Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

L'objectif de cette thèse est l'étude du métabolisme de Corynebacterium glutamicum, et de ses potentialités, au cours de procédés aéro-anaérobies. Après une première phase avec apport d'oxygène pour permettre la croissance bactérienne, une phase anaérobie est induite par arrêt de l'aération et réduction de la vitesse d'agitation. Dans ces conditions, le lactate est le principal métabolite produit. La synthèse de ce dernier a été améliorée en jouant, essentiellement, sur le moment de la transition entre les 2 phases. C. glutamicum 2262 peut ainsi produire 27 g/l de lactate en mode discontinu et 55 g/l en mode semi-continu, suite à un arrêt de l'aération lorsque la concentration en biomasse est d'environ 2,6 g/l. Afin d'exploiter la voie de synthèse d'acide lactique chez C. glutamicum pour la production d'éthanol, les gènes PDC et ADH de Zymomonas mobilis ont été exprimés sous le contrôle du promoteur ldhA endogène de C. glutamicum 2262 et d'une souche de C. glutamicum 2262 sans ldhA. Bien que les productivités en éthanol de ces souches aient été relativement faibles, la suppression de ldhA a entraîné des augmentations de la concentration en éthanol d'environ 15 fois. Une stratégie similaire a été utilisée pour la production d'itaconate. Comme dans le cas de l'éthanol, la concentration en itaconate obtenue est demeurée très faible malgré des essais d'amélioration du procédé de mise en oeuvre de la souche productrice d'itaconate / The objective of this work is the study of Corynebacterium glutamicum metabolism, and of its potentialities, during an aero-anaerobic process. After a first phase during which the oxygen was supplied to favor the bacterial growth, the anaerobic phase was induced by the stopping of the oxygen supply and the decreasing of the agitation speed. In these culture conditions, lactate was the main metabolite produced. The production of this organic acid has been increased by modifying the transition time between the aerobic and the anaerobic phases. C. glutamicum 2262 was able to produce up to 27 g/l lactate during a batch process and up to 55 g/l during a fed batch process. To exploit the lactic acid synthesis pathway of C. glutamicum for ethanol production, the PDC and ADH genes from Zymomonas mobilis were expressed under the control of the endogenous promoter of ldhA, in the wild-type strain and in a ldhA-disrupted strain of C. glutamicum 2262. Although the ethanol productivities of these engineered strains were relatively low, the depletion of ldhA resulted in the increases of ethanol final concentration up to 15 times. A similar strategy was applied for the production of itaconate. As previously for the ethanol production, the final concentration of itaconate remained very low despite of some modifications of the process

En raison de leur contribution à la virulence bactérienne, les lipoprotéines et les membres de la voie de biogenèse des lipoprotéines représentent des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antibiotiques. À la suite de translocation à travers la membrane interne la future lipoprotéine ancrée dans la membrane par l’intermédiaire de son peptide signal, va subir en premier lieu l’addition de sn-1,2-diacylglyceryle sur la fonction sulfhydryle de la future cystéine N-terminale de la lipoprotéine mature. Cette modification est catalysée par Lgt (prolipoprotéin diacylglycérol transférase) avant même que le peptide signal de la lipoprotéine ne soit clivé par Lsp (lipoprotéine signal peptidase). L’action de la peptidase permet de libérer l’amine terminale de la cystéine qui pourra alors, chez les bactéries à Gram-négatif, être acylée par Lnt (lipoprotéin aminoacyl transférase). La présence d’un apolipoprotéine N-acyltransférase (Ppm2-Ms) impliquées dans la N-acylation de LppX a récemment été montrée chez M. smegmatis. Ppm2-Ms fait partie de l'opéron ppm dans laquelle ppm1, une synthase polyprénol-monophosphomannose, a été révélée essentielle dans la synthèse lipoglycans mais dont la fonction dans la biosynthèse des lipoprotéines est totalement inconnue. Afin de clarifier le rôle de l'opéron ppm dans la biosynthèse des lipoprotéines, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles de deux modèles (lipoprotéines AmyE et LppX) dans les mutants Δppm1 et Δppm2 chez C. glutamicum.Nos résultats montrent que les deux lipoprotéines modèles sont ancrées dans la membrane et que leurs extrémités N-terminales sont N-acylés par Ppm2-Cg. Le peptide N-teminal acylé de LppX a été également modifié par des groupements d'hexose. Cette O-glycosylation est localisée dans le peptide N-terminal de LppX mais absente dans le mutant Δppm1. Tandis compromise en l'absence de Cg-PPM2, O-glycosylation LppX pourrait être rétabli lorsque Cg-PPM1, Cg-PPM2 ou l'homologue Mt-ppm1 de M. tuberculosis a été surexprimée. Ensemble, ces résultats montrent pour la première fois que Ppm1-Cg (Ppm synthase) et Ppm2-Cg (Lnt) fonctionnent dans une voie de biosynthèse commune dans laquelle la glycosylation et la N-acylation des lipoprotéines sont étroitement couplés / Due to their contribution to bacterial virulence, lipoproteins and members of the lipoprotein biogenesis pathway represent potent drug targets. Following translocation across the inner membrane, lipoprotein precursors are acylated by lipoprotein diacylglycerol transferase (Lgt), cleaved off their signal peptides by lipoprotein signal peptidase (Lsp) and, in Gram-negative bacteria, further triacylated by lipoprotein N-acyl transferase (Lnt). The existence of an active apolipoprotein N-acyltransferase (Ms-Ppm2) involved in the N-acylation of LppX was recently reported in M. smegmatis. Ms-Ppm2 is part of the ppm operon in which Ppm1, a polyprenol-monophosphomannose synthase, has been shown to be essential in lipoglycans synthesis but whose function in lipoprotein biosynthesis is completely unknown. In order to clarify the role of the ppm operon in lipoprotein biosynthesis, we investigated the post-translational modifications of two model lipoproteins (AmyE and LppX) in C. glutamicum ∆ppm1 and ∆ppm2 mutants. Our results show that both proteins are anchored into the membrane and that their N-termini are N-acylated by Cg-Ppm2. The acylated Ntermina peptide of LppX was also found to be modified by hexose moieties. This O-glycosylation is localized in the N-terminal peptide of LppX and disappeared in the ∆ppm1 mutant. While compromised in the absence of Cg-Ppm2, LppX Oglycosylation could be restored when Cg-Ppm1, Cg-Ppm2 or the homologous Mt-Ppm1 of M. tuberculosis was overexpressed. Together, these results show for the first time that Cg-Ppm1 (Ppm synthase) and Cg-Ppm2 (Lnt) operate in a common biosynthetic pathway in which lipoprotein N-acylation and glycosylation are tightly coupled.

Corynebacterium glutamicum is together with C. callunae and C. efficiens a member of the diverse group of mycolic-acid containing actinomycetes, the mycolata. These bacteria are potent producer of glutamate, lysine and other amino acids on industrial scale. The cell walls of most actinomycetes contain besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex large amounts of mycolic acids. This three-layer envelope is called MAP (mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan) complex and it represents a second permeability barrier beside the cytoplasmic membrane similar to the outer membrane of Gram-negative bacteria. In analogy to the situation in the outer membrane of Gram-negative bacteria, channels are present in the mycolic acid layer of the mycobacterial cell wall for the passage of hydrophilic solutes. Molecular studies have provided far-reaching findings on the amino acid flux and its balance in C. glutamicum in general, but the L-glutamate export still remains unknown. The properties of the outer layers, typical of mycolata, seem to be of major importance in this process, and diffusion seems to play a key role for this part of the cell wall. The major aim of this thesis was to identify and study novel channel-forming proteins of the amino acid producers C. glutamicum, C. callunae and C. efficiens. Cell wall extracts of the organisms were investigated and a novel pore-forming protein, named PorH, that is homologue in all three organisms, was detected and characterized. PorHC.glut was isolated from C. glutamicum cells cultivated in minimal medium. The protein was identified in lipid bilayer experiments and purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column. The purified protein forms cation-selective channels with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of about 2.5 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. Organic solvent extracts were used to study the permeability properties of the cell wall of C. callunae and C.efficiens. The cell extracts contained channel-forming activity, the corresponding proteins were purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column and named PorHC.call and PorHC.eff. Channels formed by PorHC.call are cation-selective with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of 3 nS, whereas PorHC.eff forms slightly anion selective channels with an average single-channel conductance of 2.3 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. The PorH proteins were partially sequenced and the corresponding genes, which were designated as porH, were identified in the published genome sequence of C. glutamicum and C. efficiens. The chromosome of C. callunae is not sequenced, but PorHC.call shows a high homology to PorHC.eff and PorHC.glut. The proteins have no N-terminal extension, only the inducer methionine, which suggests that secretion of the proteins could be very similar to that of PorAC.glut of C. glutamicum. PorHC.glut is coded in the bacterial chromosome by a gene that is localized in the vincinity of the porAC.glut gene, within a putative operon formed by 13 genes that are encoded by the minus strand. Both porins are cotranscribed and coexist in the cell wall, which was demonstrated in RT-PCR and immunological detection experiments. The arrangement of porHC.glut and porAC.glut on the chromosome is similar to that of porBC.glut and porCC.glut and it was found that PorAC.glut, PorHC.glut, PorBC.glut and PorCC.glut coexist in the cell wall of C. glutamicum. The molecular mass of about 6 kDa of the PorH channel forming proteins is rather small and suggests that the cell wall channels are formed by oligomers. A possibly hexameric form was demonstrated for PorHC.glut in Western blot analysis with anti- PorHC.glut antibodies. Secondary structure predictions for PorHC.glut, PorHC.call and PorHC.eff predict that a stretch of about 42 amino acids of PorHC.glut and 28 amino acids of PorHC.call and PorHC.eff forms amphipathic -helices with a total length of 6.3 nm and 4.2 nm respectively. This should be sufficient to cross the mycolic acid layer. Another objective of this work was to establish an heterologous expression system for corynebacterial channel-forming proteins, to investigate the channel-forming properties of the up to now only hypothetical porins PorA, PorB, PorC from C. efficiens and PorC from C. glutamicum. We could demonstrate with recombinant expression experiments in E. coli that porBC.eff and porCC.eff encode for channel-forming proteins. They are, like PorBC.glut, anion-selective with a similar single-channel conductance of 1 nS in 1 M KCl. / C. glutamicum gehört zusammen mit C. efficiens und C. callunae zu den bedeutensten Aminosäureproduzenten weltweit. Sie sind Mitglieder der heterogenen Gruppe der mykolsäurehaltigen Aktinomyceten, den Mycolaten. Die Zellwände der meisten Aktinomyceten weisen neben einem Arabinogalactan-Peptidoglycankomplex große Mengen an Mycolsäuren auf. Diese MAP(Mycolyl-Arabinogalactan-Peptidoglycan) genannte dreischichtige Hülle stellt neben der Cytoplasmamembran eine zweite Permeabilitätsbarriere dar, und übernimmt somit die gleiche Funktion wie die äußere Membran der Gram-negativen Bakterien was zur Folge hat, dass für den Transport von hydrophilen Stoffen kanalbildende Proteine benötigt werden. Analog zur Situation in Gram-negativen Bakterien sind in der Mykolsäureschicht von C. efficiens, C. callunae und C. glutamicum porenbildende Transmembranproteine vorhanden. Es ist bisher vieles bekannt über den Aminosäurefluss über die Cytoplasmamembran und dessen Regulation in C. glutamicum, aber der Export von L-Glutamat ist noch ungeklärt. Die besondere Beschaffenheit der äußeren Membran von Mycolaten scheint in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle zu spielen, da man annimmt, dass die Diffusion im Bezug auf den Transport über die Mycolsäureschicht eine Schlüsselrolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es neue porenbildende Proteine der Aminosäureproduzenten C. glutamicum, C. efficiens und C. callunae zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei Untersuchungen von Zellwandextrakten wurde ein neuer, in allen drei Organismen homologer, Zellwandkanal, PorH, gefunden und charakterisiert. PorHC.glut wurde aus in Minimalmedium kultivierten C. glutamicum Zellen isoliert. Das Protein wurde in Lipid-Bilayer Experimenten gefunden und mit Hilfe der Ionenaustauscher-chromotographie über eine HiTrap-Q Säule aufgereinigt. PorHC.glut bildet in Black-Lipid Bilayer Experimenten kationenselektive Kanäle mit einem Durchmesser von 2,2 nm und hat eine Einzelkanalleitfähigkeit von 2,5 nS in 1 M KCl. Aus organischen Zellwandextrakten von C. callunae und C. efficiens wurden PorHC.call und PorHC.eff isoliert. PorHC.call bildet einen kationenselektiven Kanal mit einem Durchmesser von 2,2 nm und einer Einzel-kanalleitfähigkeit von 3 nS, PorHC.eff hingegen bildet einen leicht anionenselektiven Kanal mit einer Leitfähigkeit von 2,3 nS in 1 M KCl. Über die Sequenzierung der PorH Proteine wurden die entsprechenden porH Gene im Genom von C. glutamicum und C. efficiens identifiziert. Das Genom von C. callunae ist nicht bekannt, jedoch weisen die PorH Proteinsequenzen eine hohe Homologie untereinander auf. Es ist keine Signalsequenz vorhanden, so dass man annimmt, dass der Export über die Plasmamembran ähnlich funktioniert wie bei PorAC.glut aus C. glutamicum. Das Gen porHC.glut aus C. glutamicum befindet sich in unmittelbarer Nähe zu porAC.glut in einem möglichen Cluster das aus 13 Genen besteht. In RT-RCR Experimenten und immunologischen Reaktionen mit polyklonalen Antikörpern konnte gezeigt werden, dass die Gene porAC.glut und porHC.glut zusammen transkribiert werden und die Porine in der Zellwand coexistieren. Die Anordnung von porAC.glut und porHC.glut im Genom von C. glutamicum ist ähnlich der von porBC.glut und porCC.glut, und es konnte gezeigt werden, dass die vier Porine in der Zellwand gleichzeitig vorhanden sind. Das Molekulargewicht von PorH ist mit 6 kDa sehr klein für Kanalproteine und man nimmt an, dass die Kanäle von Oligomeren gebildet werden. In Western Blots wurde eine mögliche hexamere Form von PorHC.glut nachgewiesen. Sekundärstrukturvorhersagen für PorH sagen aus, dass 42 Aminosäuren von PorHC.glut und 28 von PorHC.eff und PorHC.call amphiphatische α-Helices mit einer Länge von 6,3 nm, bzw. 4,2 nm ausbilden. Diese Länge würde ausreichen, um die Mykolsäureschicht zu durchspannen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, ein heterologes Expressionssystem für corynebakterielle Kanalproteine zu erstellen, um die kanalbildenden Eigenschaften von bisher nur hypothetischen Porinen wie PorAC.eff, PorBC.eff und PorCC.eff von C. efficiens, oder PorCC.glut von C. glutamicum zu bestimmen. In rekombinanten Expressions-Experimenten in E. coli konnte gezeigt werden, dass die Gene porBC.eff und porCC.eff für Proteine mit kanalbildender Aktivität kodieren. Die Kanäle sind anionenselekitv, mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 1 nS in 1 M KCl, vergleichbar mit den Eigenschaften von PorBC.glut aus C. glutamicum.

Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive non-sporulating soil bacterium which is used in biotechnology as a producer of amino acids, nucleotides, biofuels and alcohols. The aim of this thesis was to create a hybrid σ factor of RNA polymerase which would be able to recognize a matching hybrid promoter without effect on expression of the host genes. Based on the σD and σH amino acid sequence, two types of hybrid factors, σDH and σHD , were designed by the sequence combination of sigD and sigH. As an alternative approach, based on the in silico homology modeling, mutations of wild-type σH in the region recognizing the -35 promoter element of the σH -dependent promoter were introduced. Hybrid promoters were constructed by combining the -35 and -10 promoter regions that were derived from the σD - and σH - dependent promoters. Promoter activity was determined by using gfpuv reporter gene under the control of hybrid promoter. The expression of gfpuv in strains with hybrid sigma factors σDH / σHD and hybrid promoters was rather low compared to strains that carried wild-type σ factor and the respective promoter. The aim of the thesis was achieved by using one of the mutant σH factor (σmutH_6A ) with alterations in the region recognizing the -35 element of the σH -dependent promoter. This mutant σ...

Zugl.: Stuttgart, Univ., Diss., 2007.

University, Diss., 2005--Würzburg.

University, Diss., 2005--Düsseldorf.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.