The detailed structure of the myofibrillar material in fibres from different muscles has been studied. Specimens have been obtained from human muscles and from different muscles frequently examined in experimental studies. Both light- and electron microscopical techniques have been used. Of central importance has been the method, which makes it possible to prepare ultrathin sections of frozen tissue, i.e. cryo-ult- ramicrotomy. A number of techniques for image analysis have been applied in order to obtain objektive data from the micrographs. In Paper I the present knowledge about muscle fibre structure, cryo-- sectioning and image analysis is summarized and relevant methodological problems are discussed. Paper II describes the detailed structure of the C-zone of the A-band and shows, above all, that structures occur with different repeats along the long axis of the myofibril. Paper III describes the subcellular organization of different fibres in a homogeneous (based on enzyme histochemical mATPase) population, and shows that different structural characteristies can vary independently of each other. Paper IV describes the structural diversity of the myofibrillar M-band, and paper V the diversity of the myofilament fine structure in different fibres. The results show that there is a most sophisticated, and previosly unrealized, structural specialization both within the myofibrils and between myofibrils from different fibres and muscles, even if the fibres are of the same fibre type. The findings suggest that generally used models, showing the structural organization within myofibrils and myofilaments, are oversimplifications. The fibre population is more heterogeneously built up than the common systems for fibre type classification makes one to belive. / <p>Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 1988, härtill 5 uppsatser.</p> / digitalisering@umu

L’étude avancée de systèmes polymères complexes (mélanges compatibilisés, nanocomposites, copolymères à bloc, etc) est cruciale pour le développement de nouvelles solutions d'ingénierie. Afin d'élucider les relations mise en œuvre-structure-propriétés de ces systèmes, la co-localisation d’informations chimique, physique et morphologique devient essentielle pour obtenir des réponses fiables. La caractérisation de la surface et de l’intérieur des matériaux est également d'une importance primordiale, en particulier pour les matériaux polymères minces (<100 μm) tels que les membranes, qui peuvent présenter des profils de propriétés contrastés entre les surfaces et le coeur. Ces profils de propriétés peuvent être induits par le procédé de mise en œuvre, la chimie du matériau ou son vieillissement. Pour cela, le matériau doit être correctement ouvert sans modification structurelle, chimique ou morphologique. Par conséquent, l'objectif principal de cette thèse a été de développer une méthodologie expérimentale de caractérisation alliant la co-localisation des informations morphologiques, nanomécaniques et chimiques obtenues par le couplage de la Microscopie de Force Atomique (AFM) et la Microspectroscopie Confocale Raman et d’une technique de préparation des coupes transversales par cryo-ultramicrotomie.La stratégie développée a été appliquée à trois systèmes polymères différents: 1) des mélanges polyamide 6 (PA6) / acrylonitrile-butadiène-styrène (ABS), compatibilisés avec un styrène-acrylonitrile greffé anhydride maléique (SAN-MA); 2) de membranes hybrides constituées d’une matrice polymère de type polyétheréthercétone sulfoné (sPEEK) et d’une phase inorganique chimiquement active préparée par chimie Sol-Gel (SG); 3) des copolymères à bloc de type PS-PEO-PS utilisés comme électrolytes pour les batteries lithium. L’étude morphologique du mélange PA/ABS a montré que l'addition d’un copolymère SAN-MA améliore significativement la dispersion de la phase ABS dans la matrice PA et, en fonction du protocole appliqué, modifie la morphologie du mélange et la structure cristalline de la phase PA (teneur/distribution des phases -). Les modifications morphologiques observées ont ensuite été corrélées aux propriétés rhéologiques des mélanges. L’étude des membranes hybrides sPEEK/SG avait pour objectif de comprendre l’impact des étapes clés d’élaboration de ces membranes sur la morphologie des mélanges, la distribution de la phase SG dans la matrice sPEEK et sa densité de réticulation et le précurseur utilisé: (3-mercaptopropyl)-methyldimethoxysilane (SHDi) et (3-mercaptopropyl)-triméthoxysilane (SHTriM). L'efficacité des traitements thermiques appliqués aux différentes étapes du processus de fabrication des membranes SHDi a été démontrée. Pour les membranes basées sur le précurseur SHTriM, il a été démontré que la phase SG présente un système hiérarchiquement organisé, avec des domaines sphériques composés de particules élémentaires plus petites. L’inclusion d'une phase SG à l'intérieur de la membrane sPEEK ne perturbe