Les corps nucléaires PML (CNs) sont des structures sphériques organisées par la protéine PML où, de nombreuses protéines impliquées dans divers processus biologiques tels que la sénescence, la mort cellulaire ou la défense virale, y sont recrutées. Ces protéines ont été identifiées individuellement dans des études spécifiques mais aucune étude n’avait permis la purification des CNs et l’établissement de liste des partenaires de PML de façon systématique. La protéine PML est sensible à l’oxydation et le stress oxydant promeut son assemblage en CNs permettant le recrutement de l’enzyme E2 clé de la conjugaison, UBC9. Les interférons (IFNs), cytokines aux propriétés antivirales induisent l’expression de PML. L’arsenic et les IFNs augmentent l’assemblage des CNs.Dans cette étude nous avons exploré, in vivo, le rôle de PML dans la sumoylation en réponse au stress en utilisant deux modèles de souris et un modèle cellulaire, les cellules souches embryonnaires de souris (mESC), exprimant des versions taguées de SUMO1 ou SUMO2. Nous avons montré que PML augmente rapidement la sumoylation dans les foies de souris KI His6-HA-SUMO1 en réponse aux traitements arsenic/IFN. De façon similaire, dans la leucémie aiguë promyélocytaire (LAP), où les CNs sont désorganisés, l’arsenic promeut la reformation des CNs et la conjugaison par SUMO. L’analyse par spectrométrie de masse quantitative des conjugués His10-SUMO2 a permis de mettre en évidence une liste de protéines sumoylées en réponse au traitement thérapeutique à l’arsenic. Parmi ces protéines, TRIM28/KAP1 et d’autres protéines appartenant au même complexe régulant la chromatine ont été identifiées. TRIM28, qui joue un rôle clé dans la répression des rétrovirus endogènes (ERV) dans les mESC, est sumoylée de façon dépendante de PML dans ces cellules. Les CNs régulent également l’ubiquitinylation et la dégradation dépendante du protéasome, de certaines de ces protéines. Enfin, nous avons montré que les CNs favorisent la formation de chaînes SUMO2/3, expliquant le rôle des CNs dans la dégradation des protéines. Cette étude nous a permis de mettre en évidence que les CNs sont des compartiments nucléaires qui contrôlent la conjugaison de diverses protéines dans des conditions physiologiques de stress cellulaire, montrant pour la première fois leur activité de contrôle de MPT in vivo. / PML drives assembly of PMLNuclear Bodies (NBs) where it recruits hundreds of serendipitously-identified proteins, among which the key UBC9 E2-sumoylation enzyme. Interferons (through transcriptional PML induction) and arsenic or oxidative stress (through PML aggregation) dramatically enhance NB assembly. Here we directly investigated any role for PML in stress-responsive sumoylation in vivo. We demonstrate that PML very rapidly promotes arsenic/interferon-responsive sumoylation in mouse liver or mouse embryonic stem cells. Similarly, in Acute Promyelocytic Leukemia (APL), where PML NBs are disorganized in the basal state, arsenic therapy promoted NB-reformation and broad SUMO-conjugation. Label free quantitative proteomic analysis of His10-SUMO2-conjugates revealed a comprehensive list of therapy-responsive sumoylated proteins, among which TRIM28 and other proteins belonging to the same epigenetic complex. PML NBs-regulated sumoylation also drives ubiquitination and proteasome-dependent degradation of some targets. Finally, by expressing conjugation-resistant SUMO2, we demonstrate that PML NBs promotes processive SUMO2/3 chain elongation, thus explaining PML role in partner degradation. Collectively, our findings highlight the key activity of NBs in stress-regulated sumoylation/degradation in vivo.

