La anguila europea es una especie de gran importancia comercial en la acuicultura europea, pero el dramático descenso de las poblaciones naturales ha provocado la inclusión de esta especie en la lista CITES (convención del comercio internacional de especies en peligro de la fauna y flora salvaje). Considerando esta situación, se hace necesaria más investigación en el control reproductivo. El presente documento contiene 5 estudios que se pueden dividir en dos partes principales: la primera, una descripción del proceso de la maduración artificial de la anguila, seguida por una segunda parte centrada en el de desarrollo de técnicas para la evaluación de la calidad espermática, y la conservación del esperma. Una vez fijado el tratamiento hormonal en anteriores estudios, nosotros hemos estudiado la evolución de la calidad espermática a lo largo del periodo de espermiación, tratando de determinar las semanas con mayor porcentaje de muestras con alta calidad espermática. Para la evaluación de la calidad espermática los parámetros analizados fueron los siguientes: porcentaje de células vivas, motilidad, y morfometría de la cabeza del espermatozoide. El porcentaje de células vivas fue medido poniendo a punto técnicas de tinción fluorescentes, mientras que la medida del tamaño de la cabeza fue llevado a cabo por un programa informático (sistema ASMA), pero este análisis presentó problemas debido a la especial forma de la cabeza del espermatozoide de esta especie. Para validar esta técnica fue necesario comparar los resultados obtenidos por el sistema ASMA con los obtenidos por el microscopio electrónico de barrido. Distintos machos que recibieron el mismo tratamiento hormonal mostraron diferentes respuestas en cuanto al nivel de desarrollo gonadal y calidad espermática. Para entender qué factores podían influir en en estos factores, se realizó por primera vez la descripción de la maduración de machos de anguila europea, analizando la expresión de GnRHs y gonadotropinas, los n / Sánchez Peñaranda, D. (2008). Study of male reproductive physiology and sperm conservation in the european EEL ( Anguilla anguilla, L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3063

La crioconservación de los embriones por congelación o vitrificación reduce la supervivencia de los embriones de conejo (Oryctolagus cuniculus) entre un 20 y 50% dependiendo de la estirpe genética y el procedimiento utilizado. En embriones vitrificados de conejo se ha observado un elevada mortalidad tras la implantación que sugeriría que el proceso tiene efectos tardíos y negativos sobre el desarrollo fetal. El objetivo de la tesis fue estudiar el transcriptoma embrionario previo a la implantación (6 días) y el desarrollo embrionario y fetal de embriones de conejo crioconservados mediante dos procedimientos habituales en esta especie. Específicamente, el objetivo del capítulo I fue la evaluación de los efectos del procedimiento de congelación sobre el desarrollo y expresión génica de embriones de conejo. Para ello, evaluamos primero la distribución de pérdidas durante la gestación analizando las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento. Después comparamos el perfil transcriptómico de embriones de 6 días, previamente congelados y transferidos en el estadio de mórula, con embriones desarrollados in vivo (6 días post-inseminación). Para ello, llevamos a cabo un análisis microarray de dos colores y usamos una plataforma genérica específica de conejo. Las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento fueron más bajas para los embriones congelados. Así mismo, también se observaron diferencias a nivel de expresión, y los embriones viables de 6 días del grupo congelado presentaron 70 genes diferencialmente expresados. Esta fue la primera aproximación que nos proporcionó una lista de genes candidatos que podrían provocar fallos en el diálogo materno-embrionario, implantación y formación de la placenta. El capítulo II evaluó la distribución de pérdidas durante la gestación debidas al proceso de vitrificación. Sin embargo, en este caso, para evaluar los efectos de la vitrificación sobre la expresión génica de blastocistos tardíos usamos la técnica de PCR cuantitativa (qPCR) con 10 genes candidatos, elegidos por estar diferencialmente expresado en los embriones congelados del anterior trabajo (SCGB1A1, EMP1, C1QTNF1, ANXA3, EGFLAM y TNFAIP6 ), o por su rol en el desarrollo embrionario e implantación (OCT4, VEGF, HBA and LAMA 4 ). Además, introdujimos también datos ecográficos sobre el tamaño del saco embrionario, feto, la placenta fetal y materna desde el día 10 hasta el 14 de gestación. Los resultados mostraron dos picos principales de pérdidas durante la gestación: Uno situado antes de la implantación y el otro después. Asimismo, también detectamos una reducción en el tamaño del feto y de la placenta materna entre los días 10 y 14. Finalmente, pudimos observar que, comparado con los embriones de 6 días desarrollados en condiciones in vivo, la expresión relativa de los transcritos SCGB1A1, EMP1, C1QTNF1, ANXA3, EGFLAM y TNFAIP6 estaba significativamente alterada en los embriones vitrificados, siguiendo además el patrón previamente observado en los embriones congelados. En el capítulo III se compararon directamente los transcriptomas de los embriones de 6 días obtenidos de embriones congelados y vitrificados de 3 días. Siguiendo los mismos procedimientos que en los trabajos anteriores, evaluamos la distribución de pérdidas a lo largo de la gestación analizando las tasas de desarrollo a blastocisto tardío, implantación y nacimiento. Asimismo, empleando la misma plataforma genérica microarray del primer experimento realizamos un análisis dos colores microarray en el que comparamos directamente el perfil transcriptómico a día 6 de desarrollo de embriones congelados y vitrificados. Los resultados reportaron que la congelación y la vitrificación tienen los mismos efectos dañinos sobre el desarrollo a día 6, pero la distribución de pérdidas difiere durante la implantación y el desarrollo, siendo las tasas de implantación y nacimiento mayores para el grupo vitrificado. Las similitudes a día 6 de desarrollo también se reflejaron en el patrón de expresión génica, porque no se detectaron diferencias a nivel transcriptómico entre los dos tipos de embriones. En el capítulo IV se analizó el transcriptoma de los embriones vitrificados de 6 días y placentas fetales de 14 días