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La sécrétion de lipase, la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras (AGL) ont été étudiés chez Yarrowia lipolytica (YL) en présence d’huile d’olive et/ou de sucrose. Des mesures d’activité lipase et d’immuno-révélation ont montré que l’activité lipase présente dans le milieu de culture provenait principalement de la lipase YLLIP2. L’huile d’olive induit la production de lipase qui est principalement associée aux cellules pendant les premières heures de cultures. YLLIP2 est ensuite libérée dans le milieu de culture avant d’être totalement dégradée par les protéases. Les triglycérides (TG) sont dégradés alors que la lipase est encore attachée aux cellules. Les produits de lipolyse présents dans le milieu de culture et à l’intérieur des cellules ont été quantifiés par chromatographie TLC-FID et GC. Les niveaux intracellulaires d’AGL et de TG augmentent transitoirement et dépendent de la source de carbone utilisée. Une accumulation maximum de 37,8 % w/w de lipides est observée avec l’huile d’olive seule. Cette étude montre que la levure YL est un modèle intéressant pour étudier la lipolyse extracellulaire et l’absorption des acides gras par les cellules / Lipase secretion, extracellular lipolysis and fatty acid (FFA) uptake were quantified in Yarrowia lipolytica (YL) grown in the presence of olive oil and/or sucrose. Lipase assays and western blot analysis indicated that the lipase activity measured in YL cultures mainly resulted from YLLIP2 lipase. Lipase production was triggered by olive oil and YLLIP2 remained associated with the yeast cells during the first hours of culture. It was then released in the culture medium before it was totally degraded by the alkaline protease. Olive oil triglycerides (TG) were degraded when the lipase was still attached to the cell wall. The fate of lipolysis products in the culture medium and inside the yeast cell were investigated by quantitative TLC-FID and GC analysis. Intracellular levels of FFA and TG increased transiently and were dependent on the carbon sources. A maximum fat storage of 37.8% w/w was observed with olive oil alone. The present study shows that yeasts are interesting models for studying extracellular lipolysis and fat uptake by the cell

La famille des NADPH oxydases est constituée de complexes multi protéiques, dont un des composants est la sous unité catalytique NOX. Il s'agit de protéine transmembranaire qui assure le transport des électrons à travers la membrane, à partir d'un donneur d'électrons, le NADPH, à un accepteur final, l'oxygène moléculaire. Il en résulte la production de superoxydes, précurseur d'espèces réactives de l'oxygène. Les NOX sont impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques qui les ont placés au rang des cibles thérapeutiques à forte valeur ajoutée.Les NOX sont reportées comme des protéines membranaires propres aux eucaryotes supérieures. Ainsi toutes les données fonctionnelles disponibles pour cette famille d'enzyme, ont été le fruit des études structure-fonction et de données putatives indirectes. D'où l'idée et l'intérêt d'identifier chez les procaryotes des candidats homologues aux Nox eucaryotes et susceptibles d'être de bons modèles pour des études structurales. En se servant d'outils bio-informatiques, nous avons définis des signatures de séquences propres aux NOX et avons identifié chez les procaryotes des centaines de séquences homologues. SpNox de chez Streptococcus Pneumoniae, a été sélectionnée et surexprimée chez E. Coli. SpNox a été purifiée et a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et biochimique approfondie. Au vue des résultats obtenus, SpNox se rapproche de part ses propriétés structurales et mechanistiques des NOX eucaryotes. Ainsi elle se présente comme le premier modèle procaryote de protéine NOX. Les premiers cristaux de cette famille de protéines ont été obtenus et son rôle in vivo reste à exploiter.En parallèle à l'approche procaryote, nous avons mené une étude structure-fonction sur la protéine NOX2 des neutrophiles PLB-985. Deux arginines conservées chez toutes les NOX eucaryotes ont été sélectionnées et leur rôle a été étudié par mutagenèse dirigée. Apres évaluation des propriétés enzymatiques des mutants NOX2, nous avons pu identifier l'arginine 513 comme étant impliquée dans la spécificité de NOX2 vis a vis du NADPH. Ces résultats nous ont permis de proposer une nouvelle orientation du NADPH dans son site d'ancrage à la protéine NOX2. / The NADPH oxidase complex was the first identified example of a system that generates reactive oxygen species in a dedicated manner. NOX are proteins involved in the transmembrane transfer of electrons to the molecular oxygen, resulting in the production of superoxides. In addition to ROS related damages, deregulation of Nox-dependant ROS production induces pathological consequences. Accordingly, the Nox family became a potential drug target, making the understanding of their function at molecular basis crucial.In the literature, it has always been reported that Nox proteins exist only in eukaryotes. Since eukaryotic membrane proteins have proven to be difficult to study, all the data available on Nox enzymes are obtained from putative assignments or structure-function studies.In our project, to overcome the difficulty of working on eukaryotic membrane proteins, we used an original approach based on bioinformatics tools. Through using specific filters and a novel program, we were able to identify hundreds of prokaryotic candidates. Among them, we selected SpNox, as a prokaryotic model from Streptococcus Pneumoniae. We have developed its expression in E. Coli as well as a multistep purification scheme. We also conducted an extensive enzymatic and mechanistic characterization of the purified enzyme. Our data support a strong structural and functional homology with known NOX enzymes. Finally, crystallization trials are performed leading to first crystals ever obtained for this family of protein. The understanding of Nox's physiological function in bacteria remains to investigate.In parallel to the prokaryotic approach, a structure-function study was conducted on the human model NOX2 in the PLB-985 neutrophils. Conserved arginines among eukaryotic Nox sequences were selected. Site directed mutagenesis followed by activity tests, lead us to identify a crucial role for arginine 513. It is implicated in the specificity towards NADPH as an electron donor for NOX2. With these data, we were able to suggest a new orientation of the NADPH, notably the phosphate moiety, in the binding site.

