El trabajo llevado a cabo en esta tesis contribuye a esclarecer la relación morfo-funcional entre la actina y el complejo de Golgi. Estudios previos del laboratorio ponen de manifiesto que la actina regula no sólo la posición y morfología del complejo de Golgi en la célula (di Campli et al., 1999; Valderrama et al., 1998) sino también el transporte de proteínas desde el CG al retículo endoplasmático (transporte retrógrado; Valderrama et al., 2001). Un trabajo más reciente de nuestro grupo muestra a la Rho GTPasa Cdc42 como el componente molecular que regula los efectos del citoesqueleto de actina sobre el CG (Luna et al., 2002). En este trabajo se pone de manifiesto que Cdc42 se localiza en el CG y su activación comporta su acumulación en los laterales de las cisternas de este orgánulo. Además, la forma activa de Cdc42 (GTP-Cdc42) regula negativamente el transporte retrógrado de proteínas actuando a través de N-WASP y del complejo multiproteico Arp2/3. De estos resultados concluimos que la vía de señalización Cdc42-N-WASP-Arp2/3 que gobierna la nucleación y polimerización de actina a nivel de la membrana plasmática (Pollard y Borisy, 2003) también es funcional a nivel del complejo de Golgi. En esta Tesis nos planteamos estudiar si al igual que ocurre con Cdc42, sus efectores N-WASP y Arp2/3 se localizan también en el CG. La presencia de todos los componentes necesarios para la polimerización de actina en este orgánulo es requisito necesario para demostrar que efectivamente las membranas del CG pueden polimerizar actina.Otro de los objetivos de esta tesis era determinar de forma definitiva si Rac1 y RhoA regulaban también alguna de las etapas de la dinámica de membranas en la vía secretora temprana. Estas dos proteínas junto con Cdc42 son los miembros mejor conocidos de la familia de las Rho GTPasas. Todas ellas regulan, aunque de diferente forma, la organización del citoesqueleto de actina (Etienne-Manneville y Hall, 2002). En la actualidad son numerosos los estudios que muestran su papel como proteínas reguladoras de diferentes etapas de la vía endocítica (Ridley, 2001(a); Symons y Rusk, 2003) pero menos se conoce sobre su implicación en la vía secretora. Así pues, de los resultados expuestos en este trabajo se puede concluir que: Cdc42 es la única Rho GTPasa asociada al complejo de Golgi.La vía de señalización Cdc42/N-WASP/Arp2/3 implicada en los procesos de nucleación/polimerización de actina se localiza también en el CG y mayoritariamente en la porción cis-media.La activación de esta vía conlleva la redistribución de todos sus componentes a los laterales de las cisternas del CG donde probablemente regulan (junto con otras moléculas) los procesos de formación y/o fisión de los intermediarios de transporte retrógrado a través de la nucleación/polimerización de actina. Lo que finalmente nos indica que la cascada de señalización con actividad nucleadora/polimerizadora de actina que participa en la dinámica de membranas acontece no sólo en la membrana plasmática sino también a nivel del complejo de Golgi.

DE LA TESIS:El DAG es esencial para formar los intermediarios de transporte que se dirigen a la membrana plasmática. Sin embargo, no existen evidencias de su posible participación en las etapas tempranas de la vía secretora. Por tanto, nos centramos en averiguar la implicación del DAG en el transporte de proteínas en la zona del ER/Golgi. Para ello, utilizamos una variedad de fármacos conocidos que inhiben las enzimas responsables de la producción del DAG. Nuestros datos indican que el DAG está implicado en la formación de vesículas COPI en el compartimento temprano del Golgi, concretamente en el proceso de fisión, a través del reclutamiento de ArfGAP1. Posteriormente, estudiamos si la LPP3 (PAP2b) era una de las enzimas responsables de controlar los niveles necesarios de DAG en el cis-Golgi para la formación de las vesículas COPI y la regulación del transporte retrógrado. Para determinar el papel de la LPP3 en la regulación de los niveles de DAG y en la organización y transporte asociado a este compartimento seguimos dos estrategias experimentales: ARN de interferencia para disminuir la expresión de la LPP3 y vectores de expresión para aumentarla. Los resultados sugieren que la LPP3 regula la producción de DAG en las membranas de Golgi y, además, que participa en la organización estructural y funcional del complejo de Golgi, al menos en el transporte retrógrado.Paralelamente, estudiamos si la PKC epsilon era un efector del DAG en el Golgi implicado en la formación de las vesículas COPI. El DAG actúa como un segundo mensajero modulando la localización y la actividad enzimática de ciertas proteínas citoplasmáticas en el Golgi. Estas proteínas tienen un dominio de unión a DAG (dominio C1) que le permite su interacción directa con este lípido y así regular diferentes procesos asociados al Golgi. La PKD se recluta al TGN a través de su unión con el DAG y resulta esencial para la formación de intermediarios de transporte en el TGN. Teniendo en cuenta que la PKC epsilon interacciona con el coatómero, pensamos que podría ser un buen candidato para regular el transporte ER/Golgi de forma similar a la que PKD realiza en el TGN. Nuestros resultados muestran que la PKC epsilon se recluta en el Golgi de manera dependiente de DAG, pero no parece participar en el transporte retrógrado en la zona endoplasmático /complejo de Golgi.