Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

学位プログラム名: 京都大学大学院思修館 / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(総合学術) / 甲第22613号 / 総総博第13号 / 新制||総総||2(附属図書館) / 京都大学大学院総合生存学館総合生存学専攻 / (主査)教授 山口 栄一, 教授 山敷 庸亮, 教授 植田 充美, 大嶌 幸一郎 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy / Kyoto University / DFAM

Die Gattung Corynebacterium gehört, neben Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und weiteren nahverwandten Gattungen, dem unverwechselbaren, gattungsübergreifenden Taxon Mycolata an. Viele Spezies aus dieser heterogenen Gruppe Mycolsäure-haltiger Actinomyceten sind entweder aufgrund ihrer medizinischen oder ihrer biotechnologischen Bedeutung bekannt. Beispielsweise zählen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae und Nocardia farcinica, welche weltweit Verursacher besonders gefährlicher bakterieller Infektionskrankheiten sind, zu dieser ungewöhnlichen Gruppe Gram-positiver Bakterien. Ebenso bedeutsam sind einige apathogene Mycolata-Arten, die industrielle Anwendung finden. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind leistungsfähige Bakterien, die zum Beispiel in der Produktion des Geschmacksverstärkers Glutamat und des Tierfuttermittelzusatzes Lysin eingesetzt werden, während verschiedene Rhodococcus Spezies Anwendung bei der Herstellung von Acrylsäuren finden. Die Zellwand der Mycolata zeigt, verglichen mit der klassischer Gram-positiver Bakterien, eine außergewöhnliche Zusammensetzung und Struktur auf. Abgesehen von einem Arabinogalactan-Peptidoglycan-Komplex enthält die Zellwand der meisten Actinomyceten einen hohen Anteil an Mycolsäuren. Diese langkettigen, verzweigten Fettsäuren formen eine, mit der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien vergleichbare, stark undurchlässige, hydrophobe äußere Hülle, welche die Grundlage der außergewöhnlichen Medikamentenresistenz bei den Mycolata bildet. Wie die äußere Membran Gram-negativer Bakterien enthält die Zellwand der Mycolata porenformende Proteine, die den Durchlass hydrophiler Substanzen gestatten. Indem sie eine Verbindung zwischen dem Zellinneren und der Umwelt, in der das Bakterium lebt, schaffen und einen kontrollierten Austausch zwischen beiden ermöglichen, tragen die Kanalproteine entscheidend zur Funktion der bakteriellen Zellhülle bei. Das Ziel dieser Arbeit war das Wissen über Zellwandkanäle in Corynebakterien zu erweitern. Deshalb untersuchten wir PorA und PorH Proteine, die basierend auf früheren Studien Zellwandkanälen in C. glutamicum, C. efficiens und Corynebacterium callunae zugeordnet werden, um ungeklärten Fragen nachzugehen und um Wissen über deren Struktur zu erlangen. Ferner inspizierten wir Zellwände pathogener Corynebakterien, genauer gesagt von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium jeikeium, um herauszufinden, ob diese Spezies wie ihre harmlosen Verwandten Kanalproteine besitzen. In dieser Arbeit wiesen wir mit C. diphtheriae und C. jeikeium in zwei weiteren Corynebacterium-Arten offene, mit Wasser gefüllte Zellwandkanäle nach. Des Weiteren stellten wir fest, dass sich die Zellwandkanäle von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae aus zwei Proteinen zusammensetzen, einem zugehörig zu der Gruppe der PorH Proteine und einem weiteren aus der Gruppe der PorA Proteine. Diese heteromere Struktur von Zellwandkanälen bei Corynebakterien stellt ein Novum für Zellwandkanäle bei den Mycolata dar. Indessen besteht der Zellwandkanal von C. jeikeium aus nur einem Protein, CjPorA, angeordnet zu einem Oligomer. Obgleich das Molekulargewicht dieses Proteins (4 kDa) mit dem von PorH und PorA Proteinen vergleichbar ist (5-7 kDa), weißt seine Primärsequenz keine eindeutige Homologie zu diesen auf. Dennoch deutet vieles auf eine Verwandtschaft zwischen CjPorA und PorH/PorA Proteinen hin, da das Gen jk0268, welches für CjPorA kodiert, sich in einer Region des C. jeikeium Chromosoms befindet, die der Genomregion entspricht in welcher die porH/porA Gene der anderen Corynebakterien lokalisiert sind. Dies lässt vermuten, dass jk0268 (welches für den homomeren Zellwandkanal in C. jeikeium kodiert) und die porH/porA Gene von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae (die einen heteromeren Zellwandkanal