O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo fermentativo de produção de retamicina, em biorreatores de bancada, utilizando-se a linhagem mutante Streptomyces olindensis So20, visando a obtenção de elevadas quantidades deste antibiótico, em processo descontínuo alimentado (fed-batch) e contínuo, bem como a implementação de técnicas de análise de imagens para a caracterização morfológica do microrganismo durante os cultivos. Os ensaios descontínuos alimentados visaram o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação em três valores distintos (0,03 1/h, 0,10 1/h e 0,17 1/h), por meio do emprego de vazões exponenciais de alimentação. Foram realizados três conjuntos de ensaios descontínuos alimentados. No primeiro conjunto, foi verificada a influência da concentração de nutrientes utilizada na alimentação, mantendo-se a velocidade específica de crescimento em 0,03 1/h, durante a alimentação. De uma maneira geral, o aumento da concentração de nutrientes na alimentação, levou a um aumento na produção do antibiótico. No segundo conjunto de ensaios, foi estudada a influência da velocidade específica de crescimento sobre a produção de retamicina, empregando-se como alimentação o meio R5 modificado com apenas a concentração de glicose quadruplicada. Nesse conjunto de ensaios, ocorreu limitação de outros nutrientes, o que prejudicou o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação. No entanto, essa limitação nutricional mostrou-se importante para a produção do antibiótico. No terceiro conjunto de ensaios, foi novamente estudada a influência da velocidade específica de crescimento sobre a produção de retamicina, empregando-se como alimentação o meio R5 modificado, agora com as concentrações de todos os nutrientes quadruplicadas, o que evitou limitações nutricionais e permitiu o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação. Estes ensaios mostraram que o processo de produção de retamicina é favorecido pela manutenção de baixas velocidades específicas de crescimento, por ser este um metabólito secundário. A maior produção de retamicina ocorreu quando a velocidade específica de crescimento foi fixada em 0,03 1/h, durante a alimentação. Nos ensaios contínuos realizados, foi estudada a influência da vazão específica de alimentação (D) e, conseqüentemente, da velocidade específica de crescimento (µx) sobre a produção do antibiótico retamicina. Foram, realizados quatro ensaios contínuos, variando-se D entre 0,03 1/h e 0,30 1/h. A máxima produção de retamicina (tanto em termos de concentração, como em termos de produtividade e produção específica em retamicina total) ocorreu para D = 0,05 1/h. O aumento de D levou a uma diminuição da produção do antibiótico, a qual cessou para D = 0,30 1/h, mostrando um comportamento típico de um metabólito secundário. Foram utilizadas técnicas de análise de imagens na caracterização morfológica do microrganismo. O cisalhamento mostrou-se um importante fator no rompimento de pellets e na formação de clumps e hifas livres, principalmente nos ensaios contínuos. Em geral, a maior produção do antibiótico esteve associada a altas porcentagens de clumps no meio de cultivo. / The objective of the present work was to study retamycin production in fed-batch and continuous cultivations of Streptomyces olindensis So20, a mutant strain, in order to obtain high antibiotic concentrations and analyse microorganism morphology employing image analysis techniques. The fed-batch runs were performed in order to control the specific growth rate in three different values, during feed (0.03 1/h, 0.10 1/h, and 0.17 1/h), employing exponential feed rates. Three sets of fed-batch runs were carried-out. The first set, feed composition was varied, controlling the specific growth rate in a low value (0.03 1/h) during feed. In general, higher nutrient concentrations in the feed led to higher antibiotic production. In the second set of fed-batch runs, the control of the specific growth rate in three different values during feed was studied. The feed was composed by R5 Modified medium, with four-fold the glucose concentration only, which led to nutrient limitation during runs. This nutrient limitation prejudiced the specific growth rate control, but led to high antibiotic production. This fact showed that nutrient limitation is an important factor in retamycin production. In the third set of fed-batch runs, the control of the specific growth rate in three different values during feed was studied. In these runs, the feed was composed by R5 Modified medium, with four-fold all the nutrient concentrations, which avoided nutrient limitation, during runs. In these runs, the control of the specific growth rate during feed was possible. Results showed that retamycin production is favored by the maintenance of low specific growth rates, since it is a secondary metabolite. Higher antibiotic production was achieved controlling the specific growth rate in 0.03 1/h, during feed. In the continuous runs, the influence of the dilution rate (D), and consequently, of the specific growth rate (µx) on the retamycin production was studied. Four continuous runs were performed, varying D in the range from 0.03 1/h to 0.30 1/h. The highest antibiotic production (in terms of retamycin concentration, retamycin productivity and retamycin specific production) was obtained at D = 0.05 1/h. The increase in the dilution rate led to lower antibiotic production, which ceased at D = 0.30 1/h, showing a typical behavior of a secondary metabolite. Image analysis was used to assess the morphological characteristics of the microorganism. Shear showed to be an important factor in pellet disruption and in clump and free filaments formation, mainly in the continuous runs. In general, higher antibiotic production was obtained with the growth mainly in the form of clumps.

