O sêmen eqüino é muito utilizado na forma refrigerada, porém, para alguns garanhões, a longevidade espermática é baixa. Durante a refrigeração o espermatozóide pode ser afetado por vários fatores, que podem causar a perda da integridade da membrana plasmática, danos no acrossomo e disfunções mitocondriais, resultando em perda irreversível de motilidade e capacidade fecundante. A composição e concentração do plasma seminal podem causar efeitos deletérios ao espermatozóide, sendo a centrifugação do sêmen uma alternativa para minimizar estes efeitos. Este experimento foi realizado para verificar o efeito da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado a 5°C por até 72h. Foram realizadas cinco colheitas de sêmen de quatro garanhões. O sêmen foi avaliado quanto ao volume e concentração, e em seguida dividido em dois tratamentos, sem centrifugação (S) e centrifugado (C) (300g/10min). Ambos foram diluídos na concentração final de 30 x106 eptz/mL em diluidor a base de leite desnatado e então refrigerados. Foram analisadas as características do movimento espermático (CASA), morfologia espermática (DIC), integridade das membranas plasmática e acrossomal (PI/FITC-PSA), potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e peroxidação lipídica das membranas (C11-BODIPY581/591), sendo estas três últimas análises por citometria de fluxo. As análises foram realizadas no tempo 0 e 24, 48 e 72 horas após a refrigeração. O delineamento experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS, submetidos à análise de variância e às interações determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser ao nível de 5% de significância. O espermatozóide do sêmen centrifugado apresentou valores médios maiores de motilidade total e progressiva, ALH, STR e LIN (P<0,05), porém os valores das velocidades e BCF foram menores (P<0,05). Houve efeito do tempo nas características de movimento espermático (P<0,05), exceto para STR. Não houve efeito da centrifugação e nem do tempo quanto às características morfológicas dos espermatozóides refrigerados, esta só diferiu entre os garanhões (P<0,05). Por sua vez, a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial espermáticas foram maiores nos sêmen centrifugado (P<0,05) e suas porcentagens decresceram com o tempo (P<0,05). A peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide refrigerado aumentou somente nas primeiras 24h (P<0,05) e não foi influenciada pela centrifugação. Conclui-se que a centrifugação e a retirada do plasma seminal melhoram a qualidade do sêmen refrigerado eqüino, principalmente em garanhões com baixa longevidade, sendo esta influenciada pelas características iniciais da morfologia espermática. Ainda, tempo de refrigeração induz a um declínio da qualidade seminal. E, por fim, a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide parece não ser a principal causa de alterações da integridade das membranas e do potencial de membrana mitocondrial durante a refrigeração do sêmen eqüino. / Equine cooled semen is frequently used, although the longevity for some stallions is low. During the cooling process the spermatozoon can be affected by several factors that can cause loss of plasma membrane integrity, acrosomal damage and mitochondrial dysfunctions, resulting in irreversible loss of motility and fertilizing capacity. The composition and concentration of seminal plasma could cause harmful effects to the sperm, being semen centrifugation an alternative to minimize these effects. This experiment was designed to verify the effects of the centrifugation in motion characteristics, membranes integrity and lipid peroxidation of cooled equine sperm to 5°C until 72 hours. Five ejaculates from four stallions were collected. The semen was evaluated for volume and concentration, then split in two treatments, no centrifugation (N) and with centrifugation (W) (300g/10min). Both were diluted in the final concentration 30 x106 spermatozoa/mL in a skin milk extender and then cooled. The following analyses were performed: the sperm motion characteristics (CASA), morphology (DIC), plasma and acrosomal membranes integrity (PI/FITC-PSA), mitochondrial membrane potential (JC-1) and membrane lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591), the last three analyses were assessed in flow citometry. The analyses were performed in time 0 and 24, 48 and 72 hours after cooling. The experimental design was random blocks with repeated-measures. The data were analyzed by the SAS program, submitted to analysis of variance and the interactions by the test of Greenhouse-Geisser at the level of 5% of significance. The values were larger in W semen for total and progressive motility, ALH, STR and LIN (P<0,05), however the values of the three types of speed and BCF were smaller (P<0,05). There was effect of time in the motion characteristics of sperm (P<0,05), except for STR. There was not any effect of centrifugation and time for the morphologic characteristics of cooled spermatozoa, that only differed among stallions (P<0,05). On the other hand, the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane were larger in W semen (P<0,05) and their percentages decreased within time (P<0,05). The membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm only increased in the first 24 hours (P<0,05) and it was not influenced by centrifugation. In conclusion, the centrifugation and withdrawal of the seminal plasma improve semen quality of the cooled equine sperm, mainly in stallions with low longevity, which is influenced by the initials characteristics of sperm morphology. Moreover, time of cooling induces a decline of seminal quality. Finally, the membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm seems not to be the main cause of alterations in the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane during the cooling of equine semen.

