La famille des NADPH oxydases est constituée de complexes multi protéiques, dont un des composants est la sous unité catalytique NOX. Il s'agit de protéine transmembranaire qui assure le transport des électrons à travers la membrane, à partir d'un donneur d'électrons, le NADPH, à un accepteur final, l'oxygène moléculaire. Il en résulte la production de superoxydes, précurseur d'espèces réactives de l'oxygène. Les NOX sont impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques qui les ont placés au rang des cibles thérapeutiques à forte valeur ajoutée.Les NOX sont reportées comme des protéines membranaires propres aux eucaryotes supérieures. Ainsi toutes les données fonctionnelles disponibles pour cette famille d'enzyme, ont été le fruit des études structure-fonction et de données putatives indirectes. D'où l'idée et l'intérêt d'identifier chez les procaryotes des candidats homologues aux Nox eucaryotes et susceptibles d'être de bons modèles pour des études structurales. En se servant d'outils bio-informatiques, nous avons définis des signatures de séquences propres aux NOX et avons identifié chez les procaryotes des centaines de séquences homologues. SpNox de chez Streptococcus Pneumoniae, a été sélectionnée et surexprimée chez E. Coli. SpNox a été purifiée et a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et biochimique approfondie. Au vue des résultats obtenus, SpNox se rapproche de part ses propriétés structurales et mechanistiques des NOX eucaryotes. Ainsi elle se présente comme le premier modèle procaryote de protéine NOX. Les premiers cristaux de cette famille de protéines ont été obtenus et son rôle in vivo reste à exploiter.En parallèle à l'approche procaryote, nous avons mené une étude structure-fonction sur la protéine NOX2 des neutrophiles PLB-985. Deux arginines conservées chez toutes les NOX eucaryotes ont été sélectionnées et leur rôle a été étudié par mutagenèse dirigée. Apres évaluation des propriétés enzymatiques des mutants NOX2, nous avons pu identifier l'arginine 513 comme étant impliquée dans la spécificité de NOX2 vis a vis du NADPH. Ces résultats nous ont permis de proposer une nouvelle orientation du NADPH dans son site d'ancrage à la protéine NOX2. / The NADPH oxidase complex was the first identified example of a system that generates reactive oxygen species in a dedicated manner. NOX are proteins involved in the transmembrane transfer of electrons to the molecular oxygen, resulting in the production of superoxides. In addition to ROS related damages, deregulation of Nox-dependant ROS production induces pathological consequences. Accordingly, the Nox family became a potential drug target, making the understanding of their function at molecular basis crucial.In the literature, it has always been reported that Nox proteins exist only in eukaryotes. Since eukaryotic membrane proteins have proven to be difficult to study, all the data available on Nox enzymes are obtained from putative assignments or structure-function studies.In our project, to overcome the difficulty of working on eukaryotic membrane proteins, we used an original approach based on bioinformatics tools. Through using specific filters and a novel program, we were able to identify hundreds of prokaryotic candidates. Among them, we selected SpNox, as a prokaryotic model from Streptococcus Pneumoniae. We have developed its expression in E. Coli as well as a multistep purification scheme. We also conducted an extensive enzymatic and mechanistic characterization of the purified enzyme. Our data support a strong structural and functional homology with known NOX enzymes. Finally, crystallization trials are performed leading to first crystals ever obtained for this family of protein. The understanding of Nox's physiological function in bacteria remains to investigate.In parallel to the prokaryotic approach, a structure-function study was conducted on the human model NOX2 in the PLB-985 neutrophils. Conserved arginines among eukaryotic Nox sequences were selected. Site directed mutagenesis followed by activity tests, lead us to identify a crucial role for arginine 513. It is implicated in the specificity towards NADPH as an electron donor for NOX2. With these data, we were able to suggest a new orientation of the NADPH, notably the phosphate moiety, in the binding site.

