CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The complete sequencing of its genome has revealed many genes encoding products of biotechnological interest. Among these products are several chitinases. Chitinases, enzymes capable of degrading chitin, an insoluble polymer of β(1,4)-linked N-acetyl-β-D-glucosamine (GlcNAc), are of great biotechnological interest, because they can be used to convert chitin in useful derivatives as well as being exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase, belonging to family GH18, from C. violaceum ATCC 12472. The ORF CV2935 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET303/CT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In both systems, the enzyme was secreted into the culture medium, in its soluble and functional form, and purified to homogeneity by affinity chromatography on a chitin matrix followed by size-exclusion chromatography on Superdex75 matrix. The yields of pure chitinase expressed in E. coli and P. pastoris were 2.6 and 44 mg per liter of culture, respectively. The recombinant chitinase produced in both microrganisms showed optimal activity at pH 3.0 and it was active after treated at temperatures up to 60 ÂC. The enzyme produced in P. pastoris (45 kDa) was N-glycosylated as revealed by Schiffʼs reagent and digestion with N-glycosidase F. Moreover, the glycosylated chitinase was found to be slightly more thermostable than the enzyme produced in E. coli (43 kDa). The rCV2935 showed hydrolytic activity against colloidal chitin, crab shell, and synthetic substrates containing p-nitrophenol. It was also able to hydrolyse glycol-chitin in SDS-PAGE and showed low chitosanase activity. The fluorescence spectra revealed that the proteins were produced in their folded conformation. The crystal structure of the recombinant chitinase produced in P. pastoris was determined by X-ray crystallography at a resolution of 2.1Ǻ. Its catalytic domain adopts an (β/α)8 triose-phosohate isomerase (TIM) barrel fold, and the residues essential for catalysis are conserved. The recombinant chitinase reduced the growth of the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, and bioassays with cowpea weevil Callosobruchus maculatus showed that the rCV2935 possibly interfered with the insect feeding, which resulted in decreased weight of adults. The biochemical, biological and structural studies of rCV2935 may be useful for biotechnological application of this enzyme. / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. O seqÃenciamento completo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos, estÃo vÃrias quitinases. Quitinases, enzimas capazes de degradar a quitina, um biopolÃmero de N-acetil-β-D-glucosamina bastante insolÃvel, sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar bioquÃmica, biolÃgica e estruturalmente uma quitinase recombinante (CV2935), da famÃlia 18 das glicosÃdeo hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A ORF codificando a proteÃna CV2935 foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET303/CT-His e pPICZαA, para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. Em ambos os sistemas, a enzima foi secretada para o meio de cultura, na sua forma solÃvel e funcional, sendo purificada a homogeneidade por cromatografia de afinidade em matriz de quitina, seguida de cromatografia de exclusÃo molecular em matriz de Superdex75. Os rendimentos da quitinase pura, expressa em E. coli e P. pastoris, foram 2,6 e 44 mg por litro de cultura, respectivamente. A quitinase produzida em ambos os microorganismos mostrou atividade Ãtima em pH 3,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 60 ÂC. A enzima produzida em P. pastoris (45 kDa) foi N-glicosilada, como revelado por coramento com reagente de Schiff e digestÃo com N-glicosidase F, mostrando-se ligeiramente mais termoestÃvel do que a enzima nÃo glicosilada, produzida em E. coli (43 kDa). A rCV2935 apresentou atividade hidrolÃtica (endoquitinÃsica) frente a quitina coloidal, matriz de carapaÃa de caranguejo obtida comercialmente, glicol-quitina (em gel SDS-PAGE), substratos sintÃticos solÃveis contendo p-nitrofenol, alÃm de apresentar pequena atividade quitosanÃsica. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que as proteÃnas foram produzidas na sua conformaÃÃo enovelada. A enzima teve sua estrutura cristalogrÃfica resolvida a uma resoluÃÃo de 2.1à e seu domÃnio catalÃtico apresentou um dobramento do tipo barril (β/α)8 (barril TIM) e resÃduos essenciais para catÃlise conservados, caracterÃsticas essas, comuns Ãs proteÃnas da mesma famÃlia. A quitinase recombinante retardou o crescimento do fungo fitopatogÃnico Rhizoctonia solani, e, em bioensaios com o caruncho Callosobruchus maculatus, a rCV2935 possivelmente interferiu com a alimentaÃÃo do inseto, o que acarretou na diminuiÃÃo do peso dos mesmos. Os estudos bioquÃmicos, biolÃgicos e estruturais da rCV2935 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima.

nÃo hà / O trabalho realizado nesta tese visa a cristalizaÃÃo do Ãcido glutÃmico, favorecendo a obtenÃÃo da fase α (metaestÃvel) em relaÃÃo ao polimorfo β. ApÃs a obtenÃÃo dos cristais realizaram-se as medidas experimentais de fluorescÃncia, com vistas a comparaÃÃo com os dados teÃricos obtidos, considerando as limitaÃÃes do mÃtodo de simulaÃÃo ab-initio utilizado. Os cÃlculos de primeiros princÃpios foram realizados para estudar as propriedades do cristal do Ãcido glutÃmico nas modificaÃÃes α e β no que se refere ao aspecto estrutural, eletrÃnico (estrutura de bandas) e Ãptico (funÃÃo do complexo dielÃtrico), tudo isto em relaÃÃo ao polimorfismo conformacional. A teoria do funcional da densidade (TFD) à considerada usando uma base de ondas planas, pseudopotenciais ultramacios, e o potencial de correlaÃÃo-troca dentro do Generalized-Gradient Approximation (GGA). Os parÃmetros de rede estÃo de acordo com os resultados experimentais, embora na forma α à previsto ter um gap indireto entre os pontos de alta simetria  e X, igual a 4.69 eV, para a forma β nÃo pode-se tirar uma conclusÃo sobre o gap direto (-), devido a imprecisÃo do cÃlculo. A funÃÃo dielÃtrica de ambos os polimorfos sÃo muito semelhantes no caso de uma amostra policristalina, mas difere fortemente no caso da polarizaÃÃo da luz das faces do cristal 100 e 010. / Done the work accomplish in this thesis it seeks the crystallization of the glutamic acid, favoring the obtaining of the phase α (metastable) in relation to the polymorph β. After the obtaining of the crystals they did take place the experimental measures of fluorescence, with views the comparison with the obtained theoretical data, considering the limitations of the method of simulation used ab-initio. Were the calculations of first principles accomplished to study the properties of the crystal of the glutamic acid in the modifications α and β in what she refers to the aspect structural, electronic (structure of bands) and optical (function of the dieletric complex), everything this in relation to the polymorphism conformational. The theory of the functional of the density (TFD) is it considered using a base of plane waves, pseudo potential ultrasoft, and the correlation-change potential inside of the Generalized-Gradient Approximation (GGA). Are the net parameters in agreement with the experimental results, although in the form α is it foreseen to have an indirect gap between the points of high symmetry and X, equal to 4.69 eV, for the form β a conclusion cannot be reached on the direct gap (-), due to imprecision of the calculation. The function dieletric of both polymorph are very similar in the case of a sample polycrystal, but it differs strongly in the case of the polarization of the light of the faces of the crystal 100 and 010