Malgré sa diffusion rapide dans le domaine des biomolécules, plusieurs problèmes restent à résoudre avant que la RMN du solide à haute résolution soit prête à faire face à des applications complexes. Afin d’étendre ses capacités, les objectifs de cette thèse sont de deux ordres: a) établir un nouveau système modèle, plus complexe que les petites protéines globulaires et b) développer de nouvelles expériences de RMN afin d'améliorer la sensibilité et la résolution des méthodes pour l'attribution de résonances. Le domaine N-terminale de l’unité de l'ADN polymérase III de E. coli a été choisi comme système cible. Les conditions de préparation de l’échantillon sont obtenues grâce aux processus de screening à haut débit, et l'attribution quasi exhaustive des résonances est effectuée par l'application des expériences bien établies basées sur les irradiations rf à haute puissance et la rotation à l'angle magique (MAS) à basse fréquence. Nous montrons que l'utilisation de vitesses à l'angle magique "ultra-rapides" (60 kHz) rend possible l'usage d'expériences aux "puissances faibles" affichant une augmentation extraordinaire de résolution et sensibilité, et permettant l'acquisition des transferts par polarisation croisée, des corrélations entre les liaisons chimiques et des corrélations détectées par 1H. Des faibles largeurs de pics sur les spectres 1H sont obtenues pour des échantillons de protéines entièrement protonées à l’état solide sans qu'une dilution dans un milieu deutéré soit nécessaire. La dernière partie de la thèse concerne l’étude de phases cristaux liquides (LX) thermotropes d'un smectogen de Vries , le dérivé (S)-hexyl-lactate, abrégé 9HL, sélectivement deutéré. / Despite the rapid diffusion of solid-state NMR (ssNMR) in the area of biomolecules, its application is far away of being systemic, and many problems remain however tobe solved before it is applied to the study of challenging solid protein assemblies. In order to extend the capabilities of ssNMR to larger substrates, the objectives of this thesis are twofold: a) to establish a new, large and more complex model system, and b) to develop new, sophisticated NMR experiments in order to improve the sensitivity and the resolution of the currently existing schemes for resonance assignment. The N-terminal domain of the Polymerase subunit III of E. coli was chosen as a target system. Sample preparation conditions are obtained, notably in combination with automated screening processes, and almost complete resonance assignment is performed based on high-power rf irradiations and slow magic-angle spinning (MAS. We show that the use use of MAS at so-called ultra-fast spinning rates (60 kHz makes possible the use of "totally low power" experiments. This yields an extraordinary increase in resolution and sensitivity, enabling the acquisition of selective cross polarization (CP) transfers, through-bond correlations and 1H-detected correlations. Narrow 1H NMR line widths and robust backbone assignment can be obtained for fully protonated medium-size protein samples in the solid state under ultra-fast magic-angle spinning, without any need for dilution against a deuterated background. The final part of this thesis concerns the study of thermotropic liquid crystals (LX) phases of a de Vries smectogen, the (S)-hexyl-lactate derivative abbreviated as 9HL, selectively deuterated. / Nonostante la rapida diffusione della RMN allo stato solido (ssNMR) nell’ambito delle biomolecule, molti problemi rimangono da risolvere prima che quest’ultima possa essere applicata ad applicazioni più complesse. Allo scopo di estendere le sue potenzialità, gli obiettivi di questa tesi sono duplici. a) stabilire un nuovo sistema modello, più complesso delle semplici proteine globulari e b) sviluppare nuovi e piu sofisticati esperimenti NMR al fine di migliorare la sensibilità e la risoluzione dei metodi attualmente esistenti per l'assegnazione delle risonanze. Il dominio N-terminale dell’unita ε della DNA Polimerasi III di E.Coli è stato scelto come sistema bersaglio. Le condizioni di preparazione del campione sono ottenute grazie a processi di screening ad alta capacita, e l’assegnazione quasi complete delle risonanze è effettuata tramite l’applicazione di esperimenti routinari basati su irradiazioni RF a alta potenza e rotazioni all’angolo magico a bassa frequenza. Mostriamo che l’utilizzo di rotazioni all’angolo magico “ultra-MAS” (60 kHz) rende possibile l’uso di esperimenti “a basse potenze” mostrando uno straordinario aumento di risoluzione e sensibilità, e permettendo l’acquisizione di trasferimenti di polarizzazione selettivi, di correlazioni scalari attraverso i legami chimici e di correlazioni acquisite al protone. Larghezze di linea sottili al protone sono ottenute per campioni di proteine interamente protonate allo stato solido senza che sia necessaria diluizione in ambiente deuterato. L’ultima parte della tesi riguarda lo studio di fasi liquido-cristalline termotropiche di uno smettogeno de Vries, il derivato dello (S)-esil-lattato, abbreviato come 9HL, selettivamente deuterato.