La sénescence cellulaire est une réponse aux stresses selon laquelle des cellules pouvant proliférer optent pour entrer dans un arrêt du cycle cellulaire en réponse à une variété de stimulations intrinsèques et extrinsèques telle que, par exemple, le raccourcissement des télomères, un stress oxydatif, des dommages à l’ADN ou l’activation constitutive d’oncogènes. Toutes ces stimulations ont en commun le potentiel d’initier ou de promouvoir une transformation néoplasique qui peut dégénérer en cancer. En fait, la sénescence est maintenant acceptée comme un mécanisme cellulaire autonome pour empêcher le développement du cancer et elle est reconnue, particulièrement dans les cellules humaines, pour s’établir et se maintenir à l’aide d’au moins deux voies de suppression tumorale majeures : les voies de p53/p21CIP et de p16INK4A/pRB. Ces deux voies sont capables d’activer et d’augmenter l’expression d’un autre suppresseur tumoral : la protéine PML. En tant que suppresseur de tumeur, PML est suffisant pour induire la sénescence dans des cellules normales, mais il n’arrive généralement pas à activer une réponse complète de sénescence dans les cellules cancéreuses. Considérant ces faits, le premier objectif de cette thèse était d’étudier le mécanisme de résistance des cellules cancéreuses contre la sénescence induite par PML. Nous avons trouvé que, dans des cellules normales, la surexpression de CDK4 ou de CDK6 (CDK4/6) est suffisante pour contourner la sénescence induite par PML. De même dans les cellules cancéreuses, l’expression de ces kinases, souvent retrouvées augmentées dans de nombreux cancers, prévient probablement l’induction d’une sénescence par PML. Effectivement, grâce à l’inhibition de l’expression et/ou de la fonction kinase des CDK4/6, nous avons réussi à restaurer un programme de sénescence dans des cellules cancéreuses. En fait, l’utilisation de palbociclib, un inhibiteur spécifique de CDK4/6 maintenant en essais cliniques, permet d’augmenter l’habileté de PML à induire un arrêt de croissance plus fort et plus durable dans des cellules en cultures ainsi qu’une meilleure réduction de la progression de tumeurs dans des souris. Cette sénescence plus complète corrèle avec une augmentation de la présence de marqueurs d’autophagie, une meilleure répression des gènes cibles des E2F et une signature d’expression de gènes correspondant à l’inhibition de la méthylation de l’ADN. Ce dernier point découle du fait que l’inhibition de CDK4/6 par le palbociclib promeut une dégradation par autophagie de la DNA méthyltransférase DNMT1. Nous avons aussi démontré que CDK4 est capable d’interagir avec DNMT1 et de le phosphoryler in vitro. Ces résultats soulignent la valeur potentielle des inhibiteurs de CDK4/6 en tant que modulateurs épigénétiques pour faciliter l’activation de la sénescence dans des cellules cancéreuses. La sénescence induite par PML est fortement liée aux modifications post-traductionnelles. Parmi ces dernières, la SUMOylation joue un rôle important dans la fonction d’échafaudeur de PML et dans la formation des corps de PML. Les corps de PML sont des structures nucléaires dynamiques stimulées par des stresses, comme l’activation d’oncogènes menant à la sénescence, et dont la formation permet la séquestration de protéines spécifiques pour leur régulation et/ou pour leur modification post-traductionnelle. À travers le recrutement de protéines, les corps de PML régulent de nombreuses fonctions cellulaires telles que la sénescence, l’apoptose, la réponse antivirale, la réponse aux dommages à l’ADN et la régulation de l’expression de gènes. Compte tenu de cela, le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser le rôle de la SUMOylation dans la sénescence induite par un oncogène, soit par l’expression de l’oncogène RAS. À l’aide d’une analyse du protéome de SUMO3 dans les cellules sénescentes versus des cellules en croissances, nous avons pu identifier 25 sites de SUMOylation dans 23 protéines dont l’incidence était significativement régulée par la sénescence. Il est à noter que la plupart de ces protéines (un tiers) sont connues pour être associées au corps de PML. Curieusement, UBC9 (la seule enzyme E2 pour la SUMOylation) a été retrouvée plus SUMOylée dans la sénescence sur sa Lys-49. Des études fonctionnelles d’un mutant d’UBC9 pour la Lys-49 ont démontré une diminution de son association aux corps de PML et la perte de la capacité d’UBC9 surexprimé à retarder la sénescence. De plus, la localisation forcée d’UBC9 dans les corps de PML gêne la sénescence induite par PML ou RAS. Ces résultats nous permettent de proposer des fonctions pro- et anti-sénescence de la SUMOylation des protéines, particulièrement pour UBC9. Mots-clés : Sénescence, PML, CDK4 et CDK6 (CDK4/6), méthylation de l’ADN, palbociclib, corps de PML, SUMOylation, UBC9 / Cellular senescence is a stress response wherein proliferating competent cells undergo a stable cell cycle arrest in response to a variety of intrinsic and extrinsic stimuli, including telomere shortening, oxidative stress, DNA damage