frente al transcriptoma de embriones y placentas control no vitrificados pero que fueron recuperados y transferidos, aislando así el efecto del proceso de vitrificación. Al igual que observamos en el capítulo II, los embriones vitrificados que eran capaces de llegar al estadio de blastocisto tardío eran también capaces de implantar, pero no todos los embriones implantados tenían la capacidad de finalizar la gestación. Teniendo en cuenta los resultados de las ecografías del trabajo anterior, tomamos datos del peso del feto, la placenta fetal y materna a día 14 de desarrollo y del peso al nacimiento. En los resultados detectamos un descenso en los pesos del feto y la placenta materna, así como un incremento en el peso al nacimiento de los embriones vitrificados. En este experimento, para la evaluación de la expresión génica introdujimos unas cuantas modificaciones en el diseño experimental. Así, empleamos una plataforma microarray específica para embrión de conejo y realizamos un análisis microarray de un color. En el caso de los embriones de 6 días no encontramos diferencias significativas en la expresión génica, pero en el caso de las placentas identificamos 60 genes sobreexpresados. Llegados a este punto, realizamos un análisis 2D-DIGE en as placentas fetales para encontrar diferencias a nivel proteómico. Así, detectamos 89 proteínas diferencialmente expresadas en las placentas de 14 días de desarrollo derivadas de embriones vitrificados. Debido a los anteriores resultados de alteraciones a nivel transcriptómico y proteómico en las placentas pocos días después de la implantación, el capítulo V lo centramos en el estudio de las alteraciones proteómicas en placentas fetales de 24 días de desarrollo. En este trabajo pretendimos comparar los perfiles proteicos de placentas fetales de embriones vitrificados y controles en la última parte de la gestación, pocos días antes del nacimiento. Tras realizar un análisis 2D-DIGE encontramos que había 32 proteínas diferencialmente expresadas entre los grupos experimentales. Estos resultados demostraron que la vitrificación induce cambios sustanciales en la expresión de proteínas placentarias al final de la gestación, y que aparte de las consecuencias a corto plazo, la crioconservación embrionaria puede provocar consecuencias a largo plazo en esos fetos que al final nacen. Los resultados de esta tesis nos permiten suponer que la crioconservación embrionaria, bien sea por congelación o vitrificación, no debe ser neutral. Además, por primera vez se han observado modificaciones en los embriones vitrificados ya implantados. Basándonos en estos resultados, nuestro trabajo deja abierta la cuestión de si los efectos causados por la vitrificación durante el desarrollo fetal pueden conllevar algún tipo de alteraciones metabólicas o fisiológicas en la vida adulta. / Saenz De Juano Ribes, MDLD. (2014). Estudio del efecto de la crioconservación sobre la expresión génica de embriones de conejo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36957 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

Tesis por compendio / [EN] Cryopreserved boar sperm is not used extensively for artificial insemination due to poor fertility rates of the sperm after freezing and thawing. The sperm membrane is damaged when cooled from body temperature to 5 ºC (cold shock), as well as during the freeze-thaw process. Increasing the cholesterol content of boar sperm membranes could increase their post-thaw survival, similarly to other species that are cold shock sensitive. Cholesterol can be easily added to sperm membranes using cholesterol-loaded cyclodextrins (CLC). Treating sperm from different species susceptible to cold-shock with CLC before cryopreservation improves sperm cryosurvival. Egg yolk and glycerol are common constituents of extenders used for boar sperm cryopreservation. However, conventional freezing extenders could not be the appropriate for CLC-treated sperm. The aim of this Thesis is to evaluate cryosurvival of CLC or cyclodextrin-treated boar sperm in three different conditions: using conventional freezing extenders, using extenders with alternative concentrations of glycerol and egg yolk and using amides as cryoprotectants. CLC or methyl- ß-cyclodextrin treatment (1 mg/120 x 106 sperm) prior to cryopreservation using a conventional freezing extenders provided either slight or no benefit, respectively, to post-thaw sperm plasma membrane integrity (+ 8%; P < 0.05) and motility (P > 0.05). In addition, sperm from both, good and poor freezers, responded similarly to CLC treatment (P > 0.05). Reduction in egg yolk concentration from 20 to 10% was detrimental for post-thaw sperm viability, even in semen treated with CLC (- 12%; P < 0.05). On the other hand, it was observed that traditional concentration of glycerol (3%) was not the appropriate to freeze CLC-treated sperm (- 13% viable sperm compared to control; P < 0.05). Thus, CLC-treated sperm showed a higher tolerance (+ 13 % sperm viability; P < 0.05) to high glycerol concentrations (5%) than non-treated sperm. Regarding the efficacy of amides as cryoprotectants, three of the amides (lactamide, acetamide and formamide) produced deleterious effects in fresh boar sperm (P < 0.05). The other amides (methylformamide, dimethylacetamide and dimethylformamide) efficiently improved post-thaw sperm viability (+ 5 to 15 %; P < 0.05) but negatively affected the sperm motility (- 11 to 16% total motile sperm; P < 0.05) and the sperm fertilizing ability in vitro (dimethylformamide: - 64 % penetration rate; P < 0.05), irrespective of the sperm treatment. On the other hand, CLC-treated samples showed better in vitro fertilizing ability than control samples when glycerol was used as cryoprotectant (+ 2 penetrated spermatozoa/oocyte; P < 0.05). The results obtained in this Thesis suggest that conventional freezing protocols should be optimized for CLC-treated boar sperm in order to obtain the benefit of CLC treatment observed in other species sensitive to cold shock. / [ES] Las inseminaciones artificiales en la especie porcina se realizan habitualmente con semen refrigerado, debido a las bajas tasas de fertilidad obtenidas con el semen congelado-descongelado. La membrana del espermatozoide sufre importantes daños cuando es sometida a la fase de enfriamiento desde la temperatura corporal hasta alcanzar los 5 ºC (choque térmico), así como durante el proceso de congelación