Le projet de thèse, mené en collaboration avec le laboratoire Medesis Pharma, porte sur la mise au point de deux formulations pharmaceutiques, une microémulsion inverse et un gel colloïdal, à base de Pécéol®, lécithine, éthanol et eau. Le lithium indiqué dans le traitement de maladies neurodégénératives a été utilisé comme un modèle de principe actif hydrophile dans le cadre de ce projet. Ce travail a été initié par l’étude du comportement de phases du mélange quaternaire Pécéol®/lécithine/éthanol/eau, mettant essentiellement l’accent sur les différents paramètres impliqués dans les transitions de phases, dans le but de déterminer le rôle du Pécéol® et de la lécithine dans la structuration du système.- L’étude des propriétés structurales de la microémulsion, dans le domaine riche en Pécéol®, a montré que la structure du système n’est pas cohérente avec un modèle classique de micelles sphériques, l’hypothèse d’une structure localement lamellaire a été proposée. Les propriétés de solubilisation de la microémulsion ont été évaluées par l’élaboration d’une série de diagrammes de phases pseudo-ternaires, en faisant varier le rapport éthanol/lécithine. Une efficacité optimale a été obtenue pour un rapport éthanol/lécithine égal à 40/60. La formulation optimisée est capable d’incorporer efficacement le lithium (Li), à des concentrations acceptables sans altérer la stabilité du système. L’étude des propriétés d’incorporation du Li dans la microémulsion a montré que le mécanisme d’encapsulation est compatible avec un modèle d’interactions de type drug-surfactant. Les résultats des études de stabilité de la microémulsion vide et chargée en Li menées selon les conditions ICH sont satisfaisants.- La structuration du gel clair, dans le domaine riche en lécithine, a été suivie par des analyses de rhéologie et de microscopie en lumière polarisée en fonction du rapport lécithine/Pécéol®. Les résultats ont montré que les propriétés rhéologiques du gel peuvent être modifiées en ajustant le rapport lécithine/Pécéol®. La caractérisation de la structure du gel clair par diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) et cryofracture conjuguée à la microscopie électronique en transmission (FF-TEM) a mis en évidence une structure anisotrope hexagonale H2. Alors que dans le domaine riche en eau, une structure anisotrope hexagonale inverse H2 et lamellaire Lα a été mise en évidence. Les propriétés rhéologiques modulables du gel dans le domaine riche en lécithine ainsi que sa grande capacité de rétention d’eau, sont particulièrement intéressantes pour une application du gel clair dans le domaine de pharmaceutique et/ou cosmétique. / This thesis project, carried out in collaboration with Medesis Pharma laboratory, is about the development of two pharmaceutical formulations, a reverse microemulsion and a colloidal gel, based on Pécéol®, lécithine, ethanol and water. The indicated lithium in the treatment of neurodegenerative diseases has been used as a hydrophilic principal active model for this project. This work started with the study of the phase behavior of the four component system Pécéol®/lecithin/éthanol/water, focusing primarily on the various parameters involved in phase transitions in order to determine the role of Pécéol® and lecithin in the structuring of the system.- The study of the structural properties of the reverse microemulsion, in the Pécéol® rich domain, showed that the system structure is not coherent with a classical model of spherical micelles, a hypothesis of a local lamellar structure was proposed. The solubilization properties of the microemulsion were evaluated following the development of a series of pseudo-ternary phase diagrams, by varying the ethanol/lecithin ratio. Optimal efficiency was obtained for an ethanol/lecithin ratio of 40/60. The optimized formulation is capable of effectively incorporating lithium (Li) to acceptable concentrations without altering the stability of the system. The study of the incorporation properties of Li in the microemulsion has shown that the encapsulation mechanism is compatible with drug-surfactant binding model. The results of the stability studies of the free and Li loaded microemulsion, conducted according to ICH conditions, are satisfactory.- The gel structuring was followed, in the lecithin rich domain, through rheological and optical microscopy analyses, according to lecithin/Pécéol® ratio. Results showed that the rheological properties of the gel can be modified by adjusting the lecithin/Pécéol® ratio. Moreover, the characterization of the gel structure through Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) and Freeze Fracture-Transmission Electron Microscopy (FF-TEM) showed an inverse hexagonal phase H2. While, in the water rich region, an inverse hexagonal H2 and lamellar Lα phases were identified. The adjustable rheological properties of the clear gel, and its great water solubilisation capacity, are particularly interesting for the application of the gel in pharmaceutical and/or cosmetic fields.

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l'ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l'organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d'imagerie choisies nous ont permis d'obtenir une résolution permettant d'identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d'ADN enroulée autour du cœur d'histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu'à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels.

