Nos últimos anos a incidência da clorose letal, causada pelo Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) vem aumentando em plantios de cucurbitáceas e preocupando produtores pelos danos causados na produção. Devido às poucas informações sobre esta virose em cucurbitáceas, somente algumas medidas profiláticas de controle têm sido recomendadas para minimizar a incidência da doença. A resistência genética, seja da forma tradicional ou por meio da transgenia, é considerada a melhor e mais eficiente forma de controle de viroses em geral. Sendo assim essa proposta de pesquisa visou caracterizar a resistência da moranga Exposição ao ZLCV, para gerar informações que auxiliem programas de melhoramento vegetal e também estudar a possível interferência do Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) e do Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) na resistência das plantas ao ZLCV. A infecção pelo ZLCV e sua movimentação na planta foram avaliadas por PTA-ELISA, RT-PCR, impressão de tecido (Tissue printing) e teste de recuperação biológica. Os resultados mostraram que o vírus pôde ser detectado no local da infecção, mas não foi detectado além do ponto de inoculação. Estes resultados sugerem que a moranga Exposição apresenta uma resistência à invasão sistêmica de longa distância ao ZLCV. Para verificar a possível interferência dos potyvirus na resistência da moranga Exposição ao ZLCV foram conduzidos experimentos em casa de vegetação, onde os vírus foram inoculados em mistura nas plantas teste e experimentos em campo onde os potyvirus foram pré-inoculados e a infecção pelo ZLCV ocorreu naturalmente pelo vetor. Em nenhum dos casos foi verificada interferência dos potyvirus na resistência das plantas de moranga ao ZLCV. / The occurrence of lethal chlorosis in the past years, caused by Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), has become common in cucurbit crops, which concerns producers in terms of yield losses. Due to the lack of information about this virus disease, only few prophylactic precautions have been recommended in order to minimize the occurrence of the disease. The genetic resistance, either via conventional means or via transgenesis, is considered the most efficient way so far to control virus diseases. With that in mind, the present work aimed to characterize the genetic resistance of winter squash Exposição against ZLCV in order to generate important information for cucurbit breeding programs, as well as to investigate the potential effect of Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) in winter squash Exposição resistance against ZLCV. The ZLCV infection and its systemic mobility inside the plant were evaluated by PTA-ELISA, RT-PCR, tissue printing and biological recovery test. The results have shown that ZLCV can be detected at the infection spot, but was not detected beyond the inoculation point. These results suggest that winter squah Exposição is resistant to long-distance systemic invasion of ZLCV. In order to verify the potential interference of the potyviruses on the winter squash Exposição resistance against ZLCV, experiments were carried out into greenhouse, where the viruses were inoculated together into testing plants, and also in field trials, where the potyviruses were pre-inoculated and the infection by ZLCV naturally occurred by the vector. Interference of potyviruses on the winter squash resistance was not observed via the investigation methods presented.

O diagnóstico da malária tem como teste de referência a gota espessa, porém é consenso que é preciso adotar alternativas em situações específicas, com técnicas mais sensíveis e que possam ser aplicadas no processamento de grande número de amostras, como estudos clínicos, epidemiológicos ou triagem de doadores em bancos de sangue. Com a finalidade de formar uma plataforma de diagnóstico para malária em amostras agrupadas em pools, foi realizada análise comparativa da PCR em tempo real, a nested PCR e um teste rápido específico para detecção de anticorpos contra P.falciparum e P. vivax, com intuito de reduzir o número de ensaios, com custo relativamente baixo. Foram utilizadas 50 amostras de sangue positivas para Plasmodium, de acordo com a prevalência das espécies no Brasil (P. vivax 75%, P. falciparum 22% e P. malariae 3%), com diagnóstico realizado pelo método padrão ouro. Adicionalmente, 48 amostras de sangue negativas para Plasmodium foram selecionadas para controle negativo e confecção de 15 pools, contendo amostras positivas e negativas. Quatro das amostras negativas para malária eram positivas para outras doenças. Tanto as amostras positivas como as negativas foram submetidas individualmente aos ensaios de PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico SD Bioline Pf/Pv para detecção de malária. Um teste de PCR convencional foi incluído a fim de testar a qualidade do DNA, mediante amplificação de uma sequência do gene humano da -globina como controle