pas la nanoséparation hydrophobe/hydrophile de la matrice, mais limite son gonflement. Enfin, une 'analyse morphologique a été réalisée sur une série de copolymères à bloc utilisés comme électrolytes polymères dans les batteries lithium. Le contraste nanomécanique des différentes phases a permis de mesurer les distances inter-domaine entre les phases PS et PEO par AFM et une bonne corrélation a été obtenu avec des résultats de diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS). Il a été démontré que les propriétés nanomécaniques de surface du matériau évoluent avec son hydratation (humidité relative de la pièce).Dans chacune des trois études présentées dans cette thèse, la stratégie de co-localisation et a fourni des informations précieuses inaccessibles autrement. Cela ne fut possible qu'après une mise en œuvre spécifique de la cryo-ultramicrotomie pour la coupe de membranes fines et d’échantillons sensibles à l'eau. / The comprehension of the intrinsic characteristics and interactions found in complex polymeric systems is important and challenging for the development of new engineering solutions. In order to elucidate the process-structure-properties interplays, the co-localization of different information becomes essential, to obtain reliable answers. The characterization of both the surface and the bulk of materials is also of prime importance, especially for thin polymeric materials (<100 µm) such as membranes, which can present contrasted properties profiles throughout their thickness. To do so, the material must be properly opened with no structural, chemical and morphological modifications. Therefore, the main objective of this thesis was to develop an experimental methodology of characterization allying the co-localization of morphological, nanomechanical and chemical information using a special setup combining Atomic Force Microscopy and Confocal Raman Microspectroscopy to study cross-sections of cryo-ultramicrotomed samples.We applied the developed strategy to three different polymer systems: 1) blends of Polyamide 6 (PA6) and Acrylonitrile-Butadiene-Styrene (ABS), compatibilized with a Styrene-Acrylonitrile grafted with Maleic Anhydride (SAN-MA); 2) hybrid membranes of sulfonated polyether-etherketone (sPEEK) with active networks prepared by Sol-Gel (SG) chemistry; 3) block copolymers based on PS-PEO-PS used as polymer electrolyte membranes. The first study was focused on the impact of the compatibilizer and the mixing protocols on the morphology of an immiscible PA6/ABS blend. Co-localized AFM/Raman established that the addition of the SAN-MA copolymer, at different steps of the blending, favors the formation of the PA6 γ polymorph with amounts and distribution depending on the blending protocols. The different resulting morphologies were found to impact the blends’ rheological properties. The second study focused on the fabrication of hybrid sPEEK/SG membranes for Fuel Cell based on two different SG precursors. The main goal of this study was to qualify the impact of each step of fabrication on the membranes’ physical, nanomechanical and chemical properties, as well as their stability over time. Quantitative nano-mechanical (AFM) and chemical analysis (Raman) of the SG phase revealed its evolution throughout the fabrication process, confirming the efficiency of the applied thermal treatments. For membranes based on (3-mercaptopropyl)-trimethoxysilane SG precursor, it has been shown that the SG phase presents a hierarchically organized system, composed of elementary particles which aggregate into the round shape domains. The presence of SG phase inside the membrane (AFM/Raman) conserves the hydrophobic/hydrophilic nanophase separation of the host sPEEK, but the increasing SG uptake limits the swelling of the host membrane, which can affect its proton conductivity. Finally, the third study was focused on the morphological analysis of a series of triblock copolymers, used as polymer electrolytes in batteries. Their nanomechanical heterogeneities allowed the measurement of the inter-domain distances between the PS and PEO phases directly from the AFM images which were correlated to Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) measurements. It has been shown that the material’s surface nanomechanical properties evolve from the dry state to the equilibrium with the room relative humidity.To summarize, the development of the characterization methodology allying co-localized AFM/Raman with multiple complementary techniques allowed for the study of different complex polymeric systems for a variety of applications. In each of the three studies of this thesis, the co-localization and multi-technique strategy provided precious information that could not be accessed by other means. This could only be possible by the adaptation of cryo-ultramicrotomy for sample preparation, especially for thin polymer membranes and water sensitive samples.

