A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

A tuberculose bovina (bTB) é um problema sanitário importante em Moçambique e ainda a espera de uma ação organizada por parte dos Serviços Veterinários Oficiais. O presente estudo teve por objetivo investigar e mapear os genótipos de Mycobacterium bovis circulantes no país e paralelamente maximizar a utilização de abatedouros como fonte de informação epidemiológica da bTB. Durante o período de outubro de 2016 a abril de 2017 foram colhidas um total de 90 amostras de lesões sugestivas de tuberculose bovina nos abatedouros Municipais de Maputo e Maxixe e dois abatedouros privados da província de Maputo. Essas amostras, juntamente com outras 10, disponibilizadas pelo Laboratório Central de Veterinária e 72 do banco de amostras de Faculdade de Veterinária de Moçambique foram processadas para isolamento, identificação e discriminação molecular (MIRU-VNTR e spoligotyping) de micobactérias. Nos abatedouros foram coletados dados para calcular as prevalências de carcaças com lesões sugestivas de tuberculose e foi estimada em 0,63% e 80% das carcaças condenadas por tuberculose apresentaram lesões compatíveis com generalização da infecção. Foram obtidos 104 isolados identificados como gênero Mycobacterium, dos quais 80 foram compatíveis com o MTBC e 10 MNT. Destes 80 MTBC, 70 foram identificados como M. bovis. O MIRU-VNTR discriminou os 70 isolados de M. bovis em 47 perfis, agrupados em 3 complexos clonais e cinco singletons. Dos 24 loci estudados, os que apresentaram maiores polimorfismos foram MIRU 960, 2996 e QUB-4052. Em relação ao spoligotyping, foram identificados cinco perfis, dos quais o mais prevalente foi o SB0961, seguido do SB0140, SB2306, SB2481 (novo) e SB1099. Dos 70 isolados submetidos a análises dos complexos clonais africano 1, africano 2, europeu 1 e europeu 2, foram detectados apenas 18,5% de europeu. O distrito de Machanga foi o que apresentou maior diversidade de isolados e o Govuro maior número de isolados de M. bovis. Quando comparados as técnicas, o MIRU-VNTR apresentou maior poder de discriminação em relação ao spoligotyping. O complexo clonal europeu 1 está relacionado com o SB0140 que por sua vez é característico de isolados do Reino Unido e de países que tiveram trocas comerciais de bovinos com o país, incluindo os circunvizinhos a Moçambique e de onde há registros da importação de animais para Moçambique. A não identificação precisa dos complexos clonais dos spoligotyping SB0961, SB2306, SB2481 relacionados, podem ser derivados do BCG, que é sugestivo de evolução clonal própria de Moçambique e os complexos clonais até hoje existentes não são suficientes para discriminar os isolados de Moçambique. Embora os dados de abatedouros sugeriram que a prevalência da tuberculose bovina em Moçambique está entre as mais baixas dos países africanos, a predominância de carcaças com lesões generalizadas significa alto risco de exposição de animais e humanos, sobretudo das populações rurais que têm estreito contato com esses animais. Esse risco é ampliado em função da alta prevalência de humanos que vivem com HIV/AIDS no país. Assim, recomenda-se que Moçambique estruture programa de controle da doença nos animais e métodos de diagnóstico que detectem a infecção por M. bovis na população humana. / Bovine tuberculosis (bTB) is a major sanitary problem in Mozambique and awaits organized action by the Official Veterinary Services. The aim of this work was to investigate and map the circulating Mycobacterium bovis genotypes in the country and to maximize the use of slaughterhouses as a source of epidemiological information for bTB. During the period from October 2016 to April 2017, a total of 90 samples with lesions suggestive of bovine tuberculosis were collected from Maputo and Maxixe Municipal abattoirs and two private abattoirs from the province of Maputo. These samples, together with 10 others provided by the Central Veterinary Laboratory and 72 from the Veterinary Faculty sample bank were processed for isolation, identification and molecular discrimination (MIRU-VNTR and spoligotyping) of mycobacteria. Samples collected in the slaughterhouses were analyzed by calculating the prevalence of carcasses with lesions suggestive of bTB, which was estimated at 0.63% and 80% of carcasses condemned for tuberculosis presented lesions compatible with generalized infection. A total of 104 isolates were identified as M. bovis as