interno. Posteriormente as amostras foram analisadas em pools pelos ensaios moleculares e sorológicos. Nos testes individuais, 45/49 amostras foram positivas para Plasmodium pela PCR em tempo real, com Sensibilidade de 91,84%, e Especificidade (48/48) de 100,00%; 46/49 amostras detectaram Plasmodium pela nested PCR, com Sensibilidade de 93,88%, e Especificidade (12/12) de 100,00%; 32/46 amostras foram reagentes no teste sorológico SD Bioline Pf/Pv, com Sensibilidade de 69,56%, e Especificidade (10/10) de 100,00%. Nos ensaios com amostras agrupadas, 13 pools (86,66%) foram positivos pela PCR em tempo real; a nested PCR também obteve positividade nos mesmos 13 pools (86,66%). O teste imunocromatográfico SD Bioline apresentou Sensibilidade de 73,33% considerando o diagnóstico pela gota espessa. Tanto a PCR em tempo real como a nested PCR apresentaram boa sensibilidade e especificidade, seja nas amostras clínicas analisadas individualmente ou em pools, diferentemente do teste sorológico SD Bioline. Ambas as metodologias moleculares apresentaram desempenho semelhante, com bons resultados de acurácia e indicadores de validade, como Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Negativo. Considerando-se as vantagens inerentes à PCR em tempo real, como rapidez, processamento em sistemas fechados e dispensa de eletroforese após amplificação, este método deve ser indicado como primeira escolha para diagnóstico de malária em grande número de amostras, seguido da nested PCR para diferenciação de espécies de Plasmodium. O teste sorológico, que é específico para detecção de anticorpos contra P. vivax e P. falciparum, pode ser indicado apenas como método complementar no diagnóstico de malária / The diagnosis of malaria is based on the thick blood film as reference test, but the consensus is that it is necessary to adopt alternatives in specific situations, with more sensitive techniques that could be applied in the processing of large numbers of samples in clinical and epidemiological studies or in the screening of donors at blood banks. The purpose of this study was to analyze and compare the real-time PCR, the nested PCR and a rapid test for detection of specific antibodies against Plasmodium falciparum and P. vivax, to build a platform for malaria diagnosis in pooled samples, reducing the number of tests and providing relatively low cost. For the tests analysis, we used 50 blood samples positive for Plasmodium, according to the prevalence of the species in Brazil (75% P. vivax, 22% P. falciparum and 3% P. malariae), with diagnosis performed by the gold standard method. In addition, 48 blood samples negative for Plasmodium were selected for negative control and production of 15 pools containing positive and negative samples. Four of the malaria negative samples were positive for other diseases. Both the positive and negative samples were submitted to individual testing of real-time PCR, nested PCR and immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv for the detection of malaria. To check the quality of DNA, a conventional PCR was included, with amplification of a sequence of the -globin human gene as internal control. Subsequently the samples were analyzed in pools by molecular and serological tests. In individual tests, 45/49 samples were positive for Plasmodium by real time PCR, with sensitivity of 91.84% and (48/48) 100.00% specificity, 46/49 samples detected Plasmodium by nested PCR, with sensitivity of 93.88% and (12/12) specificity 100.00%; 32/46 samples were positive on serological test SD Bioline, with sensitivity of 69.56% and (10/10) 100.00% specificity. In tests with pooled samples, 13 pools (86.66%) were positive by real time PCR; the nested PCR also had positive results in the same 13 pools (86.66%). Immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv showed sensitivity of 73.33% compared with blood smear. Both real-time PCR and the nested PCR showed good sensitivity and specificity in samples analyzed individually and in pools, unlike the SD Bioline test. Both molecular methods showed similar performance, with good results in accuracy and validity indicators, such as sensitivity, specificity, positive and negative predictive values. Considering the advantages inherent in real-time PCR, a fast test that is processed in closed systems without post-amplification handling, this method should be indicated as first choice for diagnosis of malaria in large numbers of samples, followed by nested PCR for species determination. Serological test, that is specific for antibodies against P. vivax and P. falciparum, could be used as a supplementary method for diagnosis of malaria

