Calcium ions have important roles in cellular processes including intracellular signaling, protein folding, enzyme activation and initiation of programmed cell death. Cells maintain low levels of calcium in their cytosol in order to regulate these processes. When activation of calcium-dependent processes is needed, cells can release calcium stored in the endoplasmic reticulum (ER) into the cytosol to initiate the processes. This can also initiate formation of plasma membrane channels that allow entry of additional calcium from the extracellular milieu. The change in calcium levels is referred to as calcium flux. A key protein involved in initiation of calcium flux is Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1), which has recently been identified as a sensor of ER calcium levels. STIM1 is an ER transmembrane protein that is activated by a drop in ER calcium levels. Upon activation, STIM1 oligomerizes with a plasma membrane protein, ORA1, to form calcium-selective plasma membrane channels. Dysregulation of calcium flux has been reported in cancers, autoimmune diseases and other diseases. STIM1 is a promising target in drug discovery due to its key role early in calcium flux. Here we review the involvement and importance of STIM1 in diseases and we discuss STIM1 as a viable target for drug discovery using computational chemistry methods to rapidly identify new molecules to target STIM1. Herein, computational techniques were used to understand the mechanistic role of STIM1 and virtual screening is in process to discover potential inhibitors of STIM1 activity. Also mutational analysis on STIM1 was performed computationally to see the effect it had on the protein computationally. It has been found that tumor cells and tissues, compared to normal cells, have higher levels of copper and possibly other metal ions. This presents a potential vulnerability of tumor cells that can serve as a physiological difference between cancer cells and normal cells and allows design of compounds that selectively target tumor cells while sparing normal cells. Recently we have identified compounds that have potential to inhibit the proteasome in tumor cells and induce cell death by mobilizing endogenous tumor copper resulting in in cellulo activation of the compound. These compounds hence act as pro-drugs, becoming active drugs in tumor cells with high copper content but remaining essentially inactive in normal cells, thereby greatly reducing adverse effects in patients. Such use would be of significant benefit in early detection and treatment of cancers, in particular, aggressive cancers such as pancreatic cancer which is usually not detected until it has reached an advanced stage. Six compounds were identified following virtual screening of the NCI Diversity Set with our proteasome computer model followed by confirmation with a biochemical assay that showed significant inhibition of the proteasome by the compounds in the presence of copper ions. In a dose response assay, NSC 37408 (6, 7-dihydroxy-1-benzofuran-3-one), our best compound, exhibited an IC50 of 3µM in the presence of 100 nM copper. Chagas’ Disease, a parasitic disease caused by the parasite Trypanosma Cruzi, is endemic to Latin America. The disease manifests itself in a short acute phase and a long chronic phase. Current treatments are effective only in the acute phase and are not used in the chronic phase due to toxicity of the drugs. Hence a new drug discovery approach was chosen for this disease. Cruzain is the major etiologic enzyme involved in the disease and is only present in the parasite. It is also an enzyme expressed by the parasite in both phases. Herein, a novel peptoid library containing hydromethylketones was constructed and screened against a virtual structure of cruzain. The peptoids thus found through this drug discovery effort can be used as potential drug candidates against cruzain. Computational techniques will help achieve a high degree of specificity and aid in proposing assays for determining compounds with high activity Alzheimer disease is the most common form of dementia. Its pathogenesis incorporates many potential targets for treatment. Among the targets identified, Apolipoprotein E4 (apoE4) is especially interesting due to its catalytic role in the degradation and clearance of amyloid beta (Aβ), a risk factor for Alzheimer disease. ApoE exists in 3 isoforms which directly impact its functionality in the body. There are characteristic structural differences between them. In ApoE4 ionic interactions exist between Arg-61 and Glu-255 residues, unlike the other isoforms. Hence interruption of this interaction by inhibitors may change the structure of apoE4 to a more linear structure as observed in the other isoforms. Virtual screening of the NCI diversity set on an energy minimized protein virtual structure was performed to identify potential small molecule inhibitors and to gain further understanding of interactions that can be targeted to inhibit this protein. From the top ligands in the NCI diversity set, a peptide library was designed to target the protein. Previous research has indicated that liquid assisted grinding (LAG) is efficient and reliable for cocrystal formation when compared to solvent crystallization and dimethyl formamide is the best solvent for grinding. Herein, we report the comparison of four screening processes: Slurry, solvent crystallization, LAG and dry grinding. Thirty-eight crystal forms containing the Narom··· COOH, Narom···OH supramolecular heterosynthons were screened in the process, and it was observed that slurry methodology is as efficient and reliable in forming cocrystals as solution crystallization. Twenty-four new crystal forms were also isolated herein. LAG was found to be more efficient as compared to dry grinding and was successful in the formation of twenty-five crystal forms of the thirty-eight screened. Dimethyl formamide still remains the best solvent for LAG. All our slurry experiments were performed in water and it was found that water can be used reliably for this method for compounds within a wide range of solubility, thereby increasing the versatility and usability of this method for future screening procedures.