O sêmen eqüino é muito utilizado na forma refrigerada, porém, para alguns garanhões, a longevidade espermática é baixa. Durante a refrigeração o espermatozóide pode ser afetado por vários fatores, que podem causar a perda da integridade da membrana plasmática, danos no acrossomo e disfunções mitocondriais, resultando em perda irreversível de motilidade e capacidade fecundante. A composição e concentração do plasma seminal podem causar efeitos deletérios ao espermatozóide, sendo a centrifugação do sêmen uma alternativa para minimizar estes efeitos. Este experimento foi realizado para verificar o efeito da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado a 5°C por até 72h. Foram realizadas cinco colheitas de sêmen de quatro garanhões. O sêmen foi avaliado quanto ao volume e concentração, e em seguida dividido em dois tratamentos, sem centrifugação (S) e centrifugado (C) (300g/10min). Ambos foram diluídos na concentração final de 30 x106 eptz/mL em diluidor a base de leite desnatado e então refrigerados. Foram analisadas as características do movimento espermático (CASA), morfologia espermática (DIC), integridade das membranas plasmática e acrossomal (PI/FITC-PSA), potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e peroxidação lipídica das membranas (C11-BODIPY581/591), sendo estas três últimas análises por citometria de fluxo. As análises foram realizadas no tempo 0 e 24, 48 e 72 horas após a refrigeração. O delineamento experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS, submetidos à análise de variância e às interações determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser ao nível de 5% de significância. O espermatozóide do sêmen centrifugado apresentou valores médios maiores de motilidade total e progressiva, ALH, STR e LIN (P<0,05), porém os valores das velocidades e BCF foram menores (P<0,05). Houve efeito do tempo nas características de movimento espermático (P<0,05), exceto para STR. Não houve efeito da centrifugação e nem do tempo quanto às características morfológicas dos espermatozóides refrigerados, esta só diferiu entre os garanhões (P<0,05). Por sua vez, a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial espermáticas foram maiores nos sêmen centrifugado (P<0,05) e suas porcentagens decresceram com o tempo (P<0,05). A peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide refrigerado aumentou somente nas primeiras 24h (P<0,05) e não foi influenciada pela centrifugação. Conclui-se que a centrifugação e a retirada do plasma seminal melhoram a qualidade do sêmen refrigerado eqüino, principalmente em garanhões com baixa longevidade, sendo esta influenciada pelas características iniciais da morfologia espermática. Ainda, tempo de refrigeração induz a um declínio da qualidade seminal. E, por fim, a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide parece não ser a principal causa de alterações da integridade das membranas e do potencial de membrana mitocondrial durante a refrigeração do sêmen eqüino. / Equine cooled semen is frequently used, although the longevity for some stallions is low. During the cooling process the spermatozoon can be affected by several factors that can cause loss of plasma membrane integrity, acrosomal damage and mitochondrial dysfunctions, resulting in irreversible loss of motility and fertilizing capacity. The composition and concentration of seminal plasma could cause harmful effects to the sperm, being semen centrifugation an alternative to minimize these effects. This experiment was designed to verify the effects of the centrifugation in motion characteristics, membranes integrity and lipid peroxidation of cooled equine sperm to 5°C until 72 hours. Five ejaculates from four stallions were collected. The semen was evaluated for volume and concentration, then split in two treatments, no centrifugation (N) and with centrifugation (W) (300g/10min). Both were diluted in the final concentration 30 x106 spermatozoa/mL in a skin milk extender and then cooled. The following analyses were performed: the sperm motion characteristics (CASA), morphology (DIC), plasma and acrosomal membranes integrity (PI/FITC-PSA), mitochondrial membrane potential (JC-1) and membrane lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591), the last three analyses were assessed in flow citometry. The analyses were performed in time 0 and 24, 48 and 72 hours after cooling. The experimental design was random blocks with repeated-measures. The data were analyzed by the SAS program, submitted to analysis of variance and the interactions by the test of Greenhouse-Geisser at the level of 5% of significance. The values were larger in W semen for total and progressive motility, ALH, STR and LIN (P<0,05), however the values of the three types of speed and BCF were smaller (P<0,05). There was effect of time in the motion characteristics of sperm (P<0,05), except for STR. There was not any effect of centrifugation and time for the morphologic characteristics of cooled spermatozoa, that only differed among stallions (P<0,05). On the other hand, the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane were larger in W semen (P<0,05) and their percentages decreased within time (P<0,05). The membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm only increased in the first 24 hours (P<0,05) and it was not influenced by centrifugation. In conclusion, the centrifugation and withdrawal of the seminal plasma improve semen quality of the cooled equine sperm, mainly in stallions with low longevity, which is influenced by the initials characteristics of sperm morphology. Moreover, time of cooling induces a decline of seminal quality. Finally, the membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm seems not to be the main cause of alterations in the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane during the cooling of equine semen.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

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