Estudou-se a influência do fosfato na multiplicação de Saccharomyces cerevisiae em uma fermentação contínua em mini-fermentador. Determinou-se a massa seca, a concentração dos substratos, a velocidade específica de consumo dos substratos, a velocidade específica de formação de gás carbônico, velocidade específica de consumo de oxigênio e o quociente respiratório bem como, o fósforo intracelular em diversas vazões específicas de alimentação, em cultivo contínuo de levedura de panificação, em condições de substratos limitantes. Controlando-se a quantidade de fosfato no meio de alimentação de tal modo que o fosfato residual no meio de fermentação mal pudesse ser detectado, o valor da vazão específica de alimentação crítica era aparentemente aumentado de 0,23 h-1 para 0,32 h-1. Isto sugere uma possível influência do fosfato nas funções anaeróbicas e aeróbicas da levedura de panificação. / The influence of phosphate in a continuous culture was studied using mini-fermentor on the Saccharomyces cerevisiae multiplication. Dry matter, substrate concentration, specific substrate comsumption, specific carbon dioxide release, specific oxygen uptake rates and respiration quotient , as well as phosphorous content of the cells were measured in dependence on the dilutionrate. In continuous culture glicose-limited, of baker\'s yeast if the supply of phosphorous were restricted to a extent that residual phosphate in the medium could hardly be observed, the value of critical dilution rate was apparently enhanced from 0,23 h-1 to 0,32 h-1. This observation suggests a possible mediation by phosphate between anaerobic and aerobic functions of the baker\'s yeast.

abstract: Over the past decade, there has been a revival in applied algal research and attempts at commercialization. However, the main limitation in algal commercialization is the process of cultivation, which is one of the main cost and energy burdens in producing biomass that is economically feasible for different products. There are several parameters that must be considered when growing algae, including the type of growth system and operating mode, preferred organism(s), and many other criteria that affect the process of algal cultivation. The purpose of this dissertation was to assess key variables that affect algal productivity and to improve outdoor algal cultivation procedures. The effect of reducing or eliminating aeration of algal cultures at night, in flat panel photobioreactors (panels), was investigated to assess the reduction of energy consumption at night. The lack of aeration at night resulted in anoxic conditions, which significantly reduced lipid accumulation and productivity, but did not affect log phase biomass productivity. In addition, the reduction in aeration resulted in lower pH values, which prevented ammonia volatility and toxicity. Raceways are operated at deeper cultivation depths, which limit culture density and light exposure. Experimentation was accomplished to determine the effects of decreasing cultivation depth, which resulted in increased lipid accumulation and lipid productivity, but did not significantly affect biomass productivity. A comparison of semi-continuous cultivation of algae in raceways and panels in side-by-side experiments showed that panels provided better temperature control and higher levels of mixing, which resulted in higher biomass productivity. In addition, sub-optimal morning temperatures in raceways compared to panels were a significant factor in reducing algae biomass productivity. The results from this research indicate that increasing lipid productivity and biomass productivity cannot be completed simultaneously. Therefore, the desired product will determine if lipid or biomass productivity is more crucial, which also dictates whether the system should be operated in batch mode to either allow lipid accumulation or in semi-continuous mode to allow high biomass productivity. This work is a critical step in improving algal cultivation by understanding key variables that limit biomass and lipid productivity. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Civil and Environmental Engineering 2015