kodieren) wahrscheinlich Nachkommen eines gemeinsamen Vorläufergens sind. Phylogenetische Analysen der Gattung Corynebacterium unterstützen diese Annahme. Desweitern legen sie nahe, dass die hier untersuchten Zellwandkanäle innerhalb dieser Gattung wahrscheinlich weit verbreitet sind. Ein umfassendes Wissen über Zellwandkanäle, denen beim Transport gelöster Stoffe über die äußere Membran in Corynebakterien und anderen Mitgliedern der Mycolata eine entscheidende Rolle zukommt, könnte von großem wirtschaftlichem und medizinischem Nutzen sein. / The genus Corynebacterium belongs, together with Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus and further closely related genera, to the distinctive suprageneric taxon mycolata. Many species within this diverse group of mycolic acid containing actinomycetes are known either because of their medical or biotechnological relevance. For instance, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae and Nocardia farcinica, causer of most dangerous bacterial infectious diseases world-wide, are among this exceptional group of Gram-positive bacteria. Likewise of importance are some harmless mycolata species which find use in industrial settings. Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are, e.g., potent producers of the flavour enhancer glutamate and the animal feed additive lysine, while several Rhodococcus species are applied in the production of acrylic acids. The cell wall of mycolata species, compared with that of Gram-positive bacteria, exhibits an unusual composition and organization. Besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex, the cell walls of most actinomycetes contain large amounts of mycolic acids. Comparable to the outer membrane of Gram-negative bacteria, these long-chained branched fatty acids form a highly impermeable hydrophobic outer layer which provides the basis of the exceptional drug resistance of mycolata species. Like the outer membrane of Gram-negative bacteria, the cell wall of mycolata contains channel-forming proteins that allow the passage of hydrophilic solutes. By permitting and controlling the exchange and communication between the interior of the cell and the environment in which the bacterium lives, the channels play an important role for the function of the bacterial cell envelope. This thesis aimed to extend our knowledge about cell wall channels in corynebacteria. For this purpose, we examined PorA and PorH proteins that have been associated by previous studies with cell wall pores in C. glutamicum, C. efficiens and Corynebacterium callunae in order to resolve unanswered questions and to gain structural knowledge. We also investigated cell walls of pathogenic corynebacteria, in particular of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium jeikeium, to investigate if these species possessed channels as is the case with their harmless relatives. In this work we provided evidence for the existence of large and water-filled cell wall channels in C. diphtheriae and C. jeikeium. Moreover, we demonstrated that the major cell wall channels of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae consist of two distinctive polypeptides; one of whom belongs to the class of PorH proteins and the other to the class of PorA proteins. This heteromeric structure of channels of corynebacteria represents a novelty for channels of the mycolata. In contrast, the C. jeikeium channel is solely constituted by a single protein, CjPorA, arranged as an oligomer. Although the molecular mass of this protein (4kDa) is comparable to those of PorH and PorA proteins (5-7 kDa), it shares no distinctive homology in its primary sequence with them. However, there is evidence for relationship between CjPorA and PorH/PorA proteins because the gene jk0268, coding for CjPorA, is localized in a chromosomal region of C. jeikeium that corresponds to the genomic region containing the porH/porA genes in the other corynebacteria. This suggests that jk0268 (coding for the homomeric cell wall channel in C. jeikeium) and the porH/porA genes of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae (coding for heteromeric cell wall channels) are presumably descendants of a common ancestor gene. This assumption gets support from data on phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium. Moreover, these data suggest that the here investigated cell wall channels are presumably widespread within this genus. A profound knowledge of cell wall channels, building the main passage of solutes through the outer mycolate membrane in corynebacteria and other members of the mycolata, can be of great economical and medical value.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Universiẗat, Diss., 2004--Köln.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第13248号 / 論農博第2873号 / 新制||農||1070(附属図書館) / 学位論文||H31||N5172(農学部図書室) / (主査)教授 小川 順, 教授 阪井 康能, 教授 栗原 達夫 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

À l’issue de ce travail de thèse, je propose une approche basée sur le formalisme des modèles à base de contraintes, pour étudier la dynamique d’un système métabolique. En associant l’échantillonnage de l’espace des solutions avec l’utilisation d’une contrainte de « faisabilité » entre les périodes de temps considérées, cette approche permet de modéliser la dynamique d’un système métabolique en prenant en compte la variabilité des mesures expérimentales. La contrainte de faisabilité entre les périodes permet de garantir que chaque « trajectoire solution » correspond à une succession de cartes de flux qui conduit à des cinétiques de concentrations cohérentes avec les mesures expérimentales. Les populations de trajectoires solutions générées autorisent différents types d’analyses. D’une part, les répartitions de flux prédites peuvent être utilisées afin d’estimer les répartitions de flux les plus plausibles au sein du réseau étudié. D’autre part, la distribution des concentrations prédites permet d’évaluer le modèle utilisé pour étudier le réseau métabolique. Le fait que cette approche soit basée sur le formalisme de la modélisation à base de contraintes permet, moyennant l’utilisation de l’hypothèse d’état stationnaire du système, d’étudier des réseaux métaboliques de taille relativement grande, et d’utiliser des données expérimentales qui sont aisément mesurables, par exemple les concentrations en biomasse et en métabolites extracellulaires. Cette approche par « trajectoires solutions » a été utilisée afin d’étudier la dynamique du métabolisme de Corynebacterium glutamicum, lorsqu’elle est cultivée en condition de limitation en biotine. Les résultats obtenus ont permis d’une part d’attester du fonctionnement de la méthode, et d’autre part de proposer plusieurs hypothèses quant aux phénomènes biologiques qui ont lieu pendant cette condition particulière de croissance. / In this thesis, I propose an approach based on the formalism of constraint-based models to study the dynamics of a metabolic system. By combining the sampling of the solutions space and the use of a "feasibility" constraint between the considered time periods, this approach allows to model the dynamic of a metabolic system taking into account the variability of experimental measurements. The feasibility constraint between time periods ensures that each "solution trajectory" corresponds to a succession of flux maps which leads to some kinetics of concentrations that are consistent with the experimental measurements. The generation of a population of solution trajectories allows several analyses. On the one hand, the predicted flux maps can be used to estimate the most plausible flux within the network studied. On the other hand, the distribution of predicted concentrations enables to assess the model used for studying the metabolic network. The fact that this approach is based on the formalism of constraint-based modeling allows, using the steady-state assumption of the system, to study metabolic networks of relatively large size, and to use experimental data that are easily measurable, such as biomass concentration and extracellular metabolites concentration. This approach by "solution trajectories" has been used to study the dynamics of the metabolism of Corynebacterium glutamicum, when grown under biotin-limited condition. The results allowed, first, to attest the functioning of the method, and second, to propose several hypotheses about biological phenomena that take place during this particular growth condition.

Abstract Regulation of transcription by extracytoplasmic-function (ECF) sigma factors of RNA polymerase is an efficient way of cell adaptation to diverse environmental stresses. Amino acid-producing gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum codes for seven sigma factors: the primary sigma factor SigA, the primary-like sigma factor SigB and five ECF stress- responsive sigma factors (SigC, SigD, SigE, SigH and SigM). The sigH gene encoding SigH sigma factor is located in a gene cluster together with the rshA gene, encoding the anti-sigma factor of SigH. Anti-sigma factors bind to their cognate sigma factors and inhibit their transcriptional activity. Under the stress conditions the binding is released allowing the sigma factors to bind to the RNAP core enzyme. In this thesis, regulation of expression of genes encoding the most important ECF sigma factor SigH and its anti-sigma factor RshA as well as genes belonging to the SigH-regulon were mainly studied. The transcriptional analysis of the sigH-rshA operon revealed four housekeeping promoters of the sigH gene and one SigH-dependent promoter of the rshA gene. For testing the role of the complex SigH-RshA in gene expression, the C. glutamicum ΔrshA strain was used for genome-wide transcription profiling with DNA Microarrays technique under...

Lors de ce travail, une étude comparative entre trois souches de C. glutamicum a été réalisée. Celles-ci sont C. glutamicum 2262, une souche surproductrice de glutamate suite à l’élévation de température du milieu de culture de 33 à 39°C, C. glutamicum 2262 NP un variant incapable d’excréter du glutamate dans ces mêmes conditions et C. glutamicum 2262 ∆pks13 un mutant dépourvu de bicouche mycolique externe. Un modèle métabolique original reprenant les différentes modifications physiologiques aboutissant à l’excrétion du glutamate au cours du procédé thermo-induit a été établi. La bicouche mycolique joue un rôle primordial puisque son absence affecte sévèrement la production du glutamate. Dans un premier temps, l’élévation de température serait ressentie au niveau de cette bicouche. Ce ressenti, visualisé par l’accumulation de protéines caractéristiques d’un stress thermique, est nécessaire pour que la bactérie soit en capacité de surproduire le glutamate. Par la suite, la production de glutamate est régulée au niveau de l’α-cétoglutarate déshydrogénase (ODH) grâce à la phosphoprotéine OdhI. Suite au changement de température, celle-ci est déphosphorylée ce qui lui permet d’interagir avec ODH et de provoquer l’inhibition de cette dernière. Ceci se traduit par la redirection sur flux carboné vers la synthèse du glutamate. Aucun de ces évènements n’est observé chez C. glutamicum 2262 ∆pks13. Par ailleurs, l’élévation de température induit une modification de la composition de l’enveloppe cellulaire qui semble intervenir dans le processus physiologique aboutissant à l’excrétion du glutamate puisque très peu de changements sont observés chez C. glutamicum 2262 NP / During this work, a comparative study between three strains of Corynebacterium glutamicum was carried out. These strains were C. glutamicum 2262 which overproduces glutamate after an increase in the culture temperature from 33 to 39°C, C. glutamicum 2262 NP which is unable to produce glutamate in the same culture conditions and C. glutamicum 2262 ∆pks13 devoid of outer corynomycolic acid bilayer. An original metabolic model describing the successive physiological modifications responsible for the glutamate excretion during the temperature-triggered process was established. The presence of the corynomycolic acid bilayer appeared to be necessary since its lack affected dramatically the glutamate production. The temperature increase would be first sensed at the level of the external corynomycolic acid layer. This sensing was visualised through the accumulation of thermal stress proteins. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, the synthesis of these proteins was not induced. The glutamate production is regulated at the oxoglutarate dehydrogenase (ODH) level by the phosphoprotein OdhI. A consequence of the temperature increase was the dephosphorylation of this regulatory protein and its interaction with ODH, provoking its inhibition. The carbon flux was then reoriented toward the glutamate synthesis. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, no dephosphorylation of OdhI and no change in the ODH activity were not determined. The thermal stress also induced a change in the composition of the corynomycolic acid layer which was correlated with the ability of C. glutamicum 2262 to overproduce glutamate. In C. glutamicum 2262 NP, the composition of the corynomycolic acid layer remained unchanged