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l’ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l’organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d’imagerie choisies nous ont permis d’obtenir une résolution permettant d’identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d’ADN enroulée autour du cœur d’histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu’à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels. / The ultrastructure of HT29 cells (human epithelial adenocarcinoma cell line) was studied by CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections) with a special emphasis on chromatin organization in the cell nucleus. We proposed methodological improvements for this technique:- We first developed a grid holding micromanipulator to facilitate both cryosections collect and deposition on carbon-coated TEM grids.- We also developed new metallic thin films (to replace carbon-base supports) to enhance the adhesion of cryosections on their support. The TiO2 thin films that we produced and analysed by electron microscopy (high resolution imaging, EELS and chemical mapping) seem to be an interesting alternative to carbon films for the deposition of cryosections. Their adhesive properties could be due to Titanium high electric conductance at low temperature (although this relation has not been clearly demonstrated yet).In HT 29 cells, we indentified cell organites (nucleus; cytoskeleton filament bundles, multilamellar bodies) in situ. Selected imaging conditions provide for a high enough resolution to visualise the two membrane leaflets. In the cell nucleus, we observed striated patterns separated from 2.7 to 3.5 nm that we assume to be DNA molecule turns wrapped around the histone protein core. Compared with the dense phases formed in vitro by nucleosome core particle in solution, our images suggest that nucleosomes are locally ordered in chromatin. This observation is discussed regarding the chromatin polymeric models.

Une étude expérimentale sur la structure et la dynamique d'un complexe hydraté de fragments d'ADN (150 pb) et des phases lamellaires de lipides non-cationiques est présentée. Par la variation de d'hydratation, il est possible de contrôler le confinement imposé par cette matrice hôte sur les nucléotides insérés dans les couches aqueuses. L’organisation supramoléculaire du complexe est suivie par diffraction des rayons-X et des techniques de microscopie optique et électronique. Un riche polymorphisme de mésophases est observé en fonction du confinement. Dans le régime plus hydraté, les fragments se distribuent selon une orientation nématique. Dans la mesure où la quantité de l'eau diminue, le confinement des bicouches sur les nucléotides monte et des corrélations trans-membranaires donnent origine à des phases hautement organisées, avec de symétries rectangulaires et hexagonales (2D) d'ADN dans la phase lipidique. L'incorporation totale des nucléotides par la phase lamellaire est observée uniquement lorsque des grandes quantités d'ADN y sont présentes. Ce fait souligne une importance majeur des interactions de volume exclu. Une analyse du paramètre de Caillé montre que l'insertion des fragments diminue les fluctuations des membranes. À partir des ces observations, il est suggéré que la modification des interactions stériques entre des lamelles, associée à des effets interfaciaux ADN-membranes, est un mécanisme important dans le comportement de phases. Les propriétés dynamiques sont étudiés avec la technique de retour de fluorescence après photo-blanchiment (FRAP). Un modèle développé récemment pour l'analyse de diffusion anisotrope est testé avec succès, démontrant une corrélation proche entre structure et dynamique. / An experimental study on the structural and dynamical properties of a hydrated DNA-non-cationic complex is presented. By varying the water amount, it is possible to control the confinement imposed by this host matrix over the organization of the nucleotides inserted within the water layers. The supramolecular assembly is investigated by X-rays diffraction and techniques involving both optical and electron microscopy. A rich polymorphism of mesophases is observed in function of confinement. In the more hydrated regime, the fragments are distributed according to nematic orientation in-between lamellae. As the water amount decreases, the confinement of bilayers over the particles increases and transmembrane correlations appear, giving raise to highly-ordered phases, with 2D-rectangular and -hexagonal symmetries of DNA embodied in the lamellar phase. The full incorporation of nucleotides by the lamellar phase is observed only in the presence of large amounts of DNA. This finding points to major importance of excluded volume interactions. An analysis of the Caillé parameter shows that the insertion of DNA reduces the fluctuations of membranes. From these observations, it is suggested that changes in the interactions between bilayers, together with the appearance of interfacial effects between DNA and membranes, are a mechanism relevant for the phase behavior of these systems. The dynamical properties of nucleotides are investigated through the fluorescence recovery after photobleach (FRAP). A model recently developed for analyses of anisotropic diffusion is sucessfully tested, demonstrating a close relationship between structure and dynamics. / Um estudo experimental sobre aspectos estruturais e dinâmicos de um complexo hidratado de fragmentos de DNA (150 pb) e fases lamelares de lipídios não-catiônicos é apresentado. Variando-se a hidratação, é possível controlar o confinamento imposto por essa matriz hospedeira sobre os nucleotídeos inseridos na camada aquosa. O arranjo supramolecular do complexo é investigado por difração de raios X e técnicas de microscopia óptica e eletrônica. Um rico polimorfismo de mesofases é observado em função do confinamento. No regime mais hidratado, os fragmentos se distribuem segundo uma orientação nemática entre as membranas. À medida que a quantidade de água diminui, o confinamento das bicamadas sobre os nucleotídeos aumenta e correlações transmembranares aparecem, dando origem a fases altamente organizadas, com simetrias retangulares e hexagonais 2D de DNA entre as lamelas. A incorporação completa de nucleotídeos é observada apenas quando grandes quantidades de DNA estão presentes. Esse fato aponta para importância maior de interações de volume excluído. Uma análise do parâmetro de Caillé mostra que as flutuações das membranas diminuem com a inserção de DNA. A partir dessas observações, é sugerido que a alteração das interações entre membranas, aliada à aparição de efeitos interfaciais entre DNA e membranas, é um mecanismo relevante no comportamento de fase. As propriedades dinâmicas dos nucleotídeos são investigadas através da técnica de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Um modelo recentemente desenvolvido para análise de difusão anisotrópica é testado com sucesso, demonstrando estreita correlação entre estrutura e dinâmica.