Setenta e seis amostras intestinais de lotes de perus apresentando ou não sinais clínicos de enterite foram avaliadas quanto à presença de adenovírus grupo 1 (TAV), vírus da enterite hemorrágica dos perus (HEV), astrovírus tipo 1 e 2 (TAstV-1 e TAstV-2), coronavírus dos perus (TCoV), reovírus, rotavírus e vírus da nefrite aviária (ANV) através da reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos foram analisados quanto à região geográfica de origem das amostras, idade das aves e presença de sinais clínicos nos lotes. Foi detectada elevada positividade das amostras para pelo menos um vírus (93,4%), e grande número de amostras com associações de mais de um vírus (69,7%). Santa Catarina foi o estado com maior média de número de vírus detectados em associação nas amostras (3,14) e Goiás o estado com menor média (1,73). As amostras provenientes de aves em fase inicial de criação (1 a 4 semanas de idade) tiveram média de 3,20 vírus detectados por amostra, e 85% de detecção de TAstV-1 e TCoV (os mais frequentes), enquanto que na fase de terminação (5 a 18 semanas) foi observada menor média de vírus associados nas amostras (2,41), e os agentes mais detectados foram TAstV-1 (57,1%) e rotavírus (51,8%), no entanto, todos os vírus apresentaram menor frequência na fase de terminação do que na inicial, com exceção do TAV e reovírus. Quando os sinais clínicos estavam presentes todos os vírus foram detectados em maior percentual (sendo TAstV-1, TAstV-2 e TCoV os mais frequentes) do que nos lotes sem sinais clínicos, onde TAstV-1 e rotavírus foram os mais frequentes. Estudos posteriores são necessários para a compreensão do papel de cada vírus no desenvolvimento de enterites. / Intestinal samples from seventy-six Brazilian turkey flocks affected or not with intestinal disorders were evaluated for the presence of Adenovirus group 1 (TAV), hemorrhagic enteritis virus (HEV), Astrovirus type 1 and 2 (TAstV-1 e TAstV-2), turkey Coronavirus (TCoV), Reovirus, Rotavirus and avian nephritis virus (ANV) using the polimerase chain reaction. Geographic location, age of the flocks and the presence of clinical signs were analyzed in order to find a relationship with the viral detection. A high frequency of positive samples for at least one virus was observed (93,4%) and 69,7% of the samples showed an association of more than one agent. The highest average number of viruses detected in association (3,14) was found in the state of Santa Catarina and Goias showed the lowest average (1,73). An average of 3,20 viruses per sample was detected in poults in initial phase of the production cycle (1 to 4 weeks of age), and TAstV-1 and TCoV were detected in 85% of the samples (the most frequent viruses), while the terminanting phase (5 to 18 weeks) showed lower average number of viruses in association (2,41), and the most frequent viruses were TAstV-1 (57,1%) and rotavírus (51,8%). However, all the viruses were detected more frequently in the initial phase rather than in the terminating phase, in exception of TAV and reoviruses. A higher detection of the viruses was observed in poults with clinical signs (as TAstV-1, TAstV-2 and TCoV were the most frequent) compared to normal birds (as TAstV-1 and rotavirus were the most frequent). Furher researches should focus on the description and comprehension of the role of each virus, and the different combinations of viruses, in the development of enteric disease.

Setenta e seis amostras intestinais de lotes de perus apresentando ou não sinais clínicos de enterite foram avaliadas quanto à presença de adenovírus grupo 1 (TAV), vírus da enterite hemorrágica dos perus (HEV), astrovírus tipo 1 e 2 (TAstV-1 e TAstV-2), coronavírus dos perus (TCoV), reovírus, rotavírus e vírus da nefrite aviária (ANV) através da reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos foram analisados quanto à região geográfica de origem das amostras, idade das aves e presença de sinais clínicos nos lotes. Foi detectada elevada positividade das amostras para pelo menos um vírus (93,4%), e grande número de amostras com associações de mais de um vírus (69,7%). Santa Catarina foi o estado com maior média de número de vírus detectados em associação nas amostras (3,14) e Goiás o estado com menor média (1,73). As amostras provenientes de aves em fase inicial de criação (1 a 4 semanas de idade) tiveram média de 3,20 vírus detectados por amostra, e 85% de detecção de TAstV-1 e TCoV (os mais frequentes), enquanto que na fase de terminação (5 a 18 semanas) foi observada menor média de vírus associados nas amostras (2,41), e os agentes mais detectados foram TAstV-1 (57,1%) e rotavírus (51,8%), no entanto, todos os vírus apresentaram menor frequência na fase de terminação do que na inicial, com exceção do TAV e reovírus. Quando os sinais clínicos estavam presentes todos os vírus foram detectados em maior percentual (sendo TAstV-1, TAstV-2 e TCoV os mais frequentes) do que nos lotes sem sinais clínicos, onde TAstV-1 e rotavírus foram os mais frequentes. Estudos posteriores são necessários para a compreensão do papel de cada vírus no desenvolvimento de enterites. / Intestinal samples from seventy-six Brazilian turkey flocks affected or not with intestinal disorders were evaluated for the presence of Adenovirus group 1 (TAV), hemorrhagic