y descongelación. El aumento del contenido de colesterol en las membranas de los espermatozoides de cerdo podría mejorar su supervivencia tras la descongelación, como sucede en otras especies sensibles al choque térmico. Este incremento en la cantidad de colesterol se puede realizar fácilmente utilizando ciclodextrinas saturadas de colesterol (CLC). El tratamiento con CLC de espermatozoides de varias especies susceptibles al choque térmico antes de la congelación ha conseguido mejorar su supervivencia tras la descongelación. En los protocolos convencionales de congelación de semen porcino se utilizan habitualmente diluyentes de congelación compuestos por yema de huevo y glicerol, sin embargo, puede que estos diluyentes de congelación convencionales no sean los más apropiados para congelar espermatozoides tratados con CLC. El objetivo de esta Tesis es evaluar la supervivencia a la congelación de los espermatozoides porcinos tratados con CLC o ciclodextrinas utilizando diluyentes de congelación convencionales, utilizando concentraciones alternativas tanto de yema de huevo como de glicerol o utilizando amidas en lugar de glicerol como crioprotectores Utilizando diluyentes convencionales, el tratamiento con 1mg de CLC o de metil-ß-ciclodextrina/120 millones de espermatozoides previamente a la congelación proporcionó una leve mejora de la integridad de la membrana plasmática espermática (+ 8%; P < 0,05) y ningún beneficio sobre la movilidad espermática (P > 0,05). Además, la respuesta al tratamiento con CLC fue similar independientemente de si los espermatozoides procedían de verracos buenos o malos congeladores (P > 0,05). Una reducción de la concentración de yema de huevo de un 20 a un 10% fue perjudicial para la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación, incluidos aquellos que habían sido tratados previamente con CLC (- 12% espermatozoides vivos; P < 0,05). Por otro lado, observamos que las concentraciones de glicerol utilizadas habitualmente (3%) no son las más apropiadas para congelar espermatozoides tratados con CLC (- 13 % viabilidad espermática comparando con las muestras control; P < 0,05), ya que éstos mostraron una mayor tolerancia (+ 13 % espermatozoides vivos; P < 0,05) que las muestras control a las concentraciones de glicerol más altas (5%). Con respecto a la eficacia de las amidas como crioprotectores para semen porcino, tres de las amidas (lactamida, acetamida y formamida) produjeron efectos perjudiciales durante su incubación con semen fresco (P < 0,05). El resto de amidas evaluadas (metilformamida, dimetilacetamida y dimetilformamida) mejoraron eficientemente la viabilidad espermática tras la congelación (+ 5 a 15 %; P < 0,05), sin embargo, afectaron negativamente tanto la movilidad espermática (- 11 a 16% móviles totales; P < 0,05) como la capacidad de fecundación in vitro (dimetilformamida: - 64 % en la tasa de penetración; P < 0,05), independientemente de si el semen fue tratado con CLC o no. Por otro lado, las muestras tratadas con CLC mostraron mejor capacidad de fecundación in vitro que las muestras control cuando se utilizó el glicerol como crioprotector (+ 2 espermatozoides penetrados/ovocito; P < 0,05). Los resultados obtenidos en esta Tesis sugieren que sería necesaria la adecuación de los protocolos de congelación convencionales para congelar semen porcino tratado con CLC con el propósito de alcanzar los claros beneficios obtenidos con dicho tratamiento cuando ha sido evaluado en otras especies sensibles al choque térmico. / [CA] Les inseminacions artificials en l'espècie porcina es realitzen habitualment amb semen refrigerat, a causa de les baixes taxes de fertilitat obtingudes amb el semen congelat-descongelat. La membrana de l'espermatozoide pateix importants danys quan és sotmesa a la fase de refredament des de la temperatura corporal fins a arribar als 5 ºC (xoc tèrmic), així com durant el procés de congelació i descongelació. L'augment del contingut de colesterol a les membranes dels espermatozoides de porc podria millorar la seva supervivència després de la descongelació, com succeeix en altres espècies sensibles al xoc tèrmic. Aquest increment en la quantitat de colesterol es pot realitzar fàcilment utilitzant ciclodextrines saturades de colesterol (CLC). El tractament amb CLC d'espermatozoides de diverses espècies susceptibles al xoc tèrmic abans de la congelació ha aconseguit millorar la seva supervivència després de la descongelació. En els protocols convencionals de congelació de semen porcí s'utilitzen habitualment diluents de congelació compostos per rovell d'ou i glicerol, però, pot ser que aquests diluents de congelació convencionals no siguin els més apropiats per congelar espermatozoides tractats amb CLC. L'objectiu d'aquesta Tesi és avaluar la supervivència a la congelació dels espermatozoides porcins tractats amb CLC o ciclodextrines utilitzant diluents de congelació convencionals, utilitzant concentracions alternatives tant de rovell d'ou com de glicerol o utilitzant amides en lloc de glicerol com crioprotectors Utilitzant diluents convencionals, el tractament amb 1 mg de CLC o de metil-ß-ciclodextrina / 120 milions d'espermatozoides prèviament a la congelació va proporcionar una lleu millora de la integritat de la membrana plasmàtica espermàtica (+ 8%; P <0,05) i cap benefici sobre la mobilitat espermàtica (P> 0,05). A més, la resposta al tractament amb CLC va ser similar independentment de si els espermatozoides procedien de verros bons o dolents congeladors (P> 0,05). Una reducció de la concentració de rovell d'ou d'un 20 a un 10% va ser perjudicial per a la supervivència dels espermatozoides després de la descongelació, inclosos aquells que havien estat tractats prèviament amb CLC (- el 12% espermatozoides vius; P <0,05) . D'altra banda, observem que les concentracions de glicerol utilitzades habitualment (3%) no són les més apropiades per congelar espermatozoides tractats amb CLC (- 13% viabilitat espermàtica comparant amb les mostres control; P <0,05), ja que aquests van mostrar una major tolerància (+ 13% espermatozoides vius; P <0,05) que les mostres control a les concentracions de glicerol més altes (5%). Pel que fa a l'eficàcia de les amides com crioprotectors per semen porcí, tres de les amides (lactamida, acetamida i formamida) van produir efectes perjudicials durant la seva incubació amb semen fresc (P <0,05). La resta de amides avaluades (metilformamida, dimetilacetamida i dimetilformamida) van millorar eficientment la viabilitat espermàtica després de la congelació (+ 5 a 15%, P <0,05), però, van afectar negativament tant la mobilitat espermàtica (- 11 a 16% mòbils totals; P <0,05) com la capacitat de fecundació in vitro (dimetilformamida: - el 64% en la taxa de penetració; P <0,05), independentment de si el semen va ser tractat amb CLC o no. D'altra banda, les mostres tractades amb CLC van mostrar millor capacitat de fecundació in vitro que les mostres control quan es va utilitzar el glicerol com crioprotector (+ 2 espermatozous penetrats / oòcit; P <0,05). Els resultats obtinguts en aquesta Tesi suggereixen que seria necessària l'adequació dels protocols de congelació convencionals per congelar semen porcí tractat amb CLC amb el propòsit d'assolir els clars beneficis obtinguts amb el tractament quan ha estat avaluat en altres espècies sensibles al xoc tèrmic. / Blanch Torres, E. (2015). Treating boar sperm with cholesterol-loaded cyclodextrins or cyclodextrins prior to cryopreservation: effects on post-thaw in vitro sperm quality of sperm cryopreserved in different freezing extenders [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58773 / Compendio

Tesis por compendio / [ES] Las tecnologías de reproducción asistida suponen un cambio drástico en el entorno natural del embrión, al no conseguir imitar las condiciones maternales óptimas, por lo que su aplicación implica consecuencias para el desarrollo del organismo. El objetivo general de esta tesis fue estudiar los efectos a largo plazo y transgeneracionales del estrés provocado durante un procedimiento de transferencia de embriones vitrificados, utilizando el conejo como modelo animal. En el Capítulo I, demostramos que la transferencia de mórulas tempranas o compactas resulta en tasas de supervivencia al parto > 70% en fresco y > 55% tras la vitrificación. La facilidad con la que se pueden realizar estos procedimientos, el elevado número de descendientes que podemos obtener y el corto ciclo de vida del conejo, fomentaron y facilitaron los siguientes estudios. En el Capítulo II, se compararon las diferencias en el desarrollo a corto y largo plazo entre los animales nacidos de embriones transferidos en fresco (FT) o tras su vitrificación (VT), utilizando una población concebida de forma natural (NC) como referencia. Tanto las tasas de supervivencia prenatal, como el rendimiento del crecimiento postnatal, se redujeron significativamente a medida que aumentó la manipulación embrionaria (NC<FT<VT). Además, comparamos el efecto de dos dispositivos de vitrificación, observando que, aunque el cryotop ejerció un efecto positivo sobre la supervivencia fetal, implicó mayores desviaciones fenotípicas (rendimiento de crecimiento y lactancia) postnatalmente que el dispositivo de la ministraw. Sin embargo, todas las progenies fueron sanas y fértiles. Por lo tanto, estos resultados demostraron la gran plasticidad del embrión de mamífero. El objetivo del Capítulo III fue evaluar los efectos del procedimiento de transferencia de embriones vitrificados (VET) en el desarrollo, comparando animales VT y NC. Así, detectamos que los animales VT presentaron alteraciones del peso al nacer y del patrón de crecimiento, viéndose los machos más afectados que las hembras. En la edad adulta, los machos VT presentaron un menor peso corporal, del hígado y del corazón. Un análisis proteómico hepático mostró cambios en relación con la fosforilación oxidativa y el metabolismo de los lípidos y el zinc. Mediante un análisis de sangre, se comprobó que el estado de salud entre los animales VT y NC fue comparable. En el Capítulo IV, se constituyó un modelo de tres generaciones (F1, F2 y F3) para evaluar los efectos transgeneracionales del VET. Los resultados mostraron que los efectos directos (F1) del VET fueron intergeneracionales (F2) y transgeneracionales (F3), ya que las progenies VT mostraron alteraciones en el crecimiento, peso corporal adulto y peso hepático. Un estudio molecular (transcriptómico y metabolómico) del tejido hepático reveló alteraciones en el metabolismo del zinc y los ácidos grasos insaturados a través de las generaciones, correlacionado con el fenotipo VT. No obstante, la fertilidad fue similar entre los machos VT y NC en cada generación, denotando un buen estado de salud. Finalmente, en el Capítulo V, mediante un enfoque comparativo multi-ómico (metabolómico, proteómico y epigenómico) del tejido hepático entre animales F3-VT y F3-NC, se demostró una alteración global de la fisiología molecular en los animales VT, relacionada principalmente con el metabolismo de los lípidos (ácidos grasos poliinsaturados, esteroides, hormonas esteroides...). Además, se detectaron amplios cambios en el epigenoma hepático, demostrando la herencia transgeneracional de los cambios moleculares inducidos por el VET en los embriones de la F1. El estado de salud fue similar entre los animales VT y NC. A lo largo de esta tesis se ha demostrado, por primera vez, que el VET induce una reprogramación embrionaria del desarrollo que persiste hasta la edad adulta y en las generaciones posteriores. Se cree que los mecanismos epigenéticos median esta plasticidad del desarrollo y su herencia transgeneracional, un hecho también avalado por nuestros resultados. Por lo tanto, los diferentes campos que actualmente se nutren de la criopreservación y transferencia de embriones, como la medicina y la producción animal, deberían evaluar cómo estos procedimientos pueden afectar a la eficiencia o la consecución de sus objetivos. / [EN] Assisted reproductive technologies involve the furthest change from the natural environment by failing to mimic optimal maternal conditions, and thereby entail consequences for late development. The general aim of this thesis was to study the long-term and transgenerational effects of the in vitro stressors occurring during a vitrified embryo transfer procedure on the rabbit model. In Chapter I, we prove that transferring early or compact morula leads to rates of survival at birth >70% in fresh and >55% after vitrification. The ease of performing both embryo cryopreservation and embryo transfer procedures, the high numbers of descendants that we are able to obtain and the short life cycle of the rabbit encouraged and facilitated the following studies. Chapter II was designed to compare the short and long-term developmental differences between