or the constitutive activation of oncogenes among others. All these stimuli have in common the potential to initiate or promote neoplastic transformation that can degenerate in cancer. Senescence, particularly in human cells, is established and maintained by at least two major tumor suppressor pathways: the p53/p21CIP and p16INK4A/pRB pathways and is now accepted as a potent cell-autonomous mechanism for suppressing the development of cancer. Both pathways are able to activate and increase the expression of the tumor suppressor protein PML. As a tumor suppressor, PML is sufficient to induce senescence in normal cells; however, upon the same stimuli, cancer cells fail to engage a complete senescence response. Given this, the first aim of this thesis is to investigate the resistance mechanisms of cancer cells to PML-induced senescence. We found that overexpression of the CDK4 and CDK6 (which are often up-regulated in cancer) are sufficient to bypass PML-induced senescence in normal cells. In cancer cells the expression of these kinases impairs the PML-induced senescence. By inhibiting the expression and/or function of CDK4/6 we were able to restore the senescence program in cancer cells. Also, the specific CDK4/6 inhibitor palbociclib (currently used in clinical trials) increased the ability of PML to regulate a stronger and more permanent growth inhibition in cell culture and decreased tumor progression in mice. This complete senescence response correlated with an increase in autophagy markers, repression of E2F target genes and a gene expression signature of blocked DNA methylation. Furthermore, CDK4/6 inhibition by palbociclib promotes autophagy-dependant degradation of the DNA methyltransferase DNMT1. More important, we were able to demonstrate that CDK4 directly interacts and phosphorylates DNMT1 in vitro. These results highlight the potential value of CDK4/6 inhibitors as epigenetic modulators to facilitate activation of cellular senescence in cancer cells. PML-induced senescence is tightly regulated by post-translational modifications (PTMs). Among these PTMs, SUMOylation plays an important role in the scaffold function of PML and the formation of the PML-NBs (PML-Nuclear Bodies). PML-NBs are dynamic structures triggered by stress such as oncogene-induced senescence, and its formation allows the sequestration of target proteins for their regulation and/or its post-translational modification. By protein recruitment, PML-NBs regulate several cellular functions such as senescence, apoptosis, antiviral response, DNA repair and gene regulation. Given this; the second aim of this thesis is to characterize the role of SUMOylation in oncogene mediated cellular senescence, specifically by the expression of the oncogene RAS. By a SUMO3 proteome analysis of senescent cells we were able to identify 25 SUMO sites in 23 proteins that were significantly regulated during senescence. Importantly, most of these proteins were PML-NB associated. Interestingly, UBC9 (the only SUMO E2 enzyme), was found more SUMOylated in senescence on its Lys-49. Functional studies of a UBC9 mutant in Lys-49 showed a decreased association to PML-NBs and the loss of UBC9’s ability to delay senescence. Moreover, forced localization of UBC9 into PML-NBs counteracted RAS and PML-induced senescence. These results allowed us to propose a pro- and an anti-senescence function of protein SUMOylation, specifically for UBC9. Keywords: Senescence, PML, CDK4/6, DNA methylation, palbociclib, PML-NBs, SUMOylation, UBC9

Les cassures double-brin de l’ADN (CDB) sont des événements clés dans la réponse aux rayonnements ionisants qui, avec le profil génétique et épigénétique individuel, peuvent conditionner le devenir des tissus sains d’un individu exposé. À la suite des cassures de la molécule d’ADN et de la déstabilisation de la chromatine, une série de modifications post-traductionnelles des histones se produit, notamment la phosphorylation de la serine 139 de l'histone H2A.X (gamma-H2A.X), conduisant à la formation de foyers radio-induits. La réparation des CDB, et donc la disparition de ces foyers, a lieu dans les heures suivant l’exposition. Toutefois, une certaine proportion de ces foyers gamma-H2A.X persiste 24 heures après l’irradiation. La nature et le rôle de ces foyers persistants sont encore peu clairs. L’objectif de ce travail est d'explorer les caractéristiques de ces foyers persistants et leurs conséquences sur le devenir des cellules. Pour étudier la dynamique des foyers radio-induits, nous avons exposé des HUVEC synchronisées en phase G0/G1 à des doses de 1 et 5 Gy de rayons X. Les foyers radio-induits ont été étudiés à partir de 10 minutes et jusqu'à 7 jours après l'exposition par l’analyse de gamma-H2A.X et de l’association temporelle de la protéine 53BP1 et des CN-PML (corps nucléaires PML). L’impact des foyers persistants sur la prolifération cellulaire a également été exploré. Nous avons analysé en microscopie à fluorescence une moyenne de 4 000 cellules pour chaque condition à l'aide d'une analyse