Cette thèse porte sur deux aspects complémentaires, le développement et l’implémentation de nouvelles approches de cristallisation et de cristallographie sérielle ainsi que leur mise en œuvre dans l’étude structurale de complexes enzymes : ARNt. La cristallographie est la méthode la plus employée en biologie structurale, mais elle présente encore des points délicats. Plusieurs méthodes avancées ont été déployées dans ce travail pour y pallier qui ont conduit à la résolution de la structure de l’ARNt nucléotidyltransférase du psychrophile Planococcus halocryophilus et à l’étude de son adaptation structurale au froid ; des puces microfluidiques de cristallisation qui ont servi à la résolution de plusieurs structures à température ambiante par cristallographie sérielle ; enfin le Xtal Controller utilisé pour l’étude d’évènements de nucléation et de croissance cristalline dans un but de préparation d’échantillons pour analyse sous rayonnement XFEL. Entre autres systèmes biologiques, cette thèse présente la caractérisation de deux familles d’inhibiteurs visant les aspartyl-ARNt synthétases, notamment du pathogène Pseudomonas aeruginosa. / This thesis focuses on two complementary aspects, the development and implementation of new approaches of crystallization and of serial crystallography as well as their use in the structural study of enzymes/tRNA complexes. Crystallography is the most used method in structural biology, but it presents delicate points. Different methods were implemented in this work to overcome these points, which led to the resolution of the structure of the CCA-adding enzyme of the psychrophilic organism Planococcus halocryophilus and to the study of its structural adaptation to the cold; novel microfluidic crystallization chips that have been used for the resolution of several structures by serial crystallography at room-temperature; finally the Xtal Controller used for the study of nucleation and crystal growth events with the purpose of preparing samples for analysis under XFEL radiation. Among other biological systems, this thesis presents the study and characterization of two families of inhibitors targeting aspartyl-tRNA synthetases, including the one of the pathogenic organism Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales chez les patients immunodéprimés ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de la mucoviscidose (CF). La colonisation des voies respiratoires des patients CF est souvent mortelle car une fois installée, cette bactérie est difficile à éradiquer et provoque le déclin des fonctions respiratoires des patients. L'antibiothérapie devient inefficace face au développement de souches multi-résistantes et sa capacité à former un biofilm. L'étape cruciale initiant l'infection ou la formation du biofilm est l'adhésion durant laquelle des interactions spécifiques lectines/oligosaccharides permettent la fixation de la bactérie à la surface de la cellule hôte. Bloquer l'adhésion serait un moyen de lutter contre l'infection. Dans l'approche d'une thérapie anti-adhésive, plusieurs lectines impliquées dans l'adhésion et l'élaboration du biofilm sont prises comme cibles. Dans un premier temps, des lectines fimbriales putatives identifiées récemment, CupB6 et CupE6, ont fait l'objet d'une étude. Des essais d'expression, de purification et de cristallisation ont été réalisés dans l'objectif de résoudre leur structure cristallographique. Une étude visant à identifier le ligand naturel de CupB6 a également été entreprise. Puis une étude a été menée pour caractériser le potentiel d'inhibition de plusieurs molécules dérivées du galactose sur la lectine soluble, PA-IL. Certaines de ces molécules pourraient être utilisées comme glycomimétiques offrant une alternative aux antibiotiques. Une étude par microcalorimétrie et cristallographie aux rayons X a permis d'étudier la spécificité d'une lectine de légumineuse, PELa. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic bacterium responsible for numerous nosocomial infections in immunosuppressed patients. It is the first mortal pathogen in cystic fibrosis (CF) patients. The invasion of the respiratory tract of CF patients by the bacterium is often lethal because it is hard to eradicate and it rapidly impairs the respiratory functions of the patients. None of the current antibiotherapy procedures are efficient against multiresistant, biofilm forming P. aeruginosa. The first step leading to infection or biofilm formation involves the initial adhesion of bacterial cells to the host pulmonary cells via specific lectin/oligosaccharid interactions. Blocking the adhesion would be a way to fight against the infection. The anti-adhesion therapy targets several bacterial lectins involved in adhesiveness and biofilm formation. In this work, the recently identified putative fimbrial lectins CupB6 and CupE6 have been studied. Expression and purification tests followed by crystallization trials have been performed. In parallel, attempts to identify the natural ligand of CupB6 were also carried out. This work also presents a systematic characterization of the inhibitory effects of various galactose-derived molecules on the PA-IL lectin. Some of these molecules could be used as glycomimetic drugs thus offering an interesting alternative to standard antibiotics. Finally, the combination of microcalorimetry together with X-ray crystallography enabled us to gain insights into the ligand specificity of PELa, a legume lectin.