Les antibiotiques sont les médicaments les plus utilisés dans la médecine moderne. Depuis leurs découvertes, ils ont drastiquement changé la façon dont les infections sont traitées. Toutefois, à travers le processus d’adaptation, les bactéries deviennent éventuellement résistantes aux antibiotiques. Malgré leur omniprésence dans la biosphère, l’émergence de souches résistantes est favorisée par le mauvais usage des antibiotiques, ce qui crée une menace importante pour la santé publique. Les antibiotiques actuelles perdent graduellement leur efficacité, et vue le faible nombre de nouvelles molécules développées, la priorité est donnée pour la découverte de nouvelles stratégies capables de combattre les pathogènes. Les nouvelles cibles thérapeutiques idéales doivent exercer une faible pression évolutive, diminuer la virulence et être unique aux microorganismes. Une façon d’atteindre cet objectif est d’interférer dans la régulation et l’homéostasie du Fer chez les bactéries. La biodisponibilité du Fer a fortement influencé l’émergence de la vie sur terre et les stratégies évolutives qu’elle a adoptée. Ce qui a mené à l’apparition d’un mécanisme central de détection du Fer assurant la régulation de cet élément de haute importance. Ce senseur est un point faible que nous pourrons exploiter dans notre combat contre les infections bactériennes. La protéine Fur, pour « Ferric Uptake Regulator », est un régulateur de transcription métal dépendant qui est impliqué dans vaste réseau de régulation contrôlant principalement l’homéostasie du Fer et l’expression de facteurs de virulence. Le travail présenté dans ce manuscrit complète les études précédentes sur des inhibiteurs de la protéine Fur en utilisant une approche combinée théorique et expérimentale grâce a des expériences de XAS, SAXS et MALLS associé a de la modélisation moléculaire. Nous décrivons pour la première fois la structure de Fur d’E. coli ainsi que la structure d’un tétramère de Fur d’un mutant de P. aeruginosa. Par ailleurs, les profils d’énergie libre des protéines Fur de différentes espèces ont été déterminé, pour des complexes tetramériques ou dans le cas de dimères liés à l’ADN, permettant une compréhension préliminaire de leur mécanistique. Les informations structurales obtenues grâce aux travaux présentés dans ce manuscrit permettront de mieux comprendre les mécanismes d’inhibition des protéines Fur ainsi que fournir de nouvelles opportunités pour le développement de molécules a visée thérapeutique. / The most commonly prescribed drugs in human medicine are antibiotics. Since their discovery, they have drastically impacted the way we treat infections. However, a bacterium eventually becomes resistant to antimicrobial treatment through the natural process of adaptative evolution. Even if resistant bacteria are omnipresent in the biosphere, their emergence rate is accelerated by the misuse of antimicrobial agents leading to the public health threat we are facing now. As currently available antimicrobial agents lose their effectiveness and very few new drugs are being developed, a breakthrough in new strategies to fight pathogens should be a priority. Ideal new therapeutic targets should exert weak evolutionary pressure, disarm or weaken the pathogen and be unique to microorganisms. One way to do so is by interfering with the iron regulation and its homeostasis within Bacteria. The bioavailability of iron strongly influenced early life and the metabolic strategies that sustained it. A central iron sensing mechanism evolved to ensure the regulation of such an important element. Sadly for bacteria this sensor became an exploitable weakness in our battle against infection. The “Ferric Uptake Regulator” is a metal dependent transcription regulator with a large regulatory network controlling iron homeostasis and bacterial virulence. This work continues previous investigations on Fur inhibitors using a combined experimental and theoretical approach by performing XAS, SAXS and MALLS experiments together with computer simulations. We describe for the first time the structures of Fur from E. coli in addition to a tetrameric Fur structure of a mutant from P. aeruginosa. Moreover, free energy profiles of Fur proteins, as tetramers or dimers bound to DNA, from different species were generated and key residues involved in the interactions determined, providing mechanistic insights into Fur complexes. The structural information gathered from this work will be used to better understand inhibition mechanisms of Fur proteins providing new opportunities to overcome drug development challenges.