animals born from fresh-transferred (FT) and vitrified-transferred (VT) embryos, using a naturally conceived (NC) population as control reference. Both prenatal survival rates and growth performance were significantly reduced as embryo manipulation was increased (NC<FT<VT). In addition, we compare the effect of two vitrification devices, noting that although cryotop exerted a positive effect on foetal survival, incurred higher phenotypic (growth and lactation performances) deviations postnatally than the straw device. Then, the choice of vitrification device is not trivial. However, all progenies were healthy and fertile. Therefore, these results demonstrated the high developmental plasticity of the mammalian embryo under different in vitro stressors. The aim of Chapter III was to evaluate the effects of the entire vitrified embryo transfer procedure (VET) on development, detecting that VT animals have modifications of the birth weight and growth pattern, but males were more affected than females. At adulthood, VT males were smaller and showed a significantly lower liver and heart weight than NC males. A comparative proteomic analysis showed changes in relation to oxidative phosphorylation and dysregulations in the zinc and lipid metabolism. However, a blood analysis (haematological and biochemical) revealed that health status was comparable between VT and NC animals. In Chapter IV, a three generation (F1, F2 and F3) model was constituted in order to assess the transgenerational effects of the VET. The results showed that direct (F1) effects of the VET were also intergenerational (F2) and transgenerational (F3), as VT progenies exhibited alterations in the growth velocity, adult body weight and liver weight in each generation. A comparative molecular (transcriptomic and metabolomics) study in the liver tissue unveiled alterations in the zinc and unsaturated fatty acid metabolism across the generations, which can be correlated with the VT phenotype. Nonetheless, similarities in the fertility between VT males and their NC counterparts in each generation denote that VET did not seem to impair the health status in the VT animals. Finally, in Chapter V, a comparative multi-omic (metabolomic, proteomic and epigenomic) approach was performed in the liver tissue between F3-VT and F3-NC animals. Both metabolomic and proteomic analyses showed global alteration in the hepatic metabolism of VT animals, mainly related to lipid metabolism (e.g. polyunsaturated fatty acids, steroids, steroid hormones¿). In addition, broad methylation changes were detected in the hepatic epigenome, involving genes related with lipid metabolism and apoptosis. These data demonstrated the transgenerational inheritance of the changes induced by VET in ancestors' embryos. The healthy status was similar between VT and NC animals. Through this thesis, it has been demonstrated for the first time that VET induces a developmental reprogramming that persists until adulthood and in subsequent generations, incurring long-term consequences for the phenotype and the molecular physiology of the resultant offspring. / [CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. [CA] Les tecnologies de reproducció assistida suposen un canvi dràstic en l'entorn natural de l'embrió, al no aconseguir imitar les condicions maternals òptimes, per la qual cosa la seua aplicació implica conseqüències per al desenvolupament de l'organisme. L'objectiu general d'esta tesi va ser estudiar els efectes a llarg termini i transgeneracionals de l'estrés provocat durant un procediment de transferència d'embrions vitrificats, utilitzant el conill com a model animal. En el Capítol I, demostrem que la transferència de mórules primerenques o compactes resulta en taxes de supervivència al part > 70% en fresc i > 55% després de la vitrificació. La facilitat amb què es poden realitzar aquests procediments, l'elevat nombre de descendents que podem obtindre i el curt cicle de vida del conill, van fomentar i van facilitar els següents estudis. En el Capítol II, es van comparar les diferències en el desenvolupament a curt i llarg termini entre els animals nascuts d'embrions transferits en fresc (FT) o després de la seua vitrificació (VT), utilitzant una població concebuda de forma natural (NC) com a referència. Tant les taxes de supervivència prenatal, com el rendiment del creixement postnatal, es van reduir significativament a mesura que va augmentar la manipulació embrionària (NC<FT<VT). A més, es va comparar l'efecte de dos dispositius de vitrificació, observant que, encara que el cryotop va exercir un efecte positiu sobre la supervivència fetal, va implicar majors desviacions fenotípiques (rendiment de creixement i lactància) postnatalment que el dispositiu de la ministraw. No obstant això, totes les progènies van ser sanes i fèrtils. Per tant, estos resultats van demostrar la gran plasticitat de l'embrió de mamífer. L'objectiu del Capítol III va ser avaluar els efectes del procediment de transferència d'embrions vitrificats (VET) en el desenvolupament, comparant animals VT i NC. Així, vam detectar que els animals VT van presentar alteracions del pes al nàixer i del patró de creixement, veient-se els mascles més afectats que les femelles. En l'edat adulta, els mascles VT van presentar un menor pes corporal, del fetge i del cor. Un anàlisi proteòmic hepàtic va mostrar canvis en relació amb la fosforilació oxidativa i el metabolisme dels lípids i el zinc. Per mitjà d'un anàlisi de sang, es va comprovar que l'estat de salut entre els animals VT i NC era comparable. En el Capítol IV, es va constituir un model de tres generacions (F1, F2 i F3) per a avaluar els efectes transgeneracionals del VET. Els resultats van mostrar que els efectes directes (F1) del VET van ser intergeneracionals (F2) i transgeneracionals (F3), ja que les progènies VT van mostrar alteracions en el creixement, pes corporal adult i pes hepàtic. Un estudi molecular (transcriptòmic i metabolòmic) del teixit hepàtic va revelar alteracions en el metabolisme del zinc i els àcids grassos insaturats a través de les generacions, correlacionat amb el fenotip VT. No obstant això, la fertilitat va ser semblant entre els mascles VT i NC en cada generació, denotant un bon estat de salut. Finalment, en el Capítol V, per mitjà d'un enfocament comparatiu multi-òmic (metabolòmic, proteòmic i epigenòmic) del teixit hepàtic entre animals F3-VT i F3-NC, es va demostrar una alteració global de la fisiologia molecular en els animals VT, relacionada principalment amb el metabolisme dels lípids (àcids grassos poliinsaturats, esteroides, hormones esteroides...) . A més, es van detectar amplis canvis en l'epigenoma, demostrant l'herència transgeneracional dels canvis moleculars induïts pel VET en els embrions de la F1. L'estat de salut va ser semblant entre els animals VT i NC. Al llarg d'esta tesi s'ha demostrat, per primera vegada, que el VET indueix una reprogramació embrionària del desenvolupament que persisteix fins a l'edat adulta i en les generacions posteriors. Es creu que els mecanismes epigenètics medien aquesta plasticitat del desenvolupament i la seua herència transgeneracional, un fet també avalat pels nostres resultats. Per tant, els diferents camps que actualment es nodreixen de la criopreservació i transferència d'embrions, com la medicina i la producció animal, haurien d'avaluar com aquests procediments poden afectar l'eficiència o la consecució dels seus objectius. / García Domínguez, X. (2020). Developmental plasticity and transgenerational reprogramming following vitrified embryo transfer in Oryctolagus cuniculus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149562 / Compendio

No / The vitrification solutions used in the cryopreservation of biological samples aim to minimize the deleterious formation of ice by dehydrating cells and promoting the formation of the glassy state of water. They contain a mixture of different cryoprotective agents (CPAs) in water, typically polyhydroxylated alcohols and/or dimethyl sulfoxide (DMSO), which can damage cell membranes. Molecular dynamics simulations have been used to investigate the behavior of pure DPPC, pure DOPC, and mixed DOPC-β-sitosterol bilayers solvated in a vitrification solution containing glycerol, ethylene glycol, and DMSO at concentrations that approximate the widely used plant vitrification solution 2. As in the case of solutions containing a single CPA, the vitrification solution causes the bilayer to thin and become disordered, and pores form in the case of some bilayers. Importantly, the degree of thinning is, however, substantially reduced compared to solutions of DMSO containing the same total CPA concentration. The reduction in the damage done to the bilayers is a result of the ability of the polyhydroxylated species (especially glycerol) to form hydrogen bonds to the lipid and sterol molecules of the bilayer. A decrease in the amount of DMSO in the vitrification solution with a corresponding increase in the amount of glycerol or ethylene glycol diminishes further its damaging effect due to increased hydrogen bonding of the polyol species to the bilayer headgroups. These findings rationalize, to our knowledge for the first time, the synergistic effects of combining different CPAs, and form the basis for the optimization of vitrification solutions. / Australian Research Council linkage grant No. LP0884027; Alcoa Australia Ltd.; BHP Billiton Worsley Alumina Pty. Ltd.

Tesis por compendio / [ES] En las últimas décadas, la anguila europea Anguilla anguila ha sufrido una disminución drástica de su población lo que ha llevado su inclusión como especie en peligro crítico en la lista roja UICN. Esta situación, junto con la gran importancia comercial de esta especie, evidencia la necesidad de tomar acciones como el desarrollo de la reproducción en cautividad y el control de la pesca. Una de las herramientas más interesantes para su uso en la biología de la conservación es la criopreservación de espermatozoides, que presenta varias ventajas para esta especie, incluyendo la sincronización de gametos, la selección de líneas genéticas o su uso para la creación de un criobanco. Sin embargo, el desarrollo de protocolos de criopreservación necesariamente requieren esperma de buena calidad. Además, se necesita un método preciso para evaluar la calidad del esperma tanto antes como después de la criopreservación. Sobre esta última cuestión, la motilidad de los espermatozoides de los peces se considera uno de los mejores biomarcadores para la evaluación de la calidad de los espermatozoides en los peces, y se puede estudiar de forma subjetiva u objetiva utilizando sistemas "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primero, se realizó un experimento para evaluar la precisión y la exactitud de ambos métodos para estudiar la motilidad del esperma: el método subjetivo y la técnica objetiva que utiliza el sistema CASA-Mot. Además, se probó si el grado de experiencia de los técnicos en el caso del método subjetivo tiene un efecto en la precisión de la estimación de la motilidad y, por lo tanto, hay una influencia del personal del laboratorio en la evaluación de la motilidad del esperma. Aquí concluimos que tanto el método como la experiencia técnica eran factores clave para evaluar con precisión la motilidad del esperma en la anguila europea, por lo que se requiere el uso de CASA-Mot junto con material calificado para obtener resultados fehacientes. En segundo lugar, se evaluaron métodos alternativos para la maduración de los machos de anguila europeos probando dos tratamientos hormonales diferentes: OVI, una gonadotropina recombinante; y VET, una gonadotropina purificada a partir de orina femenina. Después de elegir el mejor tratamiento hormonal de los dos, se evaluó el efecto de tres dosis diferentes con el objetivo de obtener el mayor rendimiento al menor coste. Los resultados de este experimento apuntaron a OVI como el mejor tratamiento hormonal en una dosis semanal de 1.5 UI/g de pez, que proporciona la mayor rentabilidad, obteniendo esperma de alta calidad a menor precio. En un tercer experimento, y utilizando los conocimientos adquiridos en los dos primeros experimentos, se realizaron una serie de experimentos para estandarizar los protocolos de criopreservación de esperma de anguila europea disponibles en ese momento (utilizando DMSO o metanol como crioprotector). Los resultados apuntaron al protocolo que utiliza el metanol como el mejor de ellos dos en términos de motilidad, velocidad y viabilidad de los espermatozoides y la preservación de la integridad del ADN. Siguiendo este último método estandarizado, se realizó un cuarto experimento con el objetivo de mejorar el protocolo en términos de volumen (volúmenes de esperma más grandes) y de calidad espermática. Además, se desarrolló un protocolo simple de