d’image permettant la détection automatique des noyaux et des foyers. L'analyse d'un grand nombre d‘évènements nous a permis de discriminer des sous-populations de cellules ou de foyers sur la base de différentes caractéristiques, telles que leur aire ou la phase du cycle cellulaire, et de mesurer leur représentativité dans l'ensemble de la population de cellules exposées. Ainsi, nous avons déterminé que les foyers gamma-H2A.X persistant ont une aire supérieure à 0,72 ± 0,11 µm² et qu’ils sont toujours colocalisés avec 53BP1. Plus de 70% des cellules exposées à 5 Gy ont au moins un foyer persistant 24 heures après l'exposition. De plus, ces foyers persistants sont observables au moins jusqu'à 7 jours après l’irradiation. Une association spatiale significative entre les CN-PML et les foyers gamma-H2A.X a été observée à partir de 10 minutes après l'exposition et 24 heures après l’exposition, environ 90% des foyers persistants sont associés à un CN-PML. De plus, la présence de foyers persistants ne bloque pas définitivement la prolifération des cellules. Cependant, la fréquence des foyers persistants est plus faible dans les cellules filles que dans les cellules irradiées, probablement en raison d'une certaine proportion de distribution asymétrique des foyers persistants entre les cellules filles. Nous avons également mesuré une corrélation positive entre la présence d'un foyer persistant et la probabilité de mauvaise ségrégation de l'ADN par l'observation de phénomènes de catastrophes mitotiques. Il semble donc que la structure formée après le passage d'un foyer persistant à travers les phases S et G2 soit susceptible d’empêcher la séparation correcte des chromatides sœurs du chromosome affecté. Nous suggérons donc que la nature des foyers persistants n’est pas la même avant et après la première division cellulaire due à une résolution anormale de l'anaphase. Ces assemblages chromosomiques atypiques résultants d’anaphases anormales pourraient être létaux pour la cellule ou entraîner un déséquilibre du dosage génique et une instabilité génomique accrue pouvant conduire à une mosaïque de phénotypes cellulaires. / The DNA double-stranded breaks (DSB) are key events in the cell response to ionizing radiation that may affect, with the individual genetic and epigenetic profile, the fate of healthy tissues of people exposed. Following initial breaks and chromatin destabilization, a set of post-translational modifications of histones occurs, including the phosphorylation of serine 139 of histone H2AX (gamma-H2A.X), which leads to the formation of ionizing radiation-induced foci (IRIF). DSB repair results in the disappearance of most IRIF within hours after exposure. However, a proportion of IRIF remains 24 hours upon irradiation. The nature and role of these persistent IRIF are still unclear. The goal of this work is to explore the characteristics of these persistent IRIF and their consequences on the cell behavior. To investigate the dynamic of IRIF in our model, we exposed G0/G1-phase synchronized HUVECs to 1 or 5 Gy of X-rays. IRIF were studied from 10 minutes up to 7 days after exposure by monitoring gamma-H2A.X foci, their temporal association with 53BP1 protein and PML NBs (Promyelocytic leukemia nuclear bodies), and their impact on cell proliferation. We analyzed a mean of 4 000 cells for each condition using an automated detection of nuclei and foci. The analysis of a large number of cells and foci allowed us to screen subpopulations of cells or foci through different characteristics, such as size, shape or cell cycle phase among others, and to weight their representativeness in the whole population of exposed cells. We identified that persistent gamma-H2A.X foci after irradiation had a size superior to 0.72 ± 0.11 µm² and always collocated with 53BP1. More than 70% of cells exposed to 5 Gy had at least one persistent IRIF 24 hours after exposure and we observed these persistent IRIF up to 7 days post irradiation. A significant spatial association between PML NBs and IRIF was observed from 10 minutes after exposure; at 24h post irradiation, around 90% of persistent IRIF were associated with PML NBs. Moreover we demonstrated that persistent IRIF did not block cell proliferation definitively. The frequency of IRIF was lower in daughter cells, probably due to a certain amount of asymmetric distribution of IRIF between them. We report a positive association between the presence of an IRIF and the likelihood of DNA missegregation by observation of mitotic catastrophes. Hence, the structure formed after the passage of a persistent IRIF across the S and G2 phases may impede the correct segregation of sister chromatids of the chromosome affected. Consequently, the nature of IRIF in the nucleus of daughter cells might differ before and after the first cell division due to an abnormal resolution of anaphase. The resulting atypical chromosomal assembly may be lethal or result in a gene dosage imbalance and possible enhanced genomic instability, and could lead to a patchwork of cell phenotypes.