A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.

A doença de Chagas, que é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, ocasiona grandes danos à saúde da população latino-americana e vem-se distribuindo para regiões não-endêmicas como os Estados Unidos, Europa e Japão. O tratamento é realizado pela administração de dois medicamentos (Nifurtimox e Benzonidazol) que apresentam sérios efeitos colaterais e baixa eficácia. A busca por novos compostos químicos bioativos com ação farmacológica sobre alvos bioquímicos constitui uma estratégia em desenvolvimento em nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, a principal cisteino protease - a cruzaína, e a enzima central na biossíntese de pirimidinas - a DHODH, ambas de T. cruzi, foram escolhidas como alvos para a identificação de novos inibidores com ação potencial contra o T. cruzi. A síntese de inibidores dessas duas enzimas foi realizada e os ensaios bioquímicos foram usados para identificar novos inibidores em concentrações micro- e nanomolar. Alguns desses inibidores enzimáticos foram ensaiados contra o T. cruzi em sua forma infectiva tripomastigota e foram ativos em concentrações micromolar. A enzima cruzaína (3.4.22.51) possui similaridade baixa na sequência de aminoácidos (18%) com a Catepsina-L (Cat-L, EC 3.4.22.15), mas suficiente para estabelecer a hipótese de que inibidores de Cat-L também poderiam inibir a cruzaína. Assim, com base no conhecimento prévio de vários inibidores da Cat-L, o dipeptídeo-nitrila Neq409 foi inicialmente sintetizado por outro membro do grupo para validar a hipótese de que nitrilas dipeptídicas poderiam inibir a cruzaína. O composto Neq409 inibiu a cruzaína com o valor de pIC50 igual a 5,7 que o qualificou não apenas como inibidor da cruzaína mas também como possível composto matriz para modificação molecular e estudos de relações estrutura-atividade (SAR). Cinco compostos foram então sintetizados através de uma rota de quatro etapas (proteção/desproteção de ácidos carboxílicos e duas formações de amida) e avaliados através de métodos fluorimétricos quanto às suas capacidades de inibir cruzaína. As modificações moleculares resultaram em aumento da potência de até 13 vezes em relação ao composto protótipo Neq409. A substituição do grupo benzoíla, presente em P3 no Neq409, pelo grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol (Neq414) e 5-bromopiridina (Neq419) resultou nos valores de pIC50 de 6,5 e 6,1, respectivamente. A substituição do átomo de hidrogênio por cloro na posição meta da fenila em P2 no composto Neq414 deu origem ao composto Neq415 com pIC50 de 6,8. Outras duas modificações envolveram a inserção do grupo ciclopropila na região P1 do composto Neq0414 gerando o Neq533 (pIC50 = 6,8) e do composto Neq533 resultando no composto Neq543 (pIC50 = 6,2). Os resultados mostraram que o grupo 3-carboxi-5-terc-butil-2-metilpirazol apresenta interações mais eficientes no sub-sítio S3 da cruzaína que o grupo 5-bromopiridina e que um átomo de cloro em P2 e um grupo ciclopropila em P1 possuem contribuições semelhantes para o aumento da potência de inibição da enzima. A busca de inibidores da enzima TcDHODH pelo grupo NEQUIMED levou à identificação de dois novos inibidores nanomolares, o Neq71 (pKi = 6,5) e o Neq130 (pKi = 6,4), ambos derivados de 5-arilpropilidenobarbitúricos. Com base nesses resultados, foi realizada a síntese do Neq71, Neq130 e de um novo inibidor - o Neq0393, biosóstero do composto Neq130, utilizando a condensação de Knoevenagel em meio aquoso sem catalisador, por adaptação de método já descrito anteriormente na literatura. Para avaliar a importância insaturação exocíclica ao anel barbitúrico desses derivados, o Neq71, Neq130 e o Neq393 foram submetidos à redução específica dessa insaturação utilizando-se NaBH4 que resultou nos compostos Neq395, Neq298 e Neq394, respectivamente. Os compostos Neq542, Neq421 e Neq420 derivados 5-metilidenobarbitúricos também foram sintetizados através do mesmo procedimento utilizado para obtenção de Neq71, Neq130 e Neq393, para avaliar a importância do comprimento da cadeia dos derivados 5-arilpropilidenobarbitúricos. A análise das constantes de inibição dos compostos obtidos mostrou que a redução da instauração resulta de até 280 vezes de potência, enquanto o encurtamento da cadeia lateral levou a diminuição de menor escala da potência (25 vezes), indicando a importância da instauração exocíclica para a afinidade dos compostos com a enzima. A característica eletrofílica desta instauração levou identificação de um novo esqueleto para futuros inibidores, o Neq411. / Chagas disease, which is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, causes severe damage to the health of the population in Latin American countries and comes up distributing to non-endemic regions such as the United States, Europe and Japan. The treatment is accomplished by administering two drugs (Benznidazole and Nifurtimox) that have serious side effects and low efficacy. The search for new bioactive chemical compounds with pharmacological action on biochemical targets is a strategy under development in our research group. In this study, the major cysteine protease - cruzain, and the central enzyme in the biosynthesis of pyrimidines - DHODH, both from T. cruzi, were chosen as targets for the identification of new inhibitors with potential activity against T. cruzi. The synthesis of inhibitors of these two enzymes was performed and biochemical assays were used to identify new inhibitors at micro- and nanomolar concentrations. Some of these enzyme inhibitors were tested against T. cruzi infective trypomastigote form and were active at micromolar concentrations. The cruzain enzyme (EC 3.4.22.51) has low similarity in amino acid sequence (18 %) towards Cathepsin L (Cat-L, EC 3.4.22.15 ), but sufficient to establish the hypothesis that Cat-L inhibitors could also inhibit cruzain. Thus, based on prior knowledge of various Cat-L inhibitors, a dipeptide nitrile - Neq409 was initially synthesized by another group member in order to validate the hypothesis that dipeptide nitriles could really inhibit cruzain. The compound Neq409 inhibited cruzain with a pIC50 value of 5.7, which qualified it not only as an inhibitor of cruzain but also as a possible lead compound for molecular modification and structure-activity relationships (SAR) studies. Five compounds were then designed and synthesized through a route of four steps (protection/deprotection of carboxylic acids and two formations of amides) and evaluated using fluorimetric methods to evaluate their ability to inhibit cruzain. The molecular changes for most potent compound resulted in 13-fold potency increase as compared to the prototype compound Neq0409. The replacement of the P3 benzoyl group present in the Neq409 by 3-carboxy-5-tert- butyl-2-methylpyrazole (Neq0414) and 5- bromopyridine (Neq0419) resulted in the pIC50 values of 6.5 and 6.1, respectively. The replacement of the hydrogen atom by chlorine in the meta position of the phenyl at P2 in the compound neq0414 yielded compound Neq415 with a pIC50 of 6.8. Two other modifications involved the insertion of the cyclopropyl group in the P1 region of Neq0414 generating compound Neq0533 (pIC50 = 6.8) and compounds Neq0533 resulting in compound neq0543 with a pIC50 of 6.2. The results showed that the 3-carboxy-5-tert-butyl-2-methylpyrazole provides more efficient interactions in the cruzain S3 sub-site than 5- bromopyridine group and a chlorine atom at P2 and a cyclopropyl group at P1. The search for inhibitors of the enzyme TcDHODH led to the identification of two new nanomolar inhibitors, the Neq0071 (pKi = 6.5) and Neq0130 (pKi = 6.4), both derived from 5-aril-propiliden-barbituric acid. The Neq393, a bioisostere compound of Neq0130, was synthesized using the Knoevenagel condensation in aqueous media without catalyst, by adaptation of the method previously described in the literature. Based on these results, the synthesis of Neq71, Neq130 and a new inhibitor was performed. To assess the importance of exocyclic barbiturate ring unsaturation, Neq71, Neq130 and Neq393 underwent specific reduction of such unsaturation using NABH4 that resulted in compounds Neq395, Neq298 and Neq0394, respectively. Neq542, Neq421 and Neq420 derived compounds of 5-metilidenobarbiturate were also synthesized by the same procedure used to obtain Neq71 and Neq393 to evaluate the importance of the length of the 5-arilpropilidenobarbiturate derivatives. The inhibition constant of these compounds showed that de lack of the exocyclic double bond decreased the potency 200 times and the shrinkage of the side chain to a decrease of 25 times, showing the importance of the exocyclic bond for the inhibitors affinity for the enzyme. The electrophilicity of this bond lead to an identification of a new scaffold for novel inhibitors, the Neq411.

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada de alta prioridade nos programas de pesquisa e desenvolvimento da Organização Mundial da Saúde. Grave problema de saúde pública, é uma das maiores causas de desordens cardíacas em vários países da América Latina. A inexistência de um tratamento satisfatório faz urgente a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse contexto, o objetivo dessa tese de doutorado foi o desenvolvimento de inibidores da enzima cruzaína de Trypanosoma cruzi, alvo molecular validado para a doença de Chagas, utilizando de forma integrada várias estratégias experimentais e computacionais de química medicinal e planejamento de fármacos. Duas classes de inibidores foram utilizadas como compostos líderes: derivados benzimidazólicos e imídicos. Diversas etapas de planejamento, síntese química e avaliação biológica foram realizadas de forma iterativa até que a otimização da potência dos compostos fosse alcançada. Modificações em diversas regiões de cada composto líder foram exploradas, levando ao entendimento de requerimentos de SAR essenciais para a inibição enzimática. O mecanismo de inibição de novas séries de compostos foi determinado. Estudos preliminares de toxicidade, em linhagens celulares e in vivo, mostraram que os compostos apresentam um perfil seguro. Por meio da realização de um estágio de doutorado sanduíche no departamento de metabolismo de fármacos e farmacocinética da empresa farmacêutica norte-america AbbVie, foi realizada a determinação de parâmetros farmacocinéticos dos compostos investigados. Além disso, foi possível a utilização de uma metodologia recentemente implementada na empresa, com foco na otimização de múltiplos parâmetros de um composto teste. Este método foi utilizado para a identificação de candidatos a novos fármacos com um equilíbrio favorável entre potência e parâmetros farmacocinéticos, que são absolutamente essenciais para o desenvolvimento de um novo fármaco eficaz e seguro. Por fim, foi criada uma estratégia mais racional e efetiva para a triagem de candidatos a novos antichagásicos, que apresentem uma combinação otimizada de potência e propriedades de ADME. / Chagas\' disease is considered a high priority neglected tropical disease by the World Health Organization in its research and development programs. It is a serious public health problem, being among the main causes of cardiac disorders in many countries in Latin America. The absence of an effectite treatment makes urgent the pursue of novel therapeutic options. In this way, the goal of this PhD thesis was to develop inhibitors of the enzyme cruzain, the main cysteine protease from Trypanosoma cruzi, a validated target for Chagas\' disease drug discovery. This work involved the combination of experimental and computational approaches in medicinal chemistry and drug design. Two sets of inhibitors were used as lead compounds: benzimidazole and imide derivatives. The design, chemical synthesis and biological evaluation of several compounds were performed iteratively, until the optimization of potency was achieved. Modifications in different regions of each lead compound were explored, making it possible to understand the SAR requirements for enzyme inhibition. The mode of inhibition of the compounds was determined. Preliminary toxicity studies were caried out using cellular lineages and mice, showing that the compounds possess a safe profile. A PhD internship at the department of metabolism and pharmacokinetics at the U.S. pharmaceutical company AbbVie led to the determination and optimization of the pharmacokinetic profile of the inhibitors. Besides, a methodology recently implemented in the company was employed in this work, which aims a multi parametric optimization of the test compounds. This method was used to identify drug candidates with a favorable balance between potency and pharmacokinetic parameters, which are absolutely essential to develop a new, safe and effective drug. Finally, it was created a rational and more effective strategy for the screening of new antichagasic drug candidates, presenting an optimized combinaiton of potency and ADME properties.

A enzima cruzaína, expressada durante todo o ciclo de vida do parasita Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é a principal cisteíno protease desse parasita e,vem se apresentando como elemento promissor para o tratamento da doença de Chagas. Neste trabalho, sintetizamos uma série de dipeptidilnitrilas que apresentam atividade sobre a enzima cruzaína em concentrações baixo-micromolar. Esses compostos apresentam também atividade diante do parasita T. cruzi, sendo prototípico o composto 9, um dos mais potentes, capaz de inibir a enzima com IC50 de 1.89 ± 0.11 µM (pIC50 = 5.7) e, uma vez em face do parasita, IC50 de 2.7 ± 0.3 µM (pIC50 = 5.6). O composto 9 é mais potente que o fármaco benzonidazol (BZ), que foi usado como controle nos ensaios bioquímicos das nossas moléculas; o BZ apresentou pIC50 = 4.6. Os compostos 9 e 7 apresentam estrutura similar, mas exibiram diferenças significantes nos ensaios diante do T. cruzi. Eles foram rotulados mediante a incorporação de fluoróforos da família dos borodipirrometenos (Bodipy) e, finalmente, monitorados mediante microscopia confocal para identificar processos biológicos específicos ou alguma resposta celular in vitro nas moléculas. / The Cruzaíne enzyme, a cysteine protease expressed throughout the life cycle of the parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is the main cysteine protease of this parasite and has been presented as a promising target for the treatment of Chagas\' disease. In this work, we have synthesized a series of dipeptidylnitriles that have activity against the enzyme cruzaína in low-micromolar concentrations. These compounds also present activity against the parasite T. cruzi, the prototypical compound being one of our most potent compounds, which inhibits the enzyme with IC50 of 1.89 89 ± ± 0.11 µM (pIC50 pIC50 = = 5.7), and against the parasite IC50 of 2.7 7 ± ± 0.3 3 µM (pIC50 pIC50 = = 5.6), compound 9 is more potent than the drug Benzonidazole (BZ) which was used as a control in the biochemical assays of these molecules, this (BZ) had pIC50 pIC50 = = 4.6. Compounds 09 and 07 have a similar structure but showed a significant difference in the assays against the T. cruzi parasite, these two compounds were labelled by the incorporation of borodipyrromethene family fluorophores (Bodipy) and finally, they were monitored by microscopy confocal, to identify specific biological processes or some cellular response in vitro to these molecules.

A Doença de Chagas é uma protozoose causada pelo parasita hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Classificada pela Organização Mundial de Saúde como extremante negligenciada, essa doença é endêmica em 21 países da América Latina, entretanto podem ser encontrados, ainda, casos nos EUA, Canadá, Europa e Japão devido a movimentos migratórios. Segundo estimativa da Organização Mundial da Saúde, no ano de 2012 havia de 8 a 10 milhões de pessoas infectadas mundialmente e cerca de 25 milhões de pessoas sob risco de contrair a doença de Chagas, ainda sim, havia a ocorrência de 56 mil novos casos da doença e cerca de 12 mil mortes por ano, recorrente de complicações da doença. Diante destes números, essa parasitose se apresenta com um sério problema de saúde pública mundial. A terapêutica antichagásica disponível apresenta apenas dois fármacos o Nifurtimox e o Benznidazol, que atuam somente na fase aguda da doença e provocam sérios efeitos adversos, sendo necessária a busca por novos fármacos eficazes contra o parasita. Os métodos modernos de planejamento de fármacos antiparasitários envolvem a seleção de vias metabólicas específicas a serem bloqueadas, nesse contexto se encontram diferentes proteases, enzimas envolvidas em processos essenciais para a sobrevivência do parasita, entre elas a cruzaína, principal cisteíno-protease do T. cruzi, a qual é responsável pela sobrevivência, replicação celular e invasão do parasita à célula hospedeira, se apresentando como um excelente alvo bioquímico na pesquisa de novos agentes antichagásicos. Partindo do estudo do nitrofural (5-nitro-2-furfurilidenossemicarbazona), antibacteriano também conhecido por sua ação inibitória da cruzaína, adotamos-o como protótipo na pesquisa de fármaco contra a doença. No presente trabalho, utilizou-se o bioisosterismo como estratégia de modificação molecular no planejamento de compostos antichagásicos, inibidores da cruzaína. Foram sintetizados 27 derivados sulfonil-hidrazônicos, para os quais foi determinada a pureza por CLAE e caracterizados por faixa de fusão, espectroscopia no UV e RMN 1H e RMN 13C. Os compostos sintetizados foram avaliados frente às formas celulares epimastigota do T. cruzi, apresentando atividade inibitória de crescimento celular entre 20 e 100% a 100 µM. Nos ensaios frente a cruzaína, os derivados nitrados se mostraram ativos com IC50 em torno de 100 µM. Visto os resultados, podemos sugerir que o grupo nitro presente em alguns compostos pode ser o responsável pela atividade tripanomicida. Face a indicação de toxicidade do grupo nitro, os derivados não nitrados, Ie, IIf e IIIe, podem ser considerados promissores, visto sua atividade intermediária como tripanomicida, entre 45 e 60% à 100 µM, sendo que o composto IIf também apresentou atividade inibidora da cruzaína, 23,4% à 100 µM, podendo assim serem utilizados como ponto de partida na busca de eficazes agentes antichagásicos. / Chagas disease, a protozoonosis caused by the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi, is classified as an extremely neglected disease by World Health Organization. It is an endemic disease in 21 countries on Latin America and cases in the USA, Canada, Europe and Japan were also reported as a consequence of migratory activity. In the last five years, it is estimated that around 8 to 10 million people worldwide were affect by this disease, with nearly 12,000 deaths due to disease complications and approximately 25 million people being at risk of contracting it. Chagas disease is therefore a worldwide public health problem. There are only two available antichagasic therapeutic drugs, nifurtimox and benznidazol, which act only in the acute phase of the disease and cause serious adverse effects, making it necessary to search novel, more effective drugs against this parasite. The newer methods of antiparasitic drug design involve the selection of specific metabolic pathways to be blocked. Many proteases, enzymes involved in essential processes to the survival of the parasite, such as cruzain, are thought of as potential therapeutic targets. Cruzain, the major cysteine protease of T. cruzi, is responsible for cellular replication, survival and invasion of the host cell, being an excellent biochemical target for the drug discovery of new antichagasic agents. Starting from the knowledge of nitrofural (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone) as an antibacterial agent and as a known cruzain inhibitor, we used it as a template for the search of new drugs against Chagas disease. In the present work, bioisosteric modifications were used as a strategy to design new compounds as potential cruzain inhibitors. 27 sulfonilhydrazones derivatives were synthesized, had their purity assessed by HPLC and were characterized through their melting point, UV spectroscopy and NMR 1H and 13C. The synthesized compounds were evaluated against epimastigote strains of T. cruzi, showing inhibitory activity on cellular growth between 20 and 100% at 100 µM. In the cruzain enzymatic assays, the nitro derivatives showed activity around 50% of inhibition at 100 µM, and IC50 around 100 µM. By the results, we can suggest that the presence of the nitro group in some compounds should be responsible for triponocidal activity. Given the known toxicity of nitro compounds, the derivatives without the nitro goup, Ie, IIf and IIIe, may be considered promising given their intermediate inhibitory activity on cruzain, among 45% and 60% at 100 µM. The coumpound IIf also showed 23,4% inhibitory activity at 100 µM. Therefore, these compounds could be employed as starting points on the search of new effective antichagasic agents.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. As alternativas terapêuticas existentes são limitadas e insuficientes devido principalmente à baixa eficácia e elevada toxicidade. Visando o planejamento de novos candidatos a agentes antichagásicos, diversas vias bioquímicas e proteínas do parasita são alvos de estudos. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease envolvida em todos os estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada como alvo molecular em nosso grupo para o presente trabalho de dissertação de mestrado. Duas séries de compostos foram avaliadas através de ensaios bioquímicos com a enzima alvo. A primeira série consiste de 14 derivados de chalconas e hidrazonas, sendo que 8 compostos apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com valores superiores a 70%. Destes, destaca-se a hidrazona 19, que apresentou significativa potência in vitro, com valor de IC50 de 220 nM. A segunda série investigada, formada por 11 compostos selecionados previamente através de triagens virtuais, apresentou interessante perfil inibitório. Nove compostos apresentaram elevada potência, sendo que 7 exibiram valores de IC50 na faixa nanomolar, entre 646 nM (composto 32) e 11,3 nM (composto 24). Os resultados extremamente positivos alcançados neste trabalho demonstram a importância da avaliação experimental através de ensaios bioquímicos padronizados, que foi fundamental para a caracterização e a validação destas séries de inibidores. A diversidade química estudada é significativa e os melhores compostos serão muito úteis em etapas futuras de pesquisa de nosso grupo envolvendo os processos de descoberta e otimização de compostos líderes. Neste contexto, atenção especial será dada aos compostos 19, 28 e 34 que representam modelos extremamente atrativos em química medicinal e planejamento de fármacos. / Chagas\' disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The existing therapeutic alternatives are limited and insufficient, mainly due to low efficacy and high toxicity. Aiming at the design of new antichagasic agents, a variety of biochemical pathways and parasite proteins are currently being investigated as drug targets. The enzyme cruzain, a cysteine protease involved in all stages of development and differentiation of Trypanosoma cruzi, has been selected as molecular target in this dissertation work. Two series of compounds have been evaluated through biochemical assays with the target enzyme. The first series consists of 14 hydrazone and chalcone derivatives, where 8 compounds showed inhibitory activity against cruzain, with values greater than 70%. Of these, the hydrazone 19 showed significant in vitro potency with a value of 220 nM. The second series investigated, comprising 11 compounds previously selected by a virtual screening approach, showed interesting inhibitory profile. Nine compounds showed high potency, and 7 exhibited IC50 values in the nanomolar range from 646 nM (compound 32) to 11.3 nM (compound 24). The promising results achieved in this study demonstrate the importance of the experimental evaluation using standard biochemical assays, which was essential for the characterization and validation of these series of inhibitors. The chemical diversity explored is significant and the most potent compounds will be useful in future steps of our research group involving the processes of lead discovery and optimization. In this context, special attention will be given to compounds 19, 28 and 34 which represent extremely attractive models in medicinal chemistry and drug design.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. As alternativas terapêuticas existentes são limitadas e insuficientes devido principalmente à baixa eficácia e elevada toxicidade. Visando o planejamento de novos candidatos a agentes antichagásicos, diversas vias bioquímicas e proteínas do parasita são alvos de estudos. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease envolvida em todos os estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada como alvo molecular em nosso grupo para o presente trabalho de dissertação de mestrado. Duas séries de compostos foram avaliadas através de ensaios bioquímicos com a enzima alvo. A primeira série consiste de 14 derivados de chalconas e hidrazonas, sendo que 8 compostos apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com valores superiores a 70%. Destes, destaca-se a hidrazona 19, que apresentou significativa potência in vitro, com valor de IC50 de 220 nM. A segunda série investigada, formada por 11 compostos selecionados previamente através de triagens virtuais, apresentou interessante perfil inibitório. Nove compostos apresentaram elevada potência, sendo que 7 exibiram valores de IC50 na faixa nanomolar, entre 646 nM (composto 32) e 11,3 nM (composto 24). Os resultados extremamente positivos alcançados neste trabalho demonstram a importância da avaliação experimental através de ensaios bioquímicos padronizados, que foi fundamental para a caracterização e a validação destas séries de inibidores. A diversidade química estudada é significativa e os melhores compostos serão muito úteis em etapas futuras de pesquisa de nosso grupo envolvendo os processos de descoberta e otimização de compostos líderes. Neste contexto, atenção especial será dada aos compostos 19, 28 e 34 que representam modelos extremamente atrativos em química medicinal e planejamento de fármacos. / Chagas\' disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The existing therapeutic alternatives are limited and insufficient, mainly due to low efficacy and high toxicity. Aiming at the design of new antichagasic agents, a variety of biochemical pathways and parasite proteins are currently being investigated as drug targets. The enzyme cruzain, a cysteine protease involved in all stages of development and differentiation of Trypanosoma cruzi, has been selected as molecular target in this dissertation work. Two series of compounds have been evaluated through biochemical assays with the target enzyme. The first series consists of 14 hydrazone and chalcone derivatives, where 8 compounds showed inhibitory activity against cruzain, with values greater than 70%. Of these, the hydrazone 19 showed significant in vitro potency with a value of 220 nM. The second series investigated, comprising 11 compounds previously selected by a virtual screening approach, showed interesting inhibitory profile. Nine compounds showed high potency, and 7 exhibited IC50 values in the nanomolar range from 646 nM (compound 32) to 11.3 nM (compound 24). The promising results achieved in this study demonstrate the importance of the experimental evaluation using standard biochemical assays, which was essential for the characterization and validation of these series of inhibitors. The chemical diversity explored is significant and the most potent compounds will be useful in future steps of our research group involving the processes of lead discovery and optimization. In this context, special attention will be given to compounds 19, 28 and 34 which represent extremely attractive models in medicinal chemistry and drug design.

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada de alta prioridade nos programas de pesquisa e desenvolvimento da Organização Mundial da Saúde. Grave problema de saúde pública, é uma das maiores causas de desordens cardíacas em vários países da América Latina. A inexistência de um tratamento satisfatório faz urgente a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse contexto, o objetivo dessa tese de doutorado foi o desenvolvimento de inibidores da enzima cruzaína de Trypanosoma cruzi, alvo molecular validado para a doença de Chagas, utilizando de forma integrada várias estratégias experimentais e computacionais de química medicinal e planejamento de fármacos. Duas classes de inibidores foram utilizadas como compostos líderes: derivados benzimidazólicos e imídicos. Diversas etapas de planejamento, síntese química e avaliação biológica foram realizadas de forma iterativa até que a otimização da potência dos compostos fosse alcançada. Modificações em diversas regiões de cada composto líder foram exploradas, levando ao entendimento de requerimentos de SAR essenciais para a inibição enzimática. O mecanismo de inibição de novas séries de compostos foi determinado. Estudos preliminares de toxicidade, em linhagens celulares e in vivo, mostraram que os compostos apresentam um perfil seguro. Por meio da realização de um estágio de doutorado sanduíche no departamento de metabolismo de fármacos e farmacocinética da empresa farmacêutica norte-america AbbVie, foi realizada a determinação de parâmetros farmacocinéticos dos compostos investigados. Além disso, foi possível a utilização de uma metodologia recentemente implementada na empresa, com foco na otimização de múltiplos parâmetros de um composto teste. Este método foi utilizado para a identificação de candidatos a novos fármacos com um equilíbrio favorável entre potência e parâmetros farmacocinéticos, que são absolutamente essenciais para o desenvolvimento de um novo fármaco eficaz e seguro. Por fim, foi criada uma estratégia mais racional e efetiva para a triagem de candidatos a novos antichagásicos, que apresentem uma combinação otimizada de potência e propriedades de ADME. / Chagas\' disease is considered a high priority neglected tropical disease by the World Health Organization in its research and development programs. It is a serious public health problem, being among the main causes of cardiac disorders in many countries in Latin America. The absence of an effectite treatment makes urgent the pursue of novel therapeutic options. In this way, the goal of this PhD thesis was to develop inhibitors of the enzyme cruzain, the main cysteine protease from Trypanosoma cruzi, a validated target for Chagas\' disease drug discovery. This work involved the combination of experimental and computational approaches in medicinal chemistry and drug design. Two sets of inhibitors were used as lead compounds: benzimidazole and imide derivatives. The design, chemical synthesis and biological evaluation of several compounds were performed iteratively, until the optimization of potency was achieved. Modifications in different regions of each lead compound were explored, making it possible to understand the SAR requirements for enzyme inhibition. The mode of inhibition of the compounds was determined. Preliminary toxicity studies were caried out using cellular lineages and mice, showing that the compounds possess a safe profile. A PhD internship at the department of metabolism and pharmacokinetics at the U.S. pharmaceutical company AbbVie led to the determination and optimization of the pharmacokinetic profile of the inhibitors. Besides, a methodology recently implemented in the company was employed in this work, which aims a multi parametric optimization of the test compounds. This method was used to identify drug candidates with a favorable balance between potency and pharmacokinetic parameters, which are absolutely essential to develop a new, safe and effective drug. Finally, it was created a rational and more effective strategy for the screening of new antichagasic drug candidates, presenting an optimized combinaiton of potency and ADME properties.

A Doença de Chagas é uma protozoose causada pelo parasita hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Classificada pela Organização Mundial de Saúde como extremante negligenciada, essa doença é endêmica em 21 países da América Latina, entretanto podem ser encontrados, ainda, casos nos EUA, Canadá, Europa e Japão devido a movimentos migratórios. Segundo estimativa da Organização Mundial da Saúde, no ano de 2012 havia de 8 a 10 milhões de pessoas infectadas mundialmente e cerca de 25 milhões de pessoas sob risco de contrair a doença de Chagas, ainda sim, havia a ocorrência de 56 mil novos casos da doença e cerca de 12 mil mortes por ano, recorrente de complicações da doença. Diante destes números, essa parasitose se apresenta com um sério problema de saúde pública mundial. A terapêutica antichagásica disponível apresenta apenas dois fármacos o Nifurtimox e o Benznidazol, que atuam somente na fase aguda da doença e provocam sérios efeitos adversos, sendo necessária a busca por novos fármacos eficazes contra o parasita. Os métodos modernos de planejamento de fármacos antiparasitários envolvem a seleção de vias metabólicas específicas a serem bloqueadas, nesse contexto se encontram diferentes proteases, enzimas envolvidas em processos essenciais para a sobrevivência do parasita, entre elas a cruzaína, principal cisteíno-protease do T. cruzi, a qual é responsável pela sobrevivência, replicação celular e invasão do parasita à célula hospedeira, se apresentando como um excelente alvo bioquímico na pesquisa de novos agentes antichagásicos. Partindo do estudo do nitrofural (5-nitro-2-furfurilidenossemicarbazona), antibacteriano também conhecido por sua ação inibitória da cruzaína, adotamos-o como protótipo na pesquisa de fármaco contra a doença. No presente trabalho, utilizou-se o bioisosterismo como estratégia de modificação molecular no planejamento de compostos antichagásicos, inibidores da cruzaína. Foram sintetizados 27 derivados sulfonil-hidrazônicos, para os quais foi determinada a pureza por CLAE e caracterizados por faixa de fusão, espectroscopia no UV e RMN 1H e RMN 13C. Os compostos sintetizados foram avaliados frente às formas celulares epimastigota do T. cruzi, apresentando atividade inibitória de crescimento celular entre 20 e 100% a 100 µM. Nos ensaios frente a cruzaína, os derivados nitrados se mostraram ativos com IC50 em torno de 100 µM. Visto os resultados, podemos sugerir que o grupo nitro presente em alguns compostos pode ser o responsável pela atividade tripanomicida. Face a indicação de toxicidade do grupo nitro, os derivados não nitrados, Ie, IIf e IIIe, podem ser considerados promissores, visto sua atividade intermediária como tripanomicida, entre 45 e 60% à 100 µM, sendo que o composto IIf também apresentou atividade inibidora da cruzaína, 23,4% à 100 µM, podendo assim serem utilizados como ponto de partida na busca de eficazes agentes antichagásicos. / Chagas disease, a protozoonosis caused by the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi, is classified as an extremely neglected disease by World Health Organization. It is an endemic disease in 21 countries on Latin America and cases in the USA, Canada, Europe and Japan were also reported as a consequence of migratory activity. In the last five years, it is estimated that around 8 to 10 million people worldwide were affect by this disease, with nearly 12,000 deaths due to disease complications and approximately 25 million people being at risk of contracting it. Chagas disease is therefore a worldwide public health problem. There are only two available antichagasic therapeutic drugs, nifurtimox and benznidazol, which act only in the acute phase of the disease and cause serious adverse effects, making it necessary to search novel, more effective drugs against this parasite. The newer methods of antiparasitic drug design involve the selection of specific metabolic pathways to be blocked. Many proteases, enzymes involved in essential processes to the survival of the parasite, such as cruzain, are thought of as potential therapeutic targets. Cruzain, the major cysteine protease of T. cruzi, is responsible for cellular replication, survival and invasion of the host cell, being an excellent biochemical target for the drug discovery of new antichagasic agents. Starting from the knowledge of nitrofural (5-nitro-2-furaldehyde semicarbazone) as an antibacterial agent and as a known cruzain inhibitor, we used it as a template for the search of new drugs against Chagas disease. In the present work, bioisosteric modifications were used as a strategy to design new compounds as potential cruzain inhibitors. 27 sulfonilhydrazones derivatives were synthesized, had their purity assessed by HPLC and were characterized through their melting point, UV spectroscopy and NMR 1H and 13C. The synthesized compounds were evaluated against epimastigote strains of T. cruzi, showing inhibitory activity on cellular growth between 20 and 100% at 100 µM. In the cruzain enzymatic assays, the nitro derivatives showed activity around 50% of inhibition at 100 µM, and IC50 around 100 µM. By the results, we can suggest that the presence of the nitro group in some compounds should be responsible for triponocidal activity. Given the known toxicity of nitro compounds, the derivatives without the nitro goup, Ie, IIf and IIIe, may be considered promising given their intermediate inhibitory activity on cruzain, among 45% and 60% at 100 µM. The coumpound IIf also showed 23,4% inhibitory activity at 100 µM. Therefore, these compounds could be employed as starting points on the search of new effective antichagasic agents.