almacenamiento a corto plazo para complementar las opciones de preservar el esperma durante diferentes períodos de tiempo. De todas las condiciones de almacenamiento probadas, las diluciones 1/50 a 4 ºC mostraron los mejores resultados, manteniendo la motilidad en comparación con el control durante 3 días, y manteniendo cierta motilidad espermática (12%) después de 7 días. A partir del experimento de criopreservación, fue posible aumentar los volúmenes a 2 y 5 mL sin perder la calidad del esperma en comparación con volúmenes más pequeños, y mejorando las mot / [CA] En les últimes dècades, l'anguila europea Anguilla anguila ha sofert una disminució dràstica de la seva població el que ha portat la seva inclusió com a espècie en perill crític en la llista vermella UICN. Aquesta situació, juntament amb la gran importància comercial d'aquesta espècie, evidencia la necessitat de prendre accions com el desenvolupament de la reproducció en captivitat i el control de la pesca. Una de les eines més interessants per al seu ús en la biologia de la conservació és la criopreservació d'espermatozoides, que presenta diversos avantatges per a aquesta espècie, incloent la sincronització de gàmetes, la selecció de línies genètiques o el seu ús per a la creació d'un criobanc. No obstant això, el desenvolupament de protocols de criopreservació necessàriament requereixen esperma de bona qualitat. A més, es necessita un mètode precís per avaluar la qualitat de l'esperma tant abans com després de la criopreservació. Sobre aquesta última qüestió, la motilitat dels espermatozoides dels peixos es considera un dels millors biomarcadors per a l'avaluació de la qualitat dels espermatozoides en els peixos, i es pot estudiar de forma subjectiva o objectiva utilitzant sistemes "computer assisted sperm analysis" (CASA-Mot). Primer, es va realitzar un experiment per avaluar la precisió i l'exactitud de tots dos mètodes per estudiar la motilitat de l'esperma: el mètode subjectiu i la tècnica objectiva que utilitza el sistema CASA-Mot. A més, es va provar si el grau d'experiència dels tècnics en el cas del mètode subjectiu té un efecte en la precisió de l'estimació de la motilitat i, per tant, hi ha una influència del personal del laboratori en l'avaluació de la motilitat del esperma. Vam concloure que tant el mètode com l'experiència tècnica eren factors clau per avaluar amb precisió la motilitat de l'esperma en l'anguila europea, de manera que es requereix l'ús de CASA-Mot juntament amb material qualificat per obtenir resultats fefaents. En segon lloc, es van avaluar mètodes alternatius per a la maduració dels mascles d'anguila europeus provant dos tractaments hormonals diferents: OVI, un gonadotropina recombinant; i VET, un gonadotropina purificada a partir d'orina femenina. Després de triar el millor tractament hormonal dels dos, es va avaluar l'efecte de tres dosis diferents amb l'objectiu d'obtenir el major rendiment al menor cost. Els resultats d'aquest experiment van apuntar a OVI com el millor tractament hormonal en una dosi setmanal de 1.5 UI/g de peix, que proporciona la major rendibilitat, obtenint esperma d'alta qualitat a un preu millor. En un tercer experiment, i utilitzant els coneixements adquirits en els dos primers experiments, es van realitzar una sèrie d'experiments per estandarditzar els protocols de criopreservació d'esperma d'anguila europea disponibles en aquest moment (utilitzant DMSO o metanol com crioprotector). Els resultats van apuntar al protocol que utilitza el metanol com el millor d'ells dos en termes de motilitat, velocitat i viabilitat dels espermatozoides i la preservació de la integritat de l'ADN. Seguint aquest últim mètode estandarditzat, es va realitzar un quart experiment amb l'objectiu de millorar el protocol en termes de volum (volums d'esperma més grans) i de qualitat espermàtica. A més, es va desenvolupar un protocol simple d'emmagatzematge a curt termini per complementar les opcions de preservar l'esperma durant diferents períodes de temps. De totes les condicions d'emmagatzematge provades, les dilucions 1/50 a 4ºC van mostrar els millors resultats, mantenint la motilitat en comparació amb el control durant 3 dies, i mantenint certa motilitat espermàtica (12%) després de 7 dies. A partir de l'experiment de criopreservació, va ser possible augmentar els volums a 2 i 5 ml sense perdre la qualitat de l'esperma en comparació amb volums més petits. / [EN] In the last decades, the European eel Anguilla anguilla has suffered a drastic decrease in the recruitment in most areas of their distribution range, leading the species to be included as critically endangered in the IUCN list. This situation, together with the high commercial importance of the species, evidence the need of taking actions such as development of reproduction in captivity and control of fisheries based on the complexity of their life cycle. One of the most interesting tools for its use in conservation biology is the sperm cryopreservation, which presents several advantages for this species such as the synchronization of gametes, selection of genetic lines or cryobanking. However, the development of cryopreservation protocols necessarily requires good quality sperm, and it is also needed an accurate method to assess sperm quality both pre- and post-cryopreservation. On this last matter, fish sperm motility is considered one of the best quality biomarkers for sperm quality assessment in fish, and it can be evaluated subjectively or objectively using computer assisted sperm analysis (CASA-Mot) systems. First, an experiment was conducted to evaluate the precision and accuracy of both methods for assessing sperm motility: the subjective method and the objective technique using CASA-Mot system. Moreover, it was tested whether the degree of expertise of the technicians in the case of the subjective method, has an effect on the accuracy of the motility estimation, and therefore there is an influence of the laboratory staff on the sperm motility assessment. Here we concluded that both the method and the technician expertise were key factors in order to accurately assess sperm motility in European eel, so the use of CASA-Mot together with qualified stuff is required to obtain reliable results. Secondly, and alternative methods for European eel males maturation was evaluated by testing two different hormonal treatments: OVI, a recombinant ¿-choriogonadotropin; and VET, a