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique. / The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin.

L'établissement de latence du virus de l'Herpès simplex 1 (HSV1) est contrôlé par les corps nucléaires PML (PML-NBs) mais leur implication exacte reste encore confuse. Une des caractéristiques majeures de la latence du virus est l'interaction entre le génome viral et les PML-NBs formant des structures nommées viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). L'utilisation d'un modèle d'infection de fibroblastes primaires humains, qui reproduit la formation des vDCP-NBs, combinée à une approche par immuno-FISH, a permis de montrer que les vDCP-NBs contiennent l'histone H3.3 et ses chaperons, les complexes DAXX-ATRX et HIRA. La protéine HIRA a été également observé au sein des vDCP-NBs dans les neurones des ganglions trijumeaux de souris infectées par HSV1. Des expériences de ChIP-qPCR dans des cellules exprimant H3.3 ou H3.1 tagguées, nous a permis de déterminer que le génome viral est spécifiquement chromatinisé avec l'histone H3.3. La déplétion d'une seule protéine des complexes chaperons de H3.3 affecte légèrement l'incorporation de H3.3 dans les génomes viraux latents. Au contraire, l'absence de PML diminue significativement la chromatinisation H3.3 du génome HSV-1 latent sans remplacement par H3.1. Cette étude démontre une régulation épigénétique du génomes HSV1 latent par une chromatinisation dépendante de H3.3 impliquant les complexes chaperons DAXX-ATRX et HIRA. De plus, cette étude révèle un rôle majeur des PML-NBs dans la chromatinisation H3.3 des génomes HSV1 latent / Herpes simplex virus 1 (HSV-1) latency establishment is tightly controlled by PML nuclear bodies (PML-NBs) although their exact implication is still elusive. A hallmark of HSV-1 latency is the interaction between latent viral genomes and PML-NBs leading to the formation of viral DNA-containing PML-NBs (vDCP-NBs). Using a replication defective HSV-1 infected human primary fibroblast model reproducing the formation of vDCP-NBs, combined with an IF-FISH approach developed to detect latent HSV-1, we show that vDCP-NBs contain both histone H3.3 and its chaperone complexes, i.e. the DAXX/ATRX and the HIRA complex. HIRA was also detected co-localizing with vDCP-NBs present in trigeminal ganglia neurons from HSV-1 infected WT mice. ChIP-qPCR performed on fibroblasts stably expressing tagged H3.3 or H3.1 show that latent HSV1 genomes are chromatinized almost exclusively with H3.3. Depletion of single proteins from the H3.3 chaperone complexes only mildly affects H3.3 deposition on the latent HSV1 genome. In contrast, absence of PML significantly impacts on the chromatinization of the latent genomes with H3.3 without replacement with H3.1. Consequently, the study demonstrates a specific epigenetic regulation of latent HSV-1 through an H3.3-dependent HSV-1 chromatinization involving both H3.3 chaperones DAXX/ATRX and HIRA complexes. Additionally, the study reveals that PML-NBs are major actors of the latent HSV-1 H3.3 chromatinization through a PML-NBs/histone H3.3/H3.3 chaperones axis