enteritis virus (HEV), Astrovirus type 1 and 2 (TAstV-1 e TAstV-2), turkey Coronavirus (TCoV), Reovirus, Rotavirus and avian nephritis virus (ANV) using the polimerase chain reaction. Geographic location, age of the flocks and the presence of clinical signs were analyzed in order to find a relationship with the viral detection. A high frequency of positive samples for at least one virus was observed (93,4%) and 69,7% of the samples showed an association of more than one agent. The highest average number of viruses detected in association (3,14) was found in the state of Santa Catarina and Goias showed the lowest average (1,73). An average of 3,20 viruses per sample was detected in poults in initial phase of the production cycle (1 to 4 weeks of age), and TAstV-1 and TCoV were detected in 85% of the samples (the most frequent viruses), while the terminanting phase (5 to 18 weeks) showed lower average number of viruses in association (2,41), and the most frequent viruses were TAstV-1 (57,1%) and rotavírus (51,8%). However, all the viruses were detected more frequently in the initial phase rather than in the terminating phase, in exception of TAV and reoviruses. A higher detection of the viruses was observed in poults with clinical signs (as TAstV-1, TAstV-2 and TCoV were the most frequent) compared to normal birds (as TAstV-1 and rotavirus were the most frequent). Furher researches should focus on the description and comprehension of the role of each virus, and the different combinations of viruses, in the development of enteric disease.

Pneumocystis é um importante patógeno oportunista que pode causar um quadro de pneumonia intersticial fatal em animais infectados por alguma doença imunodepressora. Pneumocystis sp. tem sido identificado em suínos domésticos e selvagens coinfectados com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) que desenvolvem a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS). O presente trabalho analisou 78 javalis (Sus scrofa) com histórico de SMDS procedentes de 6 diferentes propriedades com sistema de confinamento intensivo no Rio Grande do Sul no período de março de 2006 a junho de 2008. Amostras de tecido pulmonar de seis javalis que não desenvolveram clinicamente a SMDS, assim como, amostras de suínos procedentes de abatedouros dos Estados do Rio Grande do Sul e Mato Grosso foram incluídas nas análises molecular e filogenética do trabalho. O teste de imunohistoquímica (IHQ) para a detecção de Pneumocystis sp. foi positivo em 50% dos pulmões analisados. A IHQ para a detecção de PCV2 foi positiva em 37% dos animais, sendo que o linfonodo mesentérico foi o órgão que apresentou maior grau de marcação positiva. Coinfecção entre Pneumocystis sp. e PCV2 foi confirmada pela IHQ em 20,5% dos javalis. O teste de nested-PCR dos genes mtLSU rRNA e mtSSU rRNA identificou a presença de material genético de Pneumocystis sp. em pulmões de javalis que desenvolveram a SMDS e em pulmões de javalis que não apresentaram clinicamente a doença, sugerindo que somente a presença de Pneumocystis sp. não se caracteriza como causa suficiente para o desenvolvimento de pneumonia intersticial. Identificou-se pela análise filogenética que javalis e suínos no Brasil são afetados pela mesma espécie de Pneumocystis sp. e que esta subdividese em dois grupos distintos. / Pneumocystis is an important opportunistic pathogen that may cause lethal interstitial pneumonia in infected animals due to some immunosuppressive disease. Pneumocystis sp. has been found in domestic and feral swine co infected with porcine circovirus type 2 (PCV2) that developed the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). This study analyzed 78 wild boars (Sus scrofa) with PMWS background from 6 different farms with intensive confinement system in Rio Grande do Sul from March 2006 to June 2008. The lung tissue samples of six wild boars that did not develop PMWS, as well as the swine samples from slaughterhouses in Rio Grande do Sul and Mato Grosso were included in the molecular and phylogenetic analyses of this study. The immunohistochemistry test (IHC) for detection of Pneumocystis sp. was positive in 50% of the analyzed lungs. The IHC for PCV2 detection was positive in 37% of the animals and the mesenteric lymph node was the organ with the highest degree of positive staining. Co infection in Pneumocystis sp. and PCV2 was confirmed by IHC in 20.5% of wild boars. The nested-PCR test of the mtLSU rRNA and mtSSU rRNA genes identified the presence of genetic material of Pneumocystis sp. in lungs of wild boars that developed the PWMS and in wild boars that did not presented clinical disease, which may mean that only the presence of Pneumocystis sp. was not characterized as sufficient cause to interstitial pneumonia development. Through phylogenetic analysis it has been identified that wild boars and swine in Brazil are affected by the same specie of Pneumocystis sp. and its subdivision in two different groups.

