Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Juliana Peloi Vides / Banca:Heito Flávio Ferrari / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Cáris Maroni Nunes / Resumo: O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. "Nested" PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolate s in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., f ollowed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in d og samples was 10.4% (38/367). The real - time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis . The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis . A higher positivity was observed in pup pie s and kittens when compared to adult animals . The analytical sensitivity of real - time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium . We c oncluded that dogs and cats n of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real - time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs / Doutor

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Vanessa Silvestre Ferreira de Oliveira.pdf: 1341350 bytes, checksum: 9ce3345b7f150b232b983b427448e976 (MD5) Previous issue date: 2011-03-16 / Este trabalho teve como objetivos identificar os protozoários encontrados em fezes de cães, observar a ocorrência da infecção por Neospora caninum e Toxoplasma gondii em cães pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), desenvolver e validar técnicas de ELISA para o diagnóstico sorológico de N. caninum em cães, determinar a utilidade do Western Blot para esse diagnóstico e observar a ocorrência de DNA de N. caninum, T. gondii e Hammondia heydorni em tecido cerebral de cães. Para isso, foram colhidas amostras de cérebro e sangue de 251 cães, e fezes de 106 cães, provenientes do Centro de Zoonoses de Goiânia, Goiás. Foram utilizados oito soros de infecção experimental por N. caninum e quatro por T. gondii para comprovação dos resultados sorológicos. As amostras de fezes foram concentradas pelo método de Teleman seguido da flutuação com solução de Sheather, para visualização dos oocistos. Foi realizada a extração de DNA de todas as amostras, posteriormente analisadas por nested-PCR específicas para detecção de DNA de N. caninum, H. heydorni, T. gondii, Cryptosporidium spp. e Giardia spp. Uma nested-PCR foi ainda realizada nas amostras em que foram visualizados oocistos menores de 20 µm, para a detecção de DNA de coccídios e posterior seqüenciamento, para correta identificação dos mesmos. A técnica de RIFI foi realizada em todas as amostras de sangue, e técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 de N. caninum. Para a detecção de DNA dos parasitos nos cérebros, estes foram divididos em três partes, e de cada parte foi realizada a extração de DNA. Após a extração, foram realizadas nested-PCR específicas para cada parasito. Nas fezes dos cães, foram encontradas doze amostras contendo oocistos. Em seis, os oocistos eram maiores que 20 µm, e foram identificados como de Cystoisospora canis, e nas outras seis, oocistos menores que 20 µm foram visualizados e identificados como sendo quatro de H. heydorni, um de Cystoisospora spp. e uma amostra apresentava DNA tanto de H. heydorni quanto de Cystoisospora spp. DNA de C. canis foi identificado em quatro amostras, uma amostra foi identificada como G. duodenalis genótipo C e quatro como G. duodenalis genótipo D. Nenhuma amostra de fezes foi positiva para N. caninum e T. gondii, e quatro foram positivas para H. heydorni na PCR específica para este parasito. Nos cérebros analisados, foram encontradas seis amostras (2,4%) positivas a N. caninum e 23 amostras (9,1%) foram positivas a T. gondii. Nenhuma amostra foi positiva a H. heydorni. Anticorpos anti-N. caninum foram encontrados em 18,32% dos cães analisados, e 56,57% dos cães apresentaram sorologia positiva a T. gondii pela técnica de RIFI. Técnicas de ELISA foram padronizadas, utilizando-se extrato solúvel de taquizoítos e as proteínas recombinantes rNcGRA7, rNcSAG4, rNcBSR4 e rNcSRS9 de N. caninum. Foram encontrados valores de sensibilidade e especificidade menores que 84%, além do reconhecimento das proteínas recombinantes pelos dois parasitos, nos soros de infecções naturais e experimentais. Uma baixa concordância entre as técnicas foi observada, com valores de Kappa inferiores a 0,4. Os resultados encontrados indicam que N. caninum está menos presente em fezes de cães, enquanto H. heydorni é mais facilmente encontrada. As amostras que continham Cryptosporidium e Giardia foram identificadas como espécies-específicas. A pesquisa de DNA de parasitos em órgãos de cães pode ser utilizada como uma ferramenta para o diagnóstico post-mortem de infecções por protozoários, porém as técnicas de PCR podem apresentar baixa sensibilidade devido à pequena quantidade de tecido utilizado. Os resultados encontrados no WB indicam não haver um padrão de reconhecimento das proteínas imunodominantes, e que as técnicas sorológicas na neosporose canina têm limitações, devido aos baixos títulos encontrados e à reação cruzada com T. gondii, além da alta prevalência da infecção por T. gondii em cães, e presença de infecções mistas.