O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo fermentativo de produção de retamicina, em biorreatores de bancada, utilizando-se a linhagem mutante Streptomyces olindensis So20, visando a obtenção de elevadas quantidades deste antibiótico, em processo descontínuo alimentado (fed-batch) e contínuo, bem como a implementação de técnicas de análise de imagens para a caracterização morfológica do microrganismo durante os cultivos. Os ensaios descontínuos alimentados visaram o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação em três valores distintos (0,03 1/h, 0,10 1/h e 0,17 1/h), por meio do emprego de vazões exponenciais de alimentação. Foram realizados três conjuntos de ensaios descontínuos alimentados. No primeiro conjunto, foi verificada a influência da concentração de nutrientes utilizada na alimentação, mantendo-se a velocidade específica de crescimento em 0,03 1/h, durante a alimentação. De uma maneira geral, o aumento da concentração de nutrientes na alimentação, levou a um aumento na produção do antibiótico. No segundo conjunto de ensaios, foi estudada a influência da velocidade específica de crescimento sobre a produção de retamicina, empregando-se como alimentação o meio R5 modificado com apenas a concentração de glicose quadruplicada. Nesse conjunto de ensaios, ocorreu limitação de outros nutrientes, o que prejudicou o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação. No entanto, essa limitação nutricional mostrou-se importante para a produção do antibiótico. No terceiro conjunto de ensaios, foi novamente estudada a influência da velocidade específica de crescimento sobre a produção de retamicina, empregando-se como alimentação o meio R5 modificado, agora com as concentrações de todos os nutrientes quadruplicadas, o que evitou limitações nutricionais e permitiu o controle da velocidade específica de crescimento durante a alimentação. Estes ensaios mostraram que o processo de produção de retamicina é favorecido pela manutenção de baixas velocidades específicas de crescimento, por ser este um metabólito secundário. A maior produção de retamicina ocorreu quando a velocidade específica de crescimento foi fixada em 0,03 1/h, durante a alimentação. Nos ensaios contínuos realizados, foi estudada a influência da vazão específica de alimentação (D) e, conseqüentemente, da velocidade específica de crescimento (µx) sobre a produção do antibiótico retamicina. Foram, realizados quatro ensaios contínuos, variando-se D entre 0,03 1/h e 0,30 1/h. A máxima produção de retamicina (tanto em termos de concentração, como em termos de produtividade e produção específica em retamicina total) ocorreu para D = 0,05 1/h. O aumento de D levou a uma diminuição da produção do antibiótico, a qual cessou para D = 0,30 1/h, mostrando um comportamento típico de um metabólito secundário. Foram utilizadas técnicas de análise de imagens na caracterização morfológica do microrganismo. O cisalhamento mostrou-se um importante fator no rompimento de pellets e na formação de clumps e hifas livres, principalmente nos ensaios contínuos. Em geral, a maior produção do antibiótico esteve associada a altas porcentagens de clumps no meio de cultivo. / The objective of the present work was to study retamycin production in fed-batch and continuous cultivations of Streptomyces olindensis So20, a mutant strain, in order to obtain high antibiotic concentrations and analyse microorganism morphology employing image analysis techniques. The fed-batch runs were performed in order to control the specific growth rate in three different values, during feed (0.03 1/h, 0.10 1/h, and 0.17 1/h), employing exponential feed rates. Three sets of fed-batch runs were carried-out. The first set, feed composition was varied, controlling the specific growth rate in a low value (0.03 1/h) during feed. In general, higher nutrient concentrations in the feed led to higher antibiotic production. In the second set of fed-batch runs, the control of the specific growth rate in three different values during feed was studied. The feed was composed by R5 Modified medium, with four-fold the glucose concentration only, which led to nutrient limitation during runs. This nutrient limitation prejudiced the specific growth rate control, but led to high antibiotic production. This fact showed that nutrient limitation is an important factor in retamycin production. In the third set of fed-batch runs, the control of the specific growth rate in three different values during feed was studied. In these runs, the feed was composed by R5 Modified medium, with four-fold all the nutrient concentrations, which avoided nutrient limitation, during runs. In these runs, the control of the specific growth rate during feed was possible. Results showed that retamycin production is favored by the maintenance of low specific growth rates, since it is a secondary metabolite. Higher antibiotic production was achieved controlling the specific growth rate in 0.03 1/h, during feed. In the continuous runs, the influence of the dilution rate (D), and consequently, of the specific growth rate (µx) on the retamycin production was studied. Four continuous runs were performed, varying D in the range from 0.03 1/h to 0.30 1/h. The highest antibiotic production (in terms of retamycin concentration, retamycin productivity and retamycin specific production) was obtained at D = 0.05 1/h. The increase in the dilution rate led to lower antibiotic production, which ceased at D = 0.30 1/h, showing a typical behavior of a secondary metabolite. Image analysis was used to assess the morphological characteristics of the microorganism. Shear showed to be an important factor in pellet disruption and in clump and free filaments formation, mainly in the continuous runs. In general, higher antibiotic production was obtained with the growth mainly in the form of clumps.

Estudou-se a influência do fosfato na multiplicação de Saccharomyces cerevisiae em uma fermentação contínua em mini-fermentador. Determinou-se a massa seca, a concentração dos substratos, a velocidade específica de consumo dos substratos, a velocidade específica de formação de gás carbônico, velocidade específica de consumo de oxigênio e o quociente respiratório bem como, o fósforo intracelular em diversas vazões específicas de alimentação, em cultivo contínuo de levedura de panificação, em condições de substratos limitantes. Controlando-se a quantidade de fosfato no meio de alimentação de tal modo que o fosfato residual no meio de fermentação mal pudesse ser detectado, o valor da vazão específica de alimentação crítica era aparentemente aumentado de 0,23 h-1 para 0,32 h-1. Isto sugere uma possível influência do fosfato nas funções anaeróbicas e aeróbicas da levedura de panificação. / The influence of phosphate in a continuous culture was studied using mini-fermentor on the Saccharomyces cerevisiae multiplication. Dry matter, substrate concentration, specific substrate comsumption, specific carbon dioxide release, specific oxygen uptake rates and respiration quotient , as well as phosphorous content of the cells were measured in dependence on the dilutionrate. In continuous culture glicose-limited, of baker\'s yeast if the supply of phosphorous were restricted to a extent that residual phosphate in the medium could hardly be observed, the value of critical dilution rate was apparently enhanced from 0,23 h-1 to 0,32 h-1. This observation suggests a possible mediation by phosphate between anaerobic and aerobic functions of the baker\'s yeast.

Nanocrystalline diamond (NCD) films possess great mechanical properties (low friction coefficient, high hardness etc.), chemical properties (e.g. low corrosivity or chemical inertness) and good biocompatibility. This makes them perspective materials for protective coatings of medical implants and devices. As bacteria biofilms are often very resistant to antibacterial treatment, materials with anti-bacterial or at least anti-adhesive properties are needed. The interaction of NCD films with bacteria has not been properly examined yet. The aim of this thesis was to introduce and optimize the methods for routine bacterial biofilm cultivation and analysis, use them to investigate the ability of NCD films to inhibit the attachment and biofilm formation of Escherichia coli and correlate it with the NCD surface hydrophobicity. The materials used for the study were hydrogenated NCD (hydrophobic), oxidized NCD (hydrophilic) and uncoated glass. For bacterial biofilm growth, cultivation in six-well plates and continuous cultivation in CDC Bioreactor was used. Several methods were tested for quantitative biofilm detachment and analysis. The putative anti-bacterial properties of NCD material were not confirmed in this work. Higher bacterial attachment to NCD films in comparison to the uncoated glass was...

Microalgae, photosynthetic microorganisms, are rich in lipids, polyunsaturated fatty acids, carbohydrates, proteins, vitamins, as well as carotenoids, which are antioxidants that may protect human body from various diseases including obesity, cardiovascular disease, vision-related diseases such as macular degeneration and certain types of cancer. These natural pigments have applications in the pharmaceutical (nutraceutical), food (coloring, functional food, and supplements), and cosmetics industries (e.g. sunscreen), as well as in aquaculture (animal feed). The Dunaliella salina microalga can synthesize 10% of dry weight in &#946;-carotene (orange pigment, pro-vitamin A activity) under high light intensity and nitrogen and phosphorus limitation, among other stress conditions. The first chapter of this thesis presents a review focused on microalgae carotenoids: culture systems, mode of operation, and applications. In this bibliographic survey, the advantages of microalgae cultivation in relation to traditional sources (higher plants) were discussed, as well as a discussion of the main cultivation systems and their importance in cell growth. This review presented a critical analysis of the different operational regimes like batch, fed-batch, semi-continuous and continuous. Relevant information on the most important world producers of microalgae carotenoids were presented. Chapter II presents the development of a modified method of dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) for rapid extraction of &#946;-carotene from Dunaliella salina cultivated in tubular photobioreactor, with subsequent development of a rapid chromatographic screening method using a C4 column for separation of geometric isomer of &#946;-carotene. The use of benzene as extraction solvent and water with 50% acetone as dispersant provided the best condition for the extraction of this carotenoid. In HPLC (High Performance Liquid Chromatography), employing mobile phase composed of methanol and water (95:5, v/v), it was possible to detect/quantify &#946;-carotene at 14 min (retention time). Besides the short analysis time (<20 min), by the miniaturized extraction (< 10 mL organic waste) this method abide by green chemistry analytical principles. It is known that nitrogen, phosphorus, as well as carbon and vitamins are vital elements for the growth of microalgae, also determining the biochemical composition of biomass. In this sense, Chapter III presents the study of the influence of different amounts of sodium nitrate (1N = 75 mg L-1; 1.5N = 112.5 mg L-1, and 3N = 225 mg L-1) and phosphate monobasic dehydrate (1P = 5.65 mg L-1, 1.5P = 8.47 mg L-1, and 3P = 16.95 mg L-1) in seawater-based f/2 medium on the growth of Dunaliella salina and &#946;-carotene biosynthesis, by continuous process with different replenishment proportions (R = 20% and 80%). Best results of cell productivity were obtained by semicontinuous process (mean values of Px up to 6.7 x 104 cells mL-1 d-1 with medium 1N:1P; R =20%) in comparison with batch process cultivation. Maximum cell density (Xm) obtained in this work was not dependent of R, but the best results were obtained when using medium 1.5N:1.5P (mean values up to 5.6 x 105 cells mL-1 with R =80%) instead of 1N:1P. The content of &#946;-carotene in the cells, in general, was higher in cells grown in medium 1N:1P (mean yield values up to 57.5 mg g-1 with R =80%) in comparison with medium 1.5N:1.5P. The cultivation of D. salina with media 3N:3P led to a long lag phase, followed by decrease in cell density and cell lysis. The use of a tubular photobioreactor contributed to successfully cultivate this microalga without contamination by protozoa. The cultivation of Dunaliella salina in tubular photobioreactor with the use of 12:12 photoperiod was appropriate, as well as to induce carotenogenesis, in the second stage, by increasing the light intensity and absence of pH control / As microalgas, micro-organismos fotossintetizantes, são ricas em lipídios, ácidos graxos