Pneumocystis é um importante patógeno oportunista que pode causar um quadro de pneumonia intersticial fatal em animais infectados por alguma doença imunodepressora. Pneumocystis sp. tem sido identificado em suínos domésticos e selvagens coinfectados com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) que desenvolvem a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS). O presente trabalho analisou 78 javalis (Sus scrofa) com histórico de SMDS procedentes de 6 diferentes propriedades com sistema de confinamento intensivo no Rio Grande do Sul no período de março de 2006 a junho de 2008. Amostras de tecido pulmonar de seis javalis que não desenvolveram clinicamente a SMDS, assim como, amostras de suínos procedentes de abatedouros dos Estados do Rio Grande do Sul e Mato Grosso foram incluídas nas análises molecular e filogenética do trabalho. O teste de imunohistoquímica (IHQ) para a detecção de Pneumocystis sp. foi positivo em 50% dos pulmões analisados. A IHQ para a detecção de PCV2 foi positiva em 37% dos animais, sendo que o linfonodo mesentérico foi o órgão que apresentou maior grau de marcação positiva. Coinfecção entre Pneumocystis sp. e PCV2 foi confirmada pela IHQ em 20,5% dos javalis. O teste de nested-PCR dos genes mtLSU rRNA e mtSSU rRNA identificou a presença de material genético de Pneumocystis sp. em pulmões de javalis que desenvolveram a SMDS e em pulmões de javalis que não apresentaram clinicamente a doença, sugerindo que somente a presença de Pneumocystis sp. não se caracteriza como causa suficiente para o desenvolvimento de pneumonia intersticial. Identificou-se pela análise filogenética que javalis e suínos no Brasil são afetados pela mesma espécie de Pneumocystis sp. e que esta subdividese em dois grupos distintos. / Pneumocystis is an important opportunistic pathogen that may cause lethal interstitial pneumonia in infected animals due to some immunosuppressive disease. Pneumocystis sp. has been found in domestic and feral swine co infected with porcine circovirus type 2 (PCV2) that developed the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). This study analyzed 78 wild boars (Sus scrofa) with PMWS background from 6 different farms with intensive confinement system in Rio Grande do Sul from March 2006 to June 2008. The lung tissue samples of six wild boars that did not develop PMWS, as well as the swine samples from slaughterhouses in Rio Grande do Sul and Mato Grosso were included in the molecular and phylogenetic analyses of this study. The immunohistochemistry test (IHC) for detection of Pneumocystis sp. was positive in 50% of the analyzed lungs. The IHC for PCV2 detection was positive in 37% of the animals and the mesenteric lymph node was the organ with the highest degree of positive staining. Co infection in Pneumocystis sp. and PCV2 was confirmed by IHC in 20.5% of wild boars. The nested-PCR test of the mtLSU rRNA and mtSSU rRNA genes identified the presence of genetic material of Pneumocystis sp. in lungs of wild boars that developed the PWMS and in wild boars that did not presented clinical disease, which may mean that only the presence of Pneumocystis sp. was not characterized as sufficient cause to interstitial pneumonia development. Through phylogenetic analysis it has been identified that wild boars and swine in Brazil are affected by the same specie of Pneumocystis sp. and its subdivision in two different groups.