human chorionic gonadotropin purified from female urine. After choosing the best hormonal treatment, the effect of three different doses was evaluated aiming for best performance and lowest cost on the treatment. The results of this experiment pointed at OVI as the best hormonal treatment in terms on sperm quantity and quality in most of the weeks of treatment, and at a weekly dose of 1.5 IU/g fish, which also provide the greatest profitability, obtaining high quality sperm at a lower price. In a third experiment, and using the knowledge acquired in the two first experiments (using the OVI hormonal treatment and CASA-Mot to assess sperm quality), a series of experiments were conducted to standardize the European eel sperm cryopreservation protocols available at the moment (using DMSO or methanol as cryoprotectant). The results indicated that the protocol using methanol was the best of them two in terms of sperm motility and velocity, sperm viability and preservation of DNA integrity. Following this last standardized method, a fourth experiment was conducted aiming for improvement of the protocol in terms of volume (larger volumes) and sperm quality outcome. Moreover, a simple protocol for short-term storage was developed to complement the options to preserve sperm for different time periods. Of all the tested storing conditions, 1/50 dilutions at 4 ºC showed the best results, maintaining the motility compared to control for 3 days, and some sperm motility (12%) was still observed after 7 days. From the cryopreservation experiment, it was possible to scale up the cryopreserved volumes to 2 and 5 mL without losing sperm quality compared to lower volumes. Moreover, the protocol was further improved by supplementing the protocol with egg yolk as an additive, obtaining the highest cryopreserved sperm motilities (over 50%) ever reported in European eel. / Herranz Jusdado, JG. (2019). Improvement of techniques for sperm evaluation and cryobanking in European eel [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/130846 / Compendio

In an attempt to expand the knowledge of the diversity of algal taxa that are capable of successful recovery after freezing to and thawing from -196°C, 365 algal strains representing 13 algal classes were studied using various cryoprotectants at several concentrations. A cryopreservation protocol involving culturing the algae under low light (17-22 μE m⁻² s⁻¹) on semisolid (I % agar) media, controlled cooling at 1°C min⁻¹, rapid thawing, and the return of cultures to agar media was developed. This protocol produced successful recovery of >77% (283) of the algal strains tested. Of the 283 successfully cryopreserved strains comprising 240 species (68 genera), >220 species (34 genera) were cryopreserved for the first time. In addition, preliminary data suggest that some relationships exist among proposed systematic evolutionary lines, environmental preferences, cryoprotectants, and the organism's cryopreservability. / Master of Science

The increasing dependence on amphibian captive breeding programs to support at-risk populations has led to growth in the application of assisted reproductive technologies (ART) to aid with the management of decreasing population density and genetic diversity. Already the integration of ART within these programs has led to monumental successes and shows great promise as a means to augment amphibian breeding efforts when natural breeding has low success. The focus of this project was to continue the optimization of ART to aid in making these technologies more widely applicable. Specific objectives include developing a framework that can be used to standardize follicular grading of oocytes through ultrasound assessments, demonstrating how advantageous routine sonography assessments are in providing insight into the female reproductive cycle in captive amphibians, and determining the differences in offspring growth and development between Ambystoma tigrinum larvae produced through in-vitro fertilization with either freshly collected or frozen-thawed sperm.

Includes bibliographical references (leaves 232-257). / xv, 257 leaves : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Aims to determine if the compatible solutes (proline, glycine betaine, and trehalose), the epididymal compounds (taurine, hypotaurine and inositol) or the antioxidants (carnosine and ascorbic acid) in tris-citrate based diluents could improve the post-thaw survival and/or fertility of ram spermatazoa. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Animal Science, 1996?

Glochidia (larvae) of freshwater mussels are obligate parasites which attach to and become encysted in the gills or fins of host fish species. The immune responses of the host fish to the parasite affects the susceptibility of the fish to glochidia of different mussels. The immune response provides an opportunity to identify which fish species are hosts. The number and variety of mussels in rivers and lakes has sharply declined since the last century due to various anthropogenic factors, and some mussels species are facing extinction. It is an urgent task to preserve these vanishing mussels, or extinction will be inevitable. An attempt was made to develop an assay, using the immunological response to glochidia, to screen fish species for appropriate hosts. This would facilitate the production and rearing of juveniles. In order to design these assays, reagents such as anti-immunoglobulins which can react with antibodies from many different fish species have to be developed. This work was carried out to develop such reagents. Host and non-host fish were immunized with killed bacteria (Brucella abortus) to study their humoral immune response to an antigen. All fish were able to respond well, as measured by agglutination and Western Blot assays. Antibodies produced by the Brucella injections were used to stimulate anti-fish immunoglobulins in goats, and the antisera were tested for their ability to recognize immunoglobulins from different host fish species. The specificities of these reactions were compared to the reactivity of Protein A. Goat antisera were able to cross-react with different fish antibodies, but it was found that Protein A was a more suitable reagent. Protein A is seemingly suitable to identify the host-fish species and could be used as a reagent for the serological diagnosis of various fish diseases. / Master of Science