Rapport de recherche bibliographique de master professionnel 2e année : Ingénierie documentaire : Villeurbanne, ENSSIB : 2005. Rapport de recherche bibliographique de master professionnel 2e année : Ingénierie documentaire : Lyon 1 : 2005. / Texte intégral.

Les anticorps plasmatiques de type HTLA constituent un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires d'immunologie érythrocytaire. Leurs caractéristiques particulières rendent d'autant plus difficile l'établissement de méthodes permettant de les éliminer, augmentant le risque de camoufler un anticorps d'importance clinique significative. Des études ont démontré que l'utilisation du récepteur du complément de type 1 sous forme soluble pourrait potentiellement neutraliser un certain nombre de ces anticorps. Certains auteurs associent également ces anticorps à la sous-classe 4 des IgG. Diverses méthodes de depletion des HTLA basées sur ces observations ont été testées dans le but d'améliorer le typage de ces échantillons. Ces travaux ont démontré que l'utilisation de peptides synthétiques de CRI représentait un bon potentiel pour y parvenir. Des analyses en biologie moléculaire ont également été réalisées dans le but d'établir le profil du CRI d'échantillons Yka-, un antigène associé aux HTLA dont la base moléculaire est inconnue.

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Th. Méd.--Nancy 1, 1983. N°: 7.

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

De nouvelles méthodes évit.ant les étapes d'amplification intermédiaires pour la détection de marqueurs de pathologies seraient d'un grand intérêt, surtout dans le milieu clinique. Ceci est particulièrement le cas pour le diagnostic et le suivi de traitement de certains cancers, où des fragments de protéines (K.8/K18) sont rejetés dans le sang par les cellules cancéreuses émergentes. A partir de ces fragments, il est possible de générer une réaction anticorps-antigènes où la concentration de ces fragments module cette interaction. Le travail effectué durant cette maîtrise a permis de développer une nouvelle procédure de mesure de concentration d'antigène dans un fluide biologique utilisant une pince optique. Une force de gradient a été appliquée perpendiculairement à la direction de propagation du faisceau sur une bille de 3 um de diamètre recouverte de sérum-albumine bovin (BSA) liée à une tige de 1,5 um de diamètre recouverte de l'anticorps anti-BSA. En premier lieu, nous avons mesuré la force nécessaire pour briser le lien anticorps-antigène selon différentes concentrations d'antigène recouvrant la bille (de 10⁻⁷ mo1/L à 10⁻¹³ mo1/L). Cette expérience permit de démontrer qu'il existait une relation proportionnelle entre ces deux variables. Par la suite, nous avons mesuré la force nécessaire pour rompre la liaison entre la tige et une bille recouverte d'une concentration constante d'antigène selon différentes concentrations d'antigène en solution dans le milieu (de 10⁻¹¹ mo1/L à 10⁻¹⁸ mo1L). Lors de cette expérience, il y a une compétition de liaison entre les antigènes sur la bille et ceux en solution pour les sites de liaison disponibles sur la pipette. Cette fois, une relation inversement proportionnelle entre la force nécessaire au bris de la liaison et la concentration d'antigène en solution a pu être illustrée. Ainsi, ces travaux ont permis de démontrer qu'il serait possible de détecter, dans un fluide biologique, une concentration d'antigène d'ordre attomolaire (10⁻¹⁸ mo1L).

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

La nétose du polynucléaire neutrophile (PN) correspond à la libération de filaments d’ADN recouverts de protéines appelés Neutrophil Extracellular Trap (NETs). Outre leur rôle anti-infectieux, les NETs représentent des acteurs émergents de nombreuses pathologies inflammatoires et nous avons souhaité évaluer leur implication au cours de réactions allergiques.Au cours d’une étude clinique multicentrique notre équipe a mis en évidence un mécanisme alternatif de l’anaphylaxie aux curares, impliquant les PN. La phase aiguë de ces réactions s’accompagne d’une libération de NETs dont la concentration est corrélée avec la sévérité et avec une diminution de l’expression des récepteurs activateurs des IgG à la surface des PN (FcγRs) ; ceci suggère un rôle des complexes immuns (CI) IgG/curares dans la formation des NETs au cours de ces réactions anaphylactiques.Pour confirmer cette hypothèse, la capacité d’activation de la nétose par les CI IgG a été étudiée, via la mise au point d’un modèle de stimulation in vitro des PN humains purifiés.Ce travail montre que 2 récepteurs aux IgG du PN (FcγRIIa et FcγRIIIB) contribuent à la libération de NETs en réponse à différents types de CI.En parallèle, la formation des NETs a été explorée dans un modèle de réaction allergique chronique, l’asthme. Au niveau systémique, la concentration de NETs est associée à la présence d’un asthme sévère mal contrôlé et d’une obstruction bronchique peu réversible. Inversement, la concentration de NETs dans le lavage broncho-alvéolaire est plus élevée au cours de l’asthme modéré et semble traduire un recrutement pulmonaire et une activation des PN en réponse à une colonisation microbienne.Au total nous montrons que les NETs sont libérés au cours des deux modèles de réactions allergiques choisis, aiguë (anaphylaxie aux curares) et chronique (asthme) et qu’ils pourraient représenter des biomarqueurs de sévérité. Des travaux complémentaires sont nécessaires pour déterminer dans quelle mesure les NETs contribuent à la physiopathologie des allergies. / Neutrophil netosis consists in the release of extracellular DNA filaments bound to granular proteins, called Neutrophil extracellular traps (NETs). In addition to their anti-infectious role, NETs are emerging actors of many inflammatory diseases and we decided to investigate their involvement during allergy.In a multicenter clinical study, our team highlighted an alternative mechanism of anaphylaxis to neuromuscular blocking agents (NMBA) involving neutrophils (PN). The acute phase of these reactions is characterized by NETs release which level is correlated with severity and with a decrease in IgG activating receptors (FcγRs) expression on PN; this suggests a role of immune complexes (IC) IgG / NMBA in NETs formation during these anaphylactic reactionsTo confirm this hypothesis, the ability of IgG ICs to activate netosis was studied through the development of an in vitro stimulation model of purified human PNs.This work shows that two PN IgG receptors (FcγRIIa and FcγRIIIB) contribute to NET release upon cellular activation by different ICsIn parallel, NETs formation has been explored in a model of chronic allergic reactions, asthma. At systemic level, NETs levels are associated with severe and poorly controlled asthma as well with the presence of low reversible bronchial obstruction. Conversely, NETs levels in bronchoalveolar lavage are higher in moderate asthma and appear to reflect pulmonary recruitment and activation of PN in response to microbial colonization.Taking together these results show that NETs are released during the two selected models of allergic reactions : acute (NMBA anaphylaxis) and chronic (asthma) and could be used as biomarkers of severity. Furthers works are needed to determine to what extent NETs contribute to the pathophysiology of allergy.

Les adénovirus humains (HAdVs) provoquent généralement une infection bénigne chez l'hôte sain. En revanche, chez les patients immunodéprimés et immunocompétents, ils peuvent causer des infections sévères à létales. Les vecteurs HAdVs sont couramment utilisés dans les domaines de la thérapie génique et de la vaccination. L'immunité pré-existante de l’hôte protège généralement contre les infections de type sauvage mais peut entraîner des effets indésirables lors du relargage des virus tel que l’induction de processus inflammatoire locale ou général. Après l'infection, l'inflammation va principalement entraîner le recrutement de cellules dendritiques (DCs), de monocytes et de neutrophiles. Les DCs ont la capacité unique de présenter l'antigène et d’activer les cellules T, qui, par la suite, aideront les cellules B à produire des anticorps. En plus de leurs activités phagocytaires, des peptides antimicrobiens dérivés des neutrophiles (AMPs) jouent un rôle central dans l'immunité innée. Les AMPs peuvent neutraliser les microbes infectieux et / ou activer différents types de cellules immunitaires. Dans ce contexte, nous avons étudié l'interaction ex vivo entre le facteur hôte (anticorps anti-HADV et AMPs) contre les HAdVs dans les DCs ainsi que le rôle des DCs activés indirectement (indir-DCs) lors de la réponse immunitaire. Nous avons caractérisé le profil des cytokines et des chimiokines sécrétées par les DCs stimulées par différents HAdVs, AMPs et les combinaisons qui en découlent. Enfin, nous avons constaté que l’opsonisation d’HAdV5 par les IgG accroît la capacité de capture antigénique des MoDCs (cellules dendritiques dérivées de monocytes) et induit la mort cellulaire par pyroptose. Je me suis donc concentrée sur les caractéristiques et la fonction des indir-DCs dans l’immunité contre les HAdVs. Afin de mieux comprendre les propriétés et les phénotypes des indir-DCs et DCs activés directement (dir-DCs), nous avons caractérisé leurs profils de maturation, les facteurs influençant cette maturation, et leur capacité fonctionnelle de recruter les leucocytes. Ainsi nous avons pu mettre en évidence que les dir-DCs empêchent le recrutement leucocytaire tandis que les indir-DCs favorisent la migration des monocytes. L’ensemble de ces données contribue à comprendre comment l'immunité pré-existante contre les HAdVs peut impacter l’efficacité des traitements contre les maladies HAdVs ainsi que la conception de vaccins. / Human adenoviruses (HAdV) generally cause mild infection in healthy host, but in immunocompromised and immunocompetent patients, they cause severe on lethal infections. HAdV vector are also commonly used for gene transfer and vaccination. We know that pre-existing immunity can protect from wild type infection and cause adverse effects during vector delivery including local and system inflammation. Following HAdV infection on vector use, inflammation leads to the recruitment of dendritic cells (DCs), monocyte and neutrophils. DCs have the unique ability to present antigens and activate T cells, that subsequently aid B cells to produce antibodies. In addition to their phagocytic activities, neutrophil-derived antimicrobial peptides (AMPs) play a central role in innate immunity. AMPs can kill invading microbes and/or activate various cell types. Here I studied the ex vivo interaction between host factor (anti-HAdV antibodies and AMPs) to HAdV in DCs and the role of indirect-activated DC (indir-DCs) in immune response. I characterized the profile of cytokines and chemokines of DC stimulated with different HAdV, AMPs and their combination. We recently found that IgG-oposonization of HAdV5 increase the update by MoDCs (monoctyes-derived dendritic cells) and induced pyroptotic cell death. I therefore focused on the characteristic and function of indir-DCs in anti-HAdV immunity. To better understand the properties and phenotypes of indir-DCs and direct-activated DCs (dir-DCs), we characterize their maturation profile, the factors influencing their maturation, and the functional ability to recruit leukocyte. We found that dir-DC prevent leucocyte recruitment while indir-DC increases monocyte migration. These data contribute to understand how the pre-existing immunity to HAdV impacts treatment for HAdV diseases and vaccine design.

La pharmacocinétique (PK) des anticorps monoclonaux (mAbs) est sujette à d’importantes variations interindividuelles. Le récepteur néonatal au Fc des IgG (FcRn) et le statut immun à l’encontre de ces mAbs sont des déterminants de cette PK. La bioconjugaison des mAbs à des cytotoxiques entraîne une altération de leur PK. Nous montrons que le taux de couplage modifie l’affinité de ces espèces pour le FcRn à pH6. La proportion d’agrégats au sein des solutions d’anticorps armés augmente avec le taux de couplage et pourrait entraîner une altération de leur PK. Par ailleurs, cette agrégation est impliquée dans l’immunogénicité des mAbs, et nous avons donc cherché à identifier des acides aminés impliqués dans l’agrégation de mAbs indiqués en clinique. Il apparait que la nature biochimique de résidus des paratopes pourrait augmenter cette agrégation. Les anti-TNF- présentent très peu d'agrégats et figurent pourtant parmi les plus immunogènes chez l’Homme. Nous avons donc exploré le rôle des complexes immuns dans leur immunogénicité chez la souris. Il apparait que la présence du FcRn n’est pas à l’origine de l’immunisation contre ces mAbs, contrairement à celle des complexes immuns. Ces résultats donnent des pistes pour la production de mAbs plus efficients et mieux tolérés. / The pharmacokinetic (PK) profile of monoclonal antibodies (mAbs) shows interindividudal variability. The neonatal Fc receptor (FcRn) and the immounogenicity of these mAbs are determinative factors of mAb PK. Generation of antibody-drug-conjugates alters their PK profile. We show that the the affinity for FcRn at pH6 increases with the drug-to-mAb ratio, as does the amount of aggregates inside the mAb-drug-conjugate. The amount of aggregates could be responsible for an avidity effect towards FcRn. These aggregates are known to cause immunogenicity, so we studied biochemical determinants inside the aminoacid sequence of marketed mAbs. We show that the biochemical nature of some aminoacids inside the paratope has an impact on the amount of aggregation. Anti-TNF- mAbs show very little aggregation but are very immunogenic in humans. We studied the role of the formation of immune complexes in the immunization against anti-TNF- mAbs in mice, and showed that immune complexes, but not FcRn are essential in the immunization process against anti- TNF- mAbs. These results give leads towards the generation of more efficient, better tolerated mAbs.