitoneally twice a day. Lymphocyte proliferation stimulated by concanavalin A in 48 hours was performed with MTT assay and FLS invasion in 24 hours was assayed in a Matrigel-coated transwell system. Results: Administration of montanine decreased leukocyte articular migration (p0.001) and nociception (p0.01) in mice with AIA. In mice with CIA, treatment with montanine reduced severity of arthritis and joint damage assessed by clinical (p0.01) and histological score (p0.05) and ameliorates articular nociception (p0.05), without causing any hepatic damage. Moreover, montanine inhibited in vitro lymphocyte proliferation stimulated with ConA (p0.01) and decreased FLS invasion by 54% (p0.05), with an action independent of cytotoxicity. Conclusion: These findings suggest that montanine can be explored to become a possible medicament to treat inflammatory and autoimmune diseases such as arthritis.

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica, inflamatória, sistêmica, com manifestações autoimunes articulares e extra-articulares, como fraqueza e atrofia muscular. Apesar de terem profundo impacto funcional, os mecanismos envolvidos nesses processos em músculo esquelético têm sido pouco estudados. O objetivo desse trabalho foi descrever o envolvimento muscular e vias moleculares em um modelo experimental de artrite e em um modelo de atrofia por desuso. Ratas Wistar, 8-12 semanas foram separadas em três grupos: controle (CO), imobilizado com bota de cobre (IM) e artrite induzida por colágeno bovino tipo II (CIA). A locomoção espontânea e o peso dos animais foram avaliados semanalmente. As articulações tíbio-társicas e os músculos gastrocnêmicos foram processados e corados com hematoxilina-eosina (HE). Imunoblot foi realizado para quantificar MuRF- 1, miogenina e anti-LC3. O nível de significância foi considerado quando p<0,05. A análise histológica das articulações confirmou a severidade da doença. Na locomoção espontânea houve uma diferença significativa na distância, velocidade, número de vezes em pé e número de descanso com redução no grupo CIA, quando comparado ao grupo controle, de 90%, 90%, 75% e aumento de 70%, respectivamente. O peso corporal total, o peso do músculo gastrocnêmio, e o peso relativo do músculo reduziram 20%, 30% e 20% nos animais CIA, quando comparado ao grupo controle. A análise histopatológica identificou no músculo de CIA: atrofia de fibras perifasciculares, infiltrado inflamatório, fibras atróficas do tipo 2 e edema. A área seccional da miofibra estava reduzida em torno de 30% no grupo CIA e 60% no IM. Na quantificação proteína demonstrou aumento da expressão em 70% das proteínas MuRF-1 e miogenina no grupo CIA quando comparado ao grupo controle, resultado não observado em IM. Na quantificação da proteína LC3 não houve diferença entre os grupos. Esse estudo demonstrou que o desenvolvimento da artrite experimental está associado com perda de peso e da mobilidade, atrofia muscular e degradação muscular nesses animais. Pela primeira vez foi demonstrado que a atrofia muscular na artrite está associada com a própria doença e não com a imobilidade, visto que o grupo IM, apesar de atrofia mais muscular mais marcada, não apresentou ativação das vias de atrofia (MuRF-1 e miogenina) que foram observadas no grupo CIA. / Objective: Although causing great functional impact, the mechanisms of muscle wasting in RA have been poorly studied. The objective of this study is to describe the muscular involvement in an experimental model of arthritis and its pathways and compare with disuse atrophy. Methods: Female Wistar rats were separated in three groups: control (CO), collageninduced arthritis (CIA) and immobilized (IM). Spontaneous locomotion and weight were evaluated weekly. Gastrocnemius muscle was evaluated by histology and immunoblotting to measure LC3, MuRF-1 and myogenin expression. Significance was considered at p<0.05 level. Results: Histological analysis of the joint confirmed the severity of the arthropathy. There was significant difference in spontaneous locomotion (distance, velocity, number of times standing and number of times resting) in CIA group. Animal body weight, gastrocnemius muscle weight and relative muscle weight decreased 20%, 30% and 20% in CIA rats. Inflammatory infiltration, swelling and type 2 fiber atrophy was present in CIA gastrocnemius muscles, with reduced cross-sectional area by 30%, and 60% in IM. Imunoblotting analysis demonstrated increased expression of myogenin and MuRF-1 in CIA muscles by about 70%, while in IM remained similar to control. Conclusions: This study demonstrated that the development of experimental arthritis is associated to decreased mobility, weight loss, muscle atrophy, increased expression of markers of muscle proteolysis and regeneration. For the first time it is demonstrated that muscle atrophy in arthritis is associated with the disease itself, and not simply due to decreased mobility, since immobilized group presented no activation of the same atrophy pathways.