Mycobacterium genus were obtained, of which 80 were compatible with MTBC and 10 MNT. Of these 80 MTBC, 70 were identified as M. bovis. The MIRU-VNTR discriminated the 70 isolates of M. bovis in 47 profiles, grouped in 3 clonal complexes and 5 singletons. Of the 24 loci studied, the ones with the highest polymorphisms were MIRU 960, 2996 and QUB-4052. In relation to spoligotyping, five profiles were identified; SB0961 was the most prevalent, being SB0961, followed by SB0140, SB2306, SB2481 (new) and SB1099. Of the 70 isolates submitted to analyzes of the clonal complexes African 1, African 2, European 1 and European 2, only 18.5% of European complex were detected. Machanga district presented the greatest diversity of isolates, while Govuro district had largest number of isolates of M. bovis. The MIRU-VNTR presented greater power of discrimination in relation to spoligotyping. The European clonal complex 1 was related to SB0140 which in turn is characteristic of isolates from the United Kingdom and from countries that have had commercial trade in cattle with UK including those surrounding Mozambique and where there are records of imports of animals for Mozambique. The precise identification of the clonal complexes of the SB0961, SB2306 and SB2481 related spoligotypings subject to the BCG derivatives, is suggestive of the clonal evolution of Mozambique and that the clonal complexes to date are not sufficient to discriminate against the isolates from Mozambique. Although data from slaughterhouses suggested that the prevalence of bovine tuberculosis in Mozambique is among the lowest in African countries, the predominance of carcasses with generalized lesions means a high risk of animal and human exposure, especially of rural populations that have close contact with these animals. This risk is amplified due to the high prevalence of people that living with HIV/AIDS in the country. Thus, it is recommended that Mozambique structure a disease control program in animals and diagnostic methods that detect M. bovis infection in the human population.

A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Com o objetivo de enfatizar a importÃncia do diagnÃstico laboratorial de micobactÃrias em sÃtios extrapulmonares, exceto renal, utilizou-se neste trabalho a reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR). Na PCR foram empregados iniciadores especÃficos para a detecÃÃo de micobactÃrias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB) e nÃo pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MNTB). Foram comparados os resultados obtidos na PCR com os mÃtodos microbiolÃgicos convencionais. Foram analisadas 114 amostras clÃnicas (lÃquidos corporais) provenientes de pacientes internados ou em atendimento ambulatorial, com suspeita clÃnica de tuberculose extrapulmonar, exceto renal. As amostras foram coletadas no perÃodo de 2001 a 2003 e cedidas pelo LaboratÃrio de Microbiologia do LaboratÃrio Central do Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC-UFC) e pelo LaboratÃrio Central de SaÃde PÃblica da Secretaria de SaÃde do Estado do Cearà (LACEN-CE). A baciloscopia e a cultura foram negativas em todas as amostras. A pesquisa molecular para o gÃnero Mycobacterium foi positiva em dez amostras e, para o complexo Mycobacterium tuberculosis, foi negativa em todas as amostras. / In order to focus on the importance of laboratorial diagnosis of extrapulmonary mycobacteria, except renal, we employed the polymerase chain reaction (PCR). Clinical samples (body fluids) were tested by PCR for the presence of Mycobacterium tuberculosis complex (MTB) and nontuberculous mycobacteria (MNTB). We compared the results obtained through the PCR with the ones obtained through conventional microbiological methods. The 114 clinical samples were obtained from internal patients or from or in ambulatorial attendance with clinical suspicion of extrapulmonary tuberculosis, except renal. The samples were collected from 2001 to 2003, and ceded to this research by the LaboratÃrio de Microbiologia do LaboratÃrio Central do Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC-UFC), and by the LaboratÃrio Central de SaÃde PÃblica da Secretaria de SaÃde do Estado do Cearà (LACEN-CE). The direct microscopy and culture were negative in all the samples. The molecular research, for the Mycobacterium genus was positive in 10 samples, and for the Mycobacterium tuberculosis complex was negative in all the samples.