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht als einzigartige Methode die dreidimensionale Visualisierung der makromolekularen Struktur von Eis-eingebetteten Zellen in ihrem nativen Zustand [Baumeister 2005; Leis et al. 2009]. Ziel dieser Arbeit war es einen universellen Einsatz der Kryo-ET bei eukaryotischen Zellen zu ermöglichen. Dazu wurden neue Ansätze entwickelt bzw. bestehende Methoden optimiert. Da bei der Anwendung der Tomographie die Probendicke mit jedem Kippwinkel zunimmt, gilt momentan die Probendicke (< 1 µm) als limitierender Faktor bei der Kryo-ET. Während prokaryotische Zellen nahezu routinemäßig mittels Kryo-ET untersucht werden können, ist dies bei eukaryotischen Zellen nur partiell in peripheren Arealen oder Ausläufern der Zelle möglich. Dies konnte anhand der Untersuchung von intakten, pluripotenten Stammzellen (P19 Zellen) bestätigt werden. Aufgrund ihrer neuronen-ähnlichen dendritischen Morphologie können diese dünnen Bereiche mit dem Elektronenstrahl durchdrungen werden. So konnte in der 3D-Rekonstruktion eines Zellausläufers ein Mitochondrium in seiner nativen Umgebung visualisiert werden. Zudem wurden mehrere ATP-Synthasen in der Cristaemembran identifiziert, die erstmalig die Existenz von ATP-Synthasedimeren in situ bestätigen. Für die Untersuchung von zellmittigen (dicken) Bereichen müssen jedoch andere Methoden angewendet werden. So ermöglicht die Kryo-Ultramikrotomie das Herstellen von Dünnschnitten (< 100 nm) Eis-eingebetteter Proben. Mit Hilfe dieser Methode wurden in dieser Arbeit Kryo-Schnitte von HL-1 Kardiomyozyten erstellt und tomographisch analysiert. Da die Probe sehr heterogen verteilt ist, ist die Suche nach der Zielstruktur im Elektronenmikroskop sehr zeitaufwendig. Gleichzeitig ist die strahlenempfindliche Probe während der Suche dem Elektronenstrahl ausgesetzt, was die Struktur beeinträchtigen kann. Um die ‚Effizienz’ der Kryo-ET an Kryo-Schnitten zu erhöhen, wurden zwei neue Verfahren implementiert: Einerseits die korrelative Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, welche sich zur Suche und Identifikation von Mitochondrien innerhalb des Dünnschnittes unter Flüssigstickstoff (LN2)-Temperatur eignet und andererseits eine neue Methode, die das Aufbringen von Goldkolloiden auf Kryo-Schnitten zum späteren Alignieren der Kippserie ermöglicht. Letztere setzt eine Synthese von 10 nm großem, kolloidalem Gold in Toluol voraus. Nach Zugabe von Isopentan werden die auf dem EM-Trägernetzchen (Grid) angehefteten Kryo-Schnitte bei einer Temperatur von -150°C in diese Suspension getaucht. Des Weiteren wurden verschiedene Trägermaterialien zur Kultivierung von Kardiomyozyten getestet und Osmolalitätsmessungen von unterschiedlichen Kryo-Schutz¬lösungen, welche für das Hochdruck-Verfahren notwendig sind, durchgeführt. Auch hier konnten in den 3D-Rekonstruktionen von Kardiomyozyten die ATP-Synthasen eindeutig in Kryo-Schnitten identifiziert werden. Darüber hinaus gelang die 3D-Visualisierung von zwei Mitochondrien, die sich in der Teilungs- oder Fusionsphase befanden. In einem dieser Mitochondrien sind inorganische Ablagerungen sichtbar. Im Verlauf dieser Dissertation wurde zusätzlich die Methode des Cryo-Planings entwickelt; eine Variante der Kryo-Ultramikrotomie. Bei dieser Technik wird die vitrifizierte Probe direkt auf dem EM-Grid gedünnt. Dieses Verfahren ermöglicht es, Material vom vitrifizierten Eisfilm mittels eines Diamantmessers zu entfernen. Dafür wurde ein spezieller Halter für das Kryo-Ultramikrotom konzipiert und hergestellt. Der Halter erlaubt das Zentrieren und Klemmen eines EM-Grids. Um das Abtragen kleinerer Bereiche der Eisoberfläche zu ermöglichen, wurde ein 1 mm breites Diamantmesser angefertigt. Die Analyse der gedünnten Proben mittels Kryo-Scanning Electron Microscopy (SEM) zeigte eine gleichmäßig abgetragene Oberfläche. Schneideartefakte, wie sie bei der Kryo-Ultramikrotomie auftreten, wurden nicht beobachtet. Zudem sind die zellulären Proben im gedünnten Bereich des Eisfilms sehr leicht identifizierbar. Brüche, die möglicherweise durch den Probeneinbau im Eisfilm entstehen, konnten mittels Kryo-SEM bis dato nicht beobachtet werden. Die theoretischen Betrachtungen ergaben, dass unter Verwendung des Cryo-Planings als alleinige Methode elektronentransparente Bereiche (< 1 µm Dicke) hergestellt werden können. Bisher konnte jedoch keine elektronentomographische Untersuchung einer geplanten Probe erfolgen, da sie sich als zu dick erwies. Dies ist darauf zurückzuführen, dass mit dem Stereomikroskop nur eine sehr grobe Abschätzung der tatsächlichen Dicke des abgetragenen Bereichs möglich ist.

Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) ermöglicht als einzigartige Methode die dreidimensionale Visualisierung der makromolekularen Struktur von Eis-eingebetteten Zellen in ihrem nativen Zustand [Baumeister 2005; Leis et al. 2009]. Ziel dieser Arbeit war es einen universellen Einsatz der Kryo-ET bei eukaryotischen Zellen zu ermöglichen. Dazu wurden neue Ansätze entwickelt bzw. bestehende Methoden optimiert. Da bei der Anwendung der Tomographie die Probendicke mit jedem Kippwinkel zunimmt, gilt momentan die Probendicke (< 1 µm) als limitierender Faktor bei der Kryo-ET. Während prokaryotische Zellen nahezu routinemäßig mittels Kryo-ET untersucht werden können, ist dies bei eukaryotischen Zellen nur partiell in peripheren Arealen oder Ausläufern der Zelle möglich. Dies konnte anhand der Untersuchung von intakten, pluripotenten Stammzellen (P19 Zellen) bestätigt werden. Aufgrund ihrer neuronen-ähnlichen dendritischen Morphologie können diese dünnen Bereiche mit dem Elektronenstrahl durchdrungen werden. So konnte in der 3D-Rekonstruktion eines Zellausläufers ein Mitochondrium in seiner nativen Umgebung visualisiert werden. Zudem wurden mehrere ATP-Synthasen in der Cristaemembran identifiziert, die erstmalig die Existenz von ATP-Synthasedimeren in situ bestätigen. Für die Untersuchung von zellmittigen (dicken) Bereichen müssen jedoch andere Methoden angewendet werden. So ermöglicht die Kryo-Ultramikrotomie das Herstellen von Dünnschnitten (< 100 nm) Eis-eingebetteter Proben. Mit Hilfe dieser Methode wurden in dieser Arbeit Kryo-Schnitte von HL-1 Kardiomyozyten erstellt und tomographisch analysiert. Da die Probe sehr heterogen verteilt ist, ist die Suche nach der Zielstruktur im Elektronenmikroskop sehr zeitaufwendig. Gleichzeitig ist die strahlenempfindliche Probe während der Suche dem Elektronenstrahl ausgesetzt, was die Struktur beeinträchtigen kann. Um die ‚Effizienz’ der Kryo-ET an Kryo-Schnitten zu erhöhen, wurden zwei neue Verfahren implementiert: Einerseits die korrelative Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, welche sich zur Suche und Identifikation von Mitochondrien innerhalb des Dünnschnittes unter Flüssigstickstoff (LN2)-Temperatur eignet und andererseits eine neue Methode, die das Aufbringen von Goldkolloiden auf Kryo-Schnitten zum späteren Alignieren der Kippserie ermöglicht. Letztere setzt eine Synthese von 10 nm großem, kolloidalem Gold in Toluol voraus. Nach Zugabe von Isopentan werden die auf dem EM-Trägernetzchen (Grid) angehefteten Kryo-Schnitte bei einer Temperatur von -150°C in diese Suspension getaucht. Des Weiteren wurden verschiedene Trägermaterialien zur Kultivierung von Kardiomyozyten getestet und Osmolalitätsmessungen von unterschiedlichen Kryo-Schutz¬lösungen, welche für das Hochdruck-Verfahren notwendig sind, durchgeführt. Auch hier konnten in den 3D-Rekonstruktionen von Kardiomyozyten die ATP-Synthasen eindeutig in Kryo-Schnitten identifiziert werden. Darüber hinaus gelang die 3D-Visualisierung von zwei Mitochondrien, die sich in der Teilungs- oder Fusionsphase befanden. In einem dieser Mitochondrien sind inorganische Ablagerungen sichtbar. Im Verlauf dieser Dissertation wurde zusätzlich die Methode des Cryo-Planings entwickelt; eine Variante der Kryo-Ultramikrotomie. Bei dieser Technik wird die vitrifizierte Probe direkt auf dem EM-Grid gedünnt. Dieses Verfahren ermöglicht es, Material vom vitrifizierten Eisfilm mittels eines Diamantmessers zu entfernen. Dafür wurde ein spezieller Halter für das Kryo-Ultramikrotom konzipiert und hergestellt. Der Halter erlaubt das Zentrieren und Klemmen eines EM-Grids. Um das Abtragen kleinerer Bereiche der Eisoberfläche zu ermöglichen, wurde ein 1 mm breites Diamantmesser angefertigt. Die Analyse der gedünnten Proben mittels Kryo-Scanning Electron Microscopy (SEM) zeigte eine gleichmäßig abgetragene Oberfläche. Schneideartefakte, wie sie bei der Kryo-Ultramikrotomie auftreten, wurden nicht beobachtet. Zudem sind die zellulären Proben im gedünnten Bereich des Eisfilms sehr leicht identifizierbar. Brüche, die möglicherweise durch den Probeneinbau im Eisfilm entstehen, konnten mittels Kryo-SEM bis dato nicht beobachtet werden. Die theoretischen Betrachtungen ergaben, dass unter Verwendung des Cryo-Planings als alleinige Methode elektronentransparente Bereiche (< 1 µm Dicke) hergestellt werden können. Bisher konnte jedoch keine elektronentomographische Untersuchung einer geplanten Probe erfolgen, da sie sich als zu dick erwies. Dies ist darauf zurückzuführen, dass mit dem Stereomikroskop nur eine sehr grobe Abschätzung der tatsächlichen Dicke des abgetragenen Bereichs möglich ist.

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l’ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l’organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d’imagerie choisies nous ont permis d’obtenir une résolution permettant d’identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d’ADN enroulée autour du cœur d’histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu’à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels. / The ultrastructure of HT29 cells (human epithelial adenocarcinoma cell line) was studied by CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections) with a special emphasis on chromatin organization in the cell nucleus. We proposed methodological improvements for this technique:- We first developed a grid holding micromanipulator to facilitate both cryosections collect and deposition on carbon-coated TEM grids.- We also developed new metallic thin films (to replace carbon-base supports) to enhance the adhesion of cryosections on their support. The TiO2 thin films that we produced and analysed by electron microscopy (high resolution imaging, EELS and chemical mapping) seem to be an interesting alternative to carbon films for the deposition of cryosections. Their adhesive properties could be due to Titanium high electric conductance at low temperature (although this relation has not been clearly demonstrated yet).In HT 29 cells, we indentified cell organites (nucleus; cytoskeleton filament bundles, multilamellar bodies) in situ. Selected imaging conditions provide for a high enough resolution to visualise the two membrane leaflets. In the cell nucleus, we observed striated patterns separated from 2.7 to 3.5 nm that we assume to be DNA molecule turns wrapped around the histone protein core. Compared with the dense phases formed in vitro by nucleosome core particle in solution, our images suggest that nucleosomes are locally ordered in chromatin. This observation is discussed regarding the chromatin polymeric models.