O diagnóstico da malária tem como teste de referência a gota espessa, porém é consenso que é preciso adotar alternativas em situações específicas, com técnicas mais sensíveis e que possam ser aplicadas no processamento de grande número de amostras, como estudos clínicos, epidemiológicos ou triagem de doadores em bancos de sangue. Com a finalidade de formar uma plataforma de diagnóstico para malária em amostras agrupadas em pools, foi realizada análise comparativa da PCR em tempo real, a nested PCR e um teste rápido específico para detecção de anticorpos contra P.falciparum e P. vivax, com intuito de reduzir o número de ensaios, com custo relativamente baixo. Foram utilizadas 50 amostras de sangue positivas para Plasmodium, de acordo com a prevalência das espécies no Brasil (P. vivax 75%, P. falciparum 22% e P. malariae 3%), com diagnóstico realizado pelo método padrão ouro. Adicionalmente, 48 amostras de sangue negativas para Plasmodium foram selecionadas para controle negativo e confecção de 15 pools, contendo amostras positivas e negativas. Quatro das amostras negativas para malária eram positivas para outras doenças. Tanto as amostras positivas como as negativas foram submetidas individualmente aos ensaios de PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico SD Bioline Pf/Pv para detecção de malária. Um teste de PCR convencional foi incluído a fim de testar a qualidade do DNA, mediante amplificação de uma sequência do gene humano da -globina como controle interno. Posteriormente as amostras foram analisadas em pools pelos ensaios moleculares e sorológicos. Nos testes individuais, 45/49 amostras foram positivas para Plasmodium pela PCR em tempo real, com Sensibilidade de 91,84%, e Especificidade (48/48) de 100,00%; 46/49 amostras detectaram Plasmodium pela nested PCR, com Sensibilidade de 93,88%, e Especificidade (12/12) de 100,00%; 32/46 amostras foram reagentes no teste sorológico SD Bioline Pf/Pv, com Sensibilidade de 69,56%, e Especificidade (10/10) de 100,00%. Nos ensaios com amostras agrupadas, 13 pools (86,66%) foram positivos pela PCR em tempo real; a nested PCR também obteve positividade nos mesmos 13 pools (86,66%). O teste imunocromatográfico SD Bioline apresentou Sensibilidade de 73,33% considerando o diagnóstico pela gota espessa. Tanto a PCR em tempo real como a nested PCR apresentaram boa sensibilidade e especificidade, seja nas amostras clínicas analisadas individualmente ou em pools, diferentemente do teste sorológico SD Bioline. Ambas as metodologias moleculares apresentaram desempenho semelhante, com bons resultados de acurácia e indicadores de validade, como Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Negativo. Considerando-se as vantagens inerentes à PCR em tempo real, como rapidez, processamento em sistemas fechados e dispensa de eletroforese após amplificação, este método deve ser indicado como primeira escolha para diagnóstico de malária em grande número de amostras, seguido da nested PCR para diferenciação de espécies de Plasmodium. O teste sorológico, que é específico para detecção de anticorpos contra P. vivax e P. falciparum, pode ser indicado apenas como método complementar no diagnóstico de malária / The diagnosis of malaria is based on the thick blood film as reference test, but the consensus is that it is necessary to adopt alternatives in specific situations, with more sensitive techniques that could be applied in the processing of large numbers of samples in clinical and epidemiological studies or in the screening of donors at blood banks. The purpose of this study was to analyze and compare the real-time PCR, the nested PCR and a rapid test for detection of specific antibodies against Plasmodium falciparum and P. vivax, to build a platform for malaria diagnosis in pooled samples, reducing the number of tests and providing relatively low cost. For the tests analysis, we used 50 blood samples positive for Plasmodium, according to the prevalence of the species in Brazil (75% P. vivax, 22% P. falciparum and 3% P. malariae), with diagnosis performed by the gold standard method. In addition, 48 blood samples negative for Plasmodium were selected for negative control and production of 15 pools containing positive and negative samples. Four of the malaria negative samples were positive for other diseases. Both the positive and negative samples were submitted to individual testing of real-time PCR, nested PCR and immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv for the detection of malaria. To check the quality of DNA, a conventional PCR was included, with amplification of a sequence of the -globin human gene as internal control. Subsequently the samples were analyzed in pools by molecular and serological tests. In individual tests, 45/49 samples were positive for Plasmodium by real time PCR, with sensitivity of 91.84% and (48/48) 100.00% specificity, 46/49 samples detected Plasmodium by nested PCR, with sensitivity of 93.88% and (12/12) specificity 100.00%; 32/46 samples were positive on serological test SD Bioline, with sensitivity of 69.56% and (10/10) 100.00% specificity. In tests with pooled samples, 13 pools (86.66%) were positive by real time PCR; the nested PCR also had positive results in the same 13 pools (86.66%). Immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv showed sensitivity of 73.33% compared with blood smear. Both real-time PCR and the nested PCR showed good sensitivity and specificity in samples analyzed individually and in pools, unlike the SD Bioline test. Both molecular methods showed similar performance, with good results in accuracy and validity indicators, such as sensitivity, specificity, positive and negative predictive values. Considering the advantages inherent in real-time PCR, a fast test that is processed in closed systems without post-amplification handling, this method should be indicated as first choice for diagnosis of malaria in large numbers of samples, followed by nested PCR for species determination. Serological test, that is specific for antibodies against P. vivax and P. falciparum, could be used as a supplementary method for diagnosis of malaria

