Diversos fatores respondem por variações na viabilidade do sêmen eqüino e na sua qualidade espermática; em humanos, reportam-se correlações entre fatores endócrinos e parâmetros seminais, mas em eqüinos poucos estudos contribuem para esta correlação. Para se investigar eventuais correlações entre hormônios sexuais e tireoideanos com as características seminais físicas e morfológicas, além de longevidade seminal, foram mensuradas as concentrações plasmáticas de estradiol, testosterona, T3 e T4 de garanhões e analisadas tais características espermáticas no momento da colheita seminal e após 24h, 48h e 72h de armazenamento a 5oC. 05 garanhões férteis em idade reprodutiva foram submetidos à colheita de sêmen (2 vezes/semana) e sangue (1 vez/semana, a cada 6 horas) durante 6 semanas. Estradiol, testosterona, T3 e T4 foram analisados por RIE. Após a colheita, o sêmen foi analisado e resfriado a 5oC, com análises subseqüentes após 24h, 48h e 72h de armazenamento. O sêmen foi avaliado quanto às características seminais físicas e morfológicas, além de integridade de membrana. Significativas (p<0.05) diferenças foram observadas entre os animais quanto às concentrações hormonais; o estradiol mostrou as maiores variações entre indivíduos, embora todos os resultados tenham se mostrado compatíveis aos valores de referência da literatura. Logo após a colheita, não se observou diferenças significativas (p<0.05) para vigor e motilidade total/progressiva, em exceção ao garanhão 4, que apresentou significativa menor motilidade progressiva inicial. Após 24h, 48h e 72h de resfriamento, diferenças significativas (p<0.05) foram observadas entre os garanhões; os menores índices de vigor/motilidade progressiva foram observados nos garanhões 1 e 4. Diferenças significativas (p<0.05) também foram observadas entre os animais para as características espermáticas morfológicas e integridade de membrana. Análises de covariância e correlações não demonstraram correspondência entre concentrações hormonais, longevidade espermática e características seminais físicas/morfológicas, tendo \"tempo de resfriamento\" e \"indivíduos\" como fatores. Correlação positiva foi observada entre motilidade progressiva/vigor e espermatozóides vivos com acrossomo intacto (r=0.70 e r=0.71 respectivamente); em analogia, correlação negativa foi encontrada entre motilidade progressiva/vigor e espermatozóides com acrossomo intacto (r=-0.70 e r=-0.72 respectivamente), indicando que, vivos ou mortos, apresentar acrossomo intacto é fator crítico para a viabilidade espermática mesmo após diferentes tempos de armazenamento em resfriamento. Os resultados mostram que a longevidade do sêmen eqüino provavelmente não é diretamente afetada por razões hormonais primárias; o mesmo pode ser considerado para morfologia espermática. Por outro lado, a longevidade do sêmen eqüino parece ser diretamente influenciada pela integridade de membrana espermática e eventualmente fatores bioquímicos, metabólicos e enzimáticos. / Several factors respond for variations of equine semen viability and sperm quality; in humans, scientific reports try to correlate endocrine issues and sperm parameters. In horses, few studies contribute to this correlation. In order to investigate eventual correlations between sexual and thyroid hormones with physical and morphologic characteristics and also longevity of equine semen,were measured plasma concentrations of estradiol, testosterone, T3 and T4 of stallions and analyzed physical and morphologic characteristics and membrane integrity of spermatozoa at the moment of collection and after 24, 48 and 72 hours of storage at 5oC. Five fertile stallions in reproductive age had semen (twice a week) and blood (once a week, every 6 hours) collected during 6 weeks. Estradiol, testosterone, T3 and T4 were analyzed by RIA. After collection, semen was analyzed and cooled at 5oC, with further analyses after 24, 48 and 72 hours of storage. Semen analysis consisted in physical, morphologic and embrane integrity characteristics. Significant (p<0.05) differences were observed among stallions when compared for plasma hormonal concentrations; estradiol showed the greater variations between individuals, despite all results were compatible to reference values in literature. Just after collection, no significant differences (p<0.05) were observed for vigor and total/progressive motility, in exception to stallion 4, that presented a significant lower initial progressive motility. After 24, 48 and 72 hours of storage, significant differences (p<0.05) were observed among stallions; lowest values of vigor/progressive motility were observed for stallions 1 and 4. Significant differences (p<0.05) were also observed among stallions for morphologic characteristics of sperm and membrane integrity. Analyses of covariance and correlations showed no correspondence among hormonal plasma concentrations, sperm longevity and physical/morphologic characteristics, having time of storage and individuals as factors. Meanwhile, a positive correlation was observed among progressive motility/vigor and live sperm with intact acrosome (r=0.70 and r=0.71 respectively); in analogy, a negative correlation was found among progressive motility/vigor and dead sperm with intact acrosome (r=-0.70 and r=-0.72 respectively), indicating that neither being live or dead, but having acrosome membrane intact is a critical factor for spermatozoa\'s viability even after different times of storage at cooling temperatures. Results show that longevity of equine semen is probably not directly affected by primary hormonal reasons; the same can be considered for sperm morphology. Otherwise, longevity of equine semen seems to be directly influenced by sperm membrane integrity and eventually by biochemical, metabolic and enzymatic factors.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Entre as biotécnicas da reprodução, a inseminação artificial (IA) é a que proporciona maior amplitude de resultados nos programas de melhoramento genético animal. A adequada seleção dos atributos produtivos e reprodutivos de fêmeas e principalmente dos machos é a base essencial para a maximização do potencial dessa técnica. O sêmen para IA pode ser fresco, fresco diluído, refrigerado e congelado. Os diluidores têm papel fundamental na expansão do volume seminal, permitindo seu fracionamento na preservação do sêmen no processo de refrigeração, eles devem ser atóxicos, ter pH e pressão osmótica compatíveis com a sobrevivência espermática, de baixo custo e fácil preparo. Sendo assim o objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação de sêmen ovino resfriado com diluente de Kenney (K) ou diluente de Kenney mais gema de ovo (KG) por até 48 horas. Foram utilizados quatro carneiros, sendo feitas 40 colheitas. Logo após o sêmen era dividido em duas alíquotas uma com o diluente de K e outra alíquota com diluente de KG. As amostras foram resfriadas à 10ºC. As análises subjetivas usuais foram feitas nos tempos 0, 24 e 48 horas. Estas análises incluíram turbilhonamento, motilidade e vigor. Foram feitas também análises de testes funcionais como a avaliação da integridade das membranas plasmática e acrossomal através das colorações de eosina-nigrosina e técnica da coloração Fast Green / Rosa Bengala (POPE, 1991) respectivamente, avaliação da atividade citoquímica mitocondrial através da coloração de diaminobenzidina (DAB) e avaliação da susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo através da avaliação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após a incubação com sistema gerador constituído de sulfato de ferro e ascorbato. Neste trabalho o tempo afetou significativamente a motilidade e o vigor espermático, caindo de 79,16±1,41 para 40,25±2,55 após 48hs e de 3,92±0,06, para 2,57±0,10 após 48hs respectivamente. O tempo influenciou também a integridade das membranas plasmática e acrossomal, fazendo com que houvesse uma queda gradativa nas integridades (0hs=95,75±0,36, 24hs=90,69±0,99, 48hs=86,11±1,45) e (0hs=90,34±0,80, 24hs=84,33±1,30, 48hs=76.67±1,69) respectivamente. Foi possível observar também que ao longo do tempo houve uma diminuição da atividade mitocondrial e um aumento nas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), que diferiu do tempo 0hs para o tempo 48hs (807,42±39.22 e 937,76 ± 41,87). Verificou-se ainda que o meio K apresentou maiores valores de vigor do que o meio KG (p=0,0144), e que o meio K foi capaz de preservar melhor a atividade mitocondrial P=0,0005. A concentração de TBARS no diluente K correlacionou-se negativamente com as variáveis motilidade, vigor, integridade de membrana plasmática e acrossomal. No diluente KG as correlações do TBARS e DAB III foram positiva (r=0,35), demonstrando que quanto maior a quantidade de células com baixa atividade mitocondrial, maior a concentração de TBARS. Foi também encontrada uma correlação negativa entre a variável integridade de acrossomo (ACRO) e TBARS (r=-0,40; P=0,0001), mostrando que quanto menor a porcentagem de células com acrossomo integro, maior a concentração de substancias reativas ao acido tiobarbitúrico. Concluindo que o diluente K foi eficaz em preservar as características seminais de ovino por até 48 horas e que a adição da gema de ovo ao diluente de Kenney não foi capaz de melhorar estas características. / Among the reproductive biotechniques routinely used in animal production, the artificial insemination (AI) is known to provide a greater gain in genetic improvement programs. The adequate selection of female and especially male productive and reproductive traits is the keystone to maximize the potential of this technique. Semen used for AI can be used fresh diluted or not, chilled and frozen. An essential role is played by semen extenders on volume expansion, allowing not only the fractioning in multiple insemination doses, but also the maintenance of sperm fertilizing potential. Therefore, for semen fractioning, chilling or cryopreservation, extenders are required to be atoxic, must maintain pH and osmolarity compatible to the sperm survival, and should be preferably inexpensive and easy to prepare. Therefore, the objective of the present study was to evaluate chilled ram semen using the Kenney extender (K) of the Kenney extender with egg yolk (KG) for 48 h. Forty ejaculates of four rams were (n=40) were used. Samples were equally divided into two aliquots and extended in K extender and KG extender. Samples were chilled at 10ºC and evaluated immediately after chilling (0h), 24 and 48 h later. These analyses included gross motility (swirl pattern), individual motility and vigor. Functional test analyses such as evaluation of plasma membrane integrity using the eosin-nigrosin staining technique, acrosome integrity using the fast green / bengal rose staining method (POPE, 1991), mitochondrial cytochemical activity evaluation utilizing diaminobenzidine (DAB) staining and assessment of sperm susceptibility to the oxidative stress based the levels of thiobarbituric acid reactive substances after the incubation with ferrous sulphate and ascorbate (TBARS) were performed. In this study, a significant influence of chilling period was found for spermatic motility and vigor dropping from 79.16±1.41 to 40.25±2.55 after 48 hours and from 3.92±0.06 to 2.57±0.10 after 48 hours, respectively. Time also negatively influenced the integrity of plasma and acrosomal membrane (0hr=95.75±0.36, 24hrs=90.69±0.99, 48hrs=86.11±1.45; and 0hr=90.34±0.80, 24hrs=84.33±1.30, 48hrs=76.67±1.69, respectively). Also, during the course of time there was a decrease in mitochondrial activity and an increase in TBARS, with an increase from moment 0 to 48 hrs (807.42 ± 39.22 and 937.76 ± 41.87). It was also found that the medium K had greater values of vigor than the medium KG (p=0.0144), and that the medium K was capable of better preserve mitochondrial activity (P=0.0005). A negative correlation was found between the TBARS concentration with motility and vigor and plasma and acrosomal membrane integrity when samples were stored with the extender K. In the KG extender, the TBARS and DAB III correlations were positive (r=0, 35) indicating that showing that the greater the number of cells with low mitochondrial activity, the higher the TBARS concentration. Also, a negative correlation between the acrosomal integrity variable (ACRO) and TBARS (r=-0, 40; P=0,0001) was found, which demonstrates that the lower the percentage of cells with intact acrosomal, the higher the susceptibility to the oxidative stress. Therefore, results indicated that the K extender was effective in preserve the seminal characteristics of ovine for 48 hours and the addition of egg yolk to kenney extender was not capable of improving such characteristics.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Entre as biotécnicas da reprodução, a inseminação artificial (IA) é a que proporciona maior amplitude de resultados nos programas de melhoramento genético animal. A adequada seleção dos atributos produtivos e reprodutivos de fêmeas e principalmente dos machos é a base essencial para a maximização do potencial dessa técnica. O sêmen para IA pode ser fresco, fresco diluído, refrigerado e congelado. Os diluidores têm papel fundamental na expansão do volume seminal, permitindo seu fracionamento na preservação do sêmen no processo de refrigeração, eles devem ser atóxicos, ter pH e pressão osmótica compatíveis com a sobrevivência espermática, de baixo custo e fácil preparo. Sendo assim o objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação de sêmen ovino resfriado com diluente de Kenney (K) ou diluente de Kenney mais gema de ovo (KG) por até 48 horas. Foram utilizados quatro carneiros, sendo feitas 40 colheitas. Logo após o sêmen era dividido em duas alíquotas uma com o diluente de K e outra alíquota com diluente de KG. As amostras foram resfriadas à 10ºC. As análises subjetivas usuais foram feitas nos tempos 0, 24 e 48 horas. Estas análises incluíram turbilhonamento, motilidade e vigor. Foram feitas também análises de testes funcionais como a avaliação da integridade das membranas plasmática e acrossomal através das colorações de eosina-nigrosina e técnica da coloração Fast Green / Rosa Bengala (POPE, 1991) respectivamente, avaliação da atividade citoquímica mitocondrial através da coloração de diaminobenzidina (DAB) e avaliação da susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo através da avaliação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após a incubação com sistema gerador constituído de sulfato de ferro e ascorbato. Neste trabalho o tempo afetou significativamente a motilidade e o vigor espermático, caindo de 79,16±1,41 para 40,25±2,55 após 48hs e de 3,92±0,06, para 2,57±0,10 após 48hs respectivamente. O tempo influenciou também a integridade das membranas plasmática e acrossomal, fazendo com que houvesse uma queda gradativa nas integridades (0hs=95,75±0,36, 24hs=90,69±0,99, 48hs=86,11±1,45) e (0hs=90,34±0,80, 24hs=84,33±1,30, 48hs=76.67±1,69) respectivamente. Foi possível observar também que ao longo do tempo houve uma diminuição da atividade mitocondrial e um aumento nas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), que diferiu do tempo 0hs para o tempo 48hs (807,42±39.22 e 937,76 ± 41,87). Verificou-se ainda que o meio K apresentou maiores valores de vigor do que o meio KG (p=0,0144), e que o meio K foi capaz de preservar melhor a atividade mitocondrial P=0,0005. A concentração de TBARS no diluente K correlacionou-se negativamente com as variáveis motilidade, vigor, integridade de membrana plasmática e acrossomal. No diluente KG as correlações do TBARS e DAB III foram positiva (r=0,35), demonstrando que quanto maior a quantidade de células com baixa atividade mitocondrial, maior a concentração de TBARS. Foi também encontrada uma correlação negativa entre a variável integridade de acrossomo (ACRO) e TBARS (r=-0,40; P=0,0001), mostrando que quanto menor a porcentagem de células com acrossomo integro, maior a concentração de substancias reativas ao acido tiobarbitúrico. Concluindo que o diluente K foi eficaz em preservar as características seminais de ovino por até 48 horas e que a adição da gema de ovo ao diluente de Kenney não foi capaz de melhorar estas características. / Among the reproductive biotechniques routinely used in animal production, the artificial insemination (AI) is known to provide a greater gain in genetic improvement programs. The adequate selection of female and especially male productive and reproductive traits is the keystone to maximize the potential of this technique. Semen used for AI can be used fresh diluted or not, chilled and frozen. An essential role is played by semen extenders on volume expansion, allowing not only the fractioning in multiple insemination doses, but also the maintenance of sperm fertilizing potential. Therefore, for semen fractioning, chilling or cryopreservation, extenders are required to be atoxic, must maintain pH and osmolarity compatible to the sperm survival, and should be preferably inexpensive and easy to prepare. Therefore, the objective of the present study was to evaluate chilled ram semen using the Kenney extender (K) of the Kenney extender with egg yolk (KG) for 48 h. Forty ejaculates of four rams were (n=40) were used. Samples were equally divided into two aliquots and extended in K extender and KG extender. Samples were chilled at 10ºC and evaluated immediately after chilling (0h), 24 and 48 h later. These analyses included gross motility (swirl pattern), individual motility and vigor. Functional test analyses such as evaluation of plasma membrane integrity using the eosin-nigrosin staining technique, acrosome integrity using the fast green / bengal rose staining method (POPE, 1991), mitochondrial cytochemical activity evaluation utilizing diaminobenzidine (DAB) staining and assessment of sperm susceptibility to the oxidative stress based the levels of thiobarbituric acid reactive substances after the incubation with ferrous sulphate and ascorbate (TBARS) were performed. In this study, a significant influence of chilling period was found for spermatic motility and vigor dropping from 79.16±1.41 to 40.25±2.55 after 48 hours and from 3.92±0.06 to 2.57±0.10 after 48 hours, respectively. Time also negatively influenced the integrity of plasma and acrosomal membrane (0hr=95.75±0.36, 24hrs=90.69±0.99, 48hrs=86.11±1.45; and 0hr=90.34±0.80, 24hrs=84.33±1.30, 48hrs=76.67±1.69, respectively). Also, during the course of time there was a decrease in mitochondrial activity and an increase in TBARS, with an increase from moment 0 to 48 hrs (807.42 ± 39.22 and 937.76 ± 41.87). It was also found that the medium K had greater values of vigor than the medium KG (p=0.0144), and that the medium K was capable of better preserve mitochondrial activity (P=0.0005). A negative correlation was found between the TBARS concentration with motility and vigor and plasma and acrosomal membrane integrity when samples were stored with the extender K. In the KG extender, the TBARS and DAB III correlations were positive (r=0, 35) indicating that showing that the greater the number of cells with low mitochondrial activity, the higher the TBARS concentration. Also, a negative correlation between the acrosomal integrity variable (ACRO) and TBARS (r=-0, 40; P=0,0001) was found, which demonstrates that the lower the percentage of cells with intact acrosomal, the higher the susceptibility to the oxidative stress. Therefore, results indicated that the K extender was effective in preserve the seminal characteristics of ovine for 48 hours and the addition of egg yolk to kenney extender was not capable of improving such characteristics.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The improvement of pig industry is a consequence of the technological advances. The aim of the present study is to evaluate the effect of cysteine in BTS (Beltsville Thawing Solution) and centrifugation on swine semen to increase the sperm quality and fertility. In the first experiment, different concentrations of cysteine in Beltsville Thawing Solution: BTS (control group); CYS0.1 (BTS added 0.1 mM cysteine); CYS0.5 (BTS added 0.5 mM cysteine); CYS1.0 (BTS added 1.0 mM cysteine); CYS2.5 (BTS added 2.5 mM cysteine); CYS5.0 (BTS added 5.0 mM cysteine); CYS10.0 (BTS added 10.0 mM cysteine) and CYS20.0 (BTS added 20.0 mM cysteine) were evaluated. In the second experiment, semen added to BTS were not centrifuged without (control group) or with 5.0 mM of cysteine (BTSCYS/NC). In other treatment groups, semen were centrifuged with (BTSCYS/CENT) or without (BTS/CENT) 5.0 mM cysteine. Semen were stored at 17 °C for 72 h. To assess the effect of cysteine and centrifugation on fertility, 136 females were randomly allotted in the following groups for artificial insemination with semen diluted in BTS and a) without centrifugation and cysteine (BTS/NC); b) without centrifugation and with 5.0 mM cysteine (BTSCYS/NC) or c) with centrifugation and with 5.0 mM cysteine (BTSCYS/CENT). After artificial insemination, the return to estrus rate and litter size were evaluated. In the first experiment, the quality of semen was determined by tests of sperm motility, vigor, morphology and viability (plasma and acrossomal membrane integrity and mitochondrial potential). In the second experiment, the semen were evaluated by the tests above, DNA compactation and function of plasma membrane. The treatments were evaluated at 0, 24, 48 and 72 h after dilution. In both experiments, the effect of treatments on the storage period was determined by analysis for repeated data (PROC MIXED) and the effect of treatments on the return to estrus rate and the number of piglets were analyzed by using PROC GLM of SAS software and applied the Tukey test for significant models. The percentage of morphological changes did not exceed 20% during storage for 72 h and do not differ between treatments in both experiments. However, the motility in the first experiment, vigor, integrity of plasma membrane and acrossomal well as the potential of mitochondria reduced the period of storage. The motility, vigor and viability decreased to levels below 10% in treatments CYS10.0, CYS20.0 in the first 24 hours of storage at 17 ºC. At the end of the storage period all groups had average below 65% of sperm with intact plasma membrane while the second experiment, treatment BTSCYS/CENT showed lower motility and force the other treatments, and the sperm motility below 60% from 24 hours of storage. The integrity of plasma membranes and acrossomal and the potential of mitochondria was less than 60% in treatments BTSCYS and BTSCYS/CENT. However in the field to the group BTSCYS showed lower average (8.83 ± 3.38) for infants and more return rate (86.05 ± 0.39) when compared to other groups. Therefore, the cysteine at low concentrations as well as maintains the control group the sperm quality. But despite treatment BTSCYS/NC have reached the same rates as the control group for sperm quality, was the treatment that received higher rates of return and lower number of piglets born. / O crescimento da suinocultura se deve a diversos avanços na área tecnológica. Buscando obter maior eficiência reprodutiva, foi analisado o efeito da cisteína ao diluente Beltsville Thawing Solution (BTS) e do processo de centrifugação sobre qualidade espermática. No primeiro experimento, foram avaliadas diferentes concentrações de cisteína no diluente BTS, conforme os seguintes tratamentos: BTS (grupo controle); CIS0,1 (BTS + 0,1 mM de cisteína); CIS0,5 (BTS + 0,5mM de cisteína); CIS1,0 (BTS + 1,0 mM de cisteína); CIS2,5 (BTS + 2,5 mM de cisteína); CIS5,0 (BTS + 5,0 mM de cisteína); CIS10,0 (BTS + 10,0 mM de cisteína) e CIS20,0 (BTS + 20,0 mM de cisteína). No segundo experimento, o sêmen foi dividido em: sêmen não centrifugado diluído em BTS/NC (grupo controle), sêmen não centrifugado diluído em BTS + 5,0 mM de cisteína (BTSCIS/NC), sêmen centrifugado diluído em BTS (BTS/CENT) e sêmen centrifugado diluído em BTS + 5,0 mM de cisteína (BTSCIS/CENT). Ambos os experimentos foram realizados para avaliar a influência dos diferentes tratamentos sobre a qualidade espermática quando o sêmen é armazenado a 17°C por até 72 horas. Para avaliar o efeito da cisteína e da centrifugação sobre fertilidade, 136 fêmeas foram selecionadas e inseminadas nos seguintes tratamentos: BTS/NC, BTSCIS/NC e BTSCIS/CENT. Após a inseminação artificial, as fêmeas foram avaliadas quanto a taxa de retorno e o tamanho da leitegada. A qualidade espermática no primeiro experimento foi determinada pelos testes de motilidade e vigor, alterações morfológicas e viabilidade espermática (membrana plasmática e acrossomal intactas e célula com potencial de mitocôndria). No entanto, no segundo experimento além dos testes citados anteriormente, foram realizados os testes de compactação de DNA e funcionalidade de membrana plasmática. As avaliações dos tratamentos foram realizadas 0, 24, 48 e 72 horas após a diluição do sêmen. Em ambos experimentos, o efeito dos tratamentos em relação ao período de armazenamento foi determinado através da análise para dados repetidos (PROC MIXED). O efeito dos tratamentos em relação a taxa de retorno e o número de nascidos foi analisado usando o PROC GLM, do programa estatístico SAS e aplicado o teste de Tukey quando o modelo foi significativo. A percentagem de alterações morfológicas não excedeu a 20% durante o armazenamento por 72 horas e nem diferiu entre os tratamentos, nos dois experimentos. Porém, no primeiro experimento a motilidade, o vigor, a integridade de membrana plasmática e acrossomal bem como o potencial de mitocôndria foram reduzidas ao longo do período de armazenamento. A motilidade, o vigor e a viabilidade diminuíram a níveis abaixo de 10% nos tratamentos CIS10,0 e CIS20,0 nas primeiras 24 horas de armazenamento a 17ºC. Ao final do período de armazenamento todos os grupos apresentavam média abaixo de 65% de espermatozóides com a membrana plasmática intacta. No segundo experimento, no entanto, o tratamento BTSCIS/CENT apresentou motilidade e vigor inferiores ao demais tratamentos, sendo a motilidade espermática inferior a 60% a partir de 24 horas de armazenamento. A integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de mitocôndria foram inferiores a 60% nos tratamentos BTSCIS e BTSCIS/CENT. No entanto na parte a campo, o grupo BTSCIS apresentou menor média (8,83 ± 3,38) de nascidos e maior taxa de retorno (86,05 ± 0,39) quando comparados aos outros grupos. Portanto, a cisteína em baixas concentrações mantém tão bem quanto o grupo controle a qualidade espermática. Mas, apesar do tratamento BTSCIS/NC ter atingido os mesmos índices que o grupo controle em relação qualidade espermática, foi o tratamento que obteve maior taxa de retorno e menor número de leitões nascidos.