poli-insaturados, carboidratos, proteínas, vitaminas, além de carotenoides que são antioxidantes com potencial de proteger o organismo humano de várias doenças incluindo a obesidade, doenças cardiovasculares, doenças relacionadas à visão como a degeneração macular e certos tipos de câncer, entre outras. Esses pigmentos naturais têm aplicações em indústrias farmacêuticas (nutracêuticos), alimentícias (colorantes, alimentos funcionais e suplementos) e de cosméticos (exemplo: filtro solar) e na aquacultura (ração animal). A microalga Dunaliella salina é capaz de sintetizar, sob alta intensidade luminosa e limitação de nutrientes como fontes de fósforo e nitrogênio, dentre outras condições de estresse, 10 % do peso seco em &#946;-caroteno (pigmento laranja com atividade pró-vitamina A). Assim, neste trabalho, numa primeira etapa, foi feita uma revisão da literatura abordando a produção de carotenoides por microalgas, bem como sua aplicação. Nesse levantamento bibliográfico abordou-se, dentre outros assuntos, as vantagens do cultivo de microalgas em relação as fontes tradicionais (plantas superiores), assim como uma discussão dos diferentes sistemas de cultivos e sua importância no crescimento celular. Esse review apresentou uma análise crítica dos principais regimes operacionais como batch, fed-batch, semicontínuo e contínuo. Apresentou-se também informações relevantes sobre os mais importantes produtores mundiais de carotenoides de microalgas. Numa segunda etapa, foi desenvolvido um método modificado de microextração líquido-líquido dispersivo modificado (DLLME) para a rápida extração de &#946;-caroteno de Dunaliella salina cultivada em fotobiorreatores tubulares, com subsequente desenvolvimento de método cromatográfico em uma coluna C4 para a separação do isômero geométrico de &#946;-caroteno. A extração ótima de &#946;-caroteno foi obtida com benzeno como solvente extrator e água com 50% de acetona como dispersante. Empregando uma fase móvel composta por metanol e água (95:5, v/v) em HPLC, foi possível a detecção/quantificação de &#946;-caroteno com 14 minutos de tempo de retenção. Além dos tempos curtos de análises (<20 min), pela extração em volume reduzido (< 10 mL resíduos orgânicos) este método obedece aos princípios da química verde. Sabe-se que nitrogênio, fósforo, assim como carbono e vitaminas são elementos vitais para o crescimento das microalgas e também exercem influência na composição bioquímica da biomassa. Assim, na terceira etapa deste trabalho, estudou-se a influência das quantidades de nitrato de sódio (75 mg L-1, denominado 1N; 112,5 mg L-1, denominado 1,5N; 225 mg L-1, denominado 3N) e de fosfato monobásico dihidratado (5,65 mg L-1, denominado 1P; 8,47 mg L-1, denominado 1,5P; 16,95 mg L-1, denominado 3P) em meio f/2, que tem como base a água do mar, no crescimento e na síntese de &#946;-caroteno da Dunaliella salina por processo semicontínuo, com uso de frações de corte (R) de 20% e 80%. Foram obtidas produtividades celulares mais elevadas em processos semicontínuos do que em processo descontínuo, com produtividades médias de até 6,7 x 104 células mL-1 d-1 (meio 1N:1P; R =20%). A máxima concentração celular (Xm) obtida neste trabalho não foi dependente de R. Os melhores resultados de Xm foram obtidos quando se usou meio 1,5N:1,5P em vez de meio, com 1N:1P, com valores médios de até 5,6 x 105 células m L-1 (R =80%). O conteúdo de &#946;-caroteno nas células, de maneira geral, foi maior nas células cultivadas em meio 1N:1P do que no meio 1,5N:1,5P, com valores até 57,5 mg g-1 (R =80%). O cultivo de D. salina com o meio 3N:3P levou a uma longa fase lag, seguida por uma diminuição na concentração celular e sua lise. O cultivo de células em um fotobiorreator tubular contribuiu para um crescimento celular sem contaminação por protozoários. O cultivo de Dunaliella salina em fotobiorreator tubular com o uso de fotoperíodo 12:12 foi apropriado, assim como induzir a carotenogênese, no segundo estágio, por meio do aumento da intensidade luminosa e ausência de controle de pH.