Orientador: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Juliana Peloi Vides / Banca:Heito Flávio Ferrari / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca:Cáris Maroni Nunes / Resumo: O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. "Nested" PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolate s in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., f ollowed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in d og samples was 10.4% (38/367). The real - time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis . The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis . A higher positivity was observed in pup pie s and kittens when compared to adult animals . The analytical sensitivity of real - time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium . We c oncluded that dogs and cats n of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real - time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs / Doutor

Pneumocystis é um importante patógeno oportunista que pode causar um quadro de pneumonia intersticial fatal em animais infectados por alguma doença imunodepressora. Pneumocystis sp. tem sido identificado em suínos domésticos e selvagens coinfectados com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) que desenvolvem a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS). O presente trabalho analisou 78 javalis (Sus scrofa) com histórico de SMDS procedentes de 6 diferentes propriedades com sistema de confinamento intensivo no Rio Grande do Sul no período de março de 2006 a junho de 2008. Amostras de tecido pulmonar de seis javalis que não desenvolveram clinicamente a SMDS, assim como, amostras de suínos procedentes de abatedouros dos Estados do Rio Grande do Sul e Mato Grosso foram incluídas nas análises molecular e filogenética do trabalho. O teste de imunohistoquímica (IHQ) para a detecção de Pneumocystis sp. foi positivo em 50% dos pulmões analisados. A IHQ para a detecção de PCV2 foi positiva em 37% dos animais, sendo que o linfonodo mesentérico foi o órgão que apresentou maior grau de marcação positiva. Coinfecção entre Pneumocystis sp. e PCV2 foi confirmada pela IHQ em 20,5% dos javalis. O teste de nested-PCR dos genes mtLSU rRNA e mtSSU rRNA identificou a presença de material genético de Pneumocystis sp. em pulmões de javalis que desenvolveram a SMDS e em pulmões de javalis que não apresentaram clinicamente a doença, sugerindo que somente a presença de Pneumocystis sp. não se caracteriza como causa suficiente para o desenvolvimento de pneumonia intersticial. Identificou-se pela análise filogenética que javalis e suínos no Brasil são afetados pela mesma espécie de Pneumocystis sp. e que esta subdividese em dois grupos distintos. / Pneumocystis is an important opportunistic pathogen that may cause lethal interstitial pneumonia in infected animals due to some immunosuppressive disease. Pneumocystis sp. has been found in domestic and feral swine co infected with porcine circovirus type 2 (PCV2) that developed the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). This study analyzed 78 wild boars (Sus scrofa) with PMWS background from 6 different farms with intensive confinement system in Rio Grande do Sul from March 2006 to June 2008. The lung tissue samples of six wild boars that did not develop PMWS, as well as the swine samples from slaughterhouses in Rio Grande do Sul and Mato Grosso were included in the molecular and phylogenetic analyses of this study. The immunohistochemistry test (IHC) for detection of Pneumocystis sp. was positive in 50% of the analyzed lungs. The IHC for PCV2 detection was positive in 37% of the animals and the mesenteric lymph node was the organ with the highest degree of positive staining. Co infection in Pneumocystis sp. and PCV2 was confirmed by IHC in 20.5% of wild boars. The nested-PCR test of the mtLSU rRNA and mtSSU rRNA genes identified the presence of genetic material of Pneumocystis sp. in lungs of wild boars that developed the PWMS and in wild boars that did not presented clinical disease, which may mean that only the presence of Pneumocystis sp. was not characterized as sufficient cause to interstitial pneumonia development. Through phylogenetic analysis it has been identified that wild boars and swine in Brazil are affected by the same specie of Pneumocystis sp. and its subdivision in two different groups.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-05T11:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sanches_CristianaDePaulaPacheco_D.pdf: 39491118 bytes, checksum: 1b9b67b564e9684ca74114092ff37150 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos