Annuellement, la vie de millions de personnes est bouleversée suite à un diagnostic de cancer. Cette maladie est caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un tissu ou d'un organe au point de menacer la vie du patient. Une multitude de gènes sont connus pour leur implication dans le cancer. Toutefois les protéines régulatrices du cycle cellulaire, les cyclines, sont les principaux responsables du dérèglement cellulaire. Les cyclines D contrôlent l'entrée et la progression de la cellule en phase G1. La découverte d'un site commun d'intégration du rétrovirus murin Graffi en amont du gène de la cycline D2 (D2) a révélé l'existence d'un nouvel isoforme, la cycline D2 tronquée (D2Trc). La D2Trc se distingue par l'utilisation d'un site donneur d'épissage alternatif localisé dans le second intron. Il en résulte un exon 2 allongé et l'apparition d'un codon stop après le 156e acide aminé. Par rapport à la D2, 133 acides aminés sont manquants dont les 21 derniers de la boîte cycline. Les 20 acides aminés terminaux diffèrent de la D2. L'altération de la séquence génère une protéine cytosolique contrairement à la D2 qui est nucléaire. Il a été démontré que la D2Trc détient un pouvoir immortalisant supérieur à la D2. Cette étude vise à identifier les principaux partenaires d'interaction de la D2Trc chez la souris par co-immunoprécipitation. Des fibroblastes de souris (NIH/3T3) ont été transfectés par le vecteur pCMV contenant l'ADNc murin de la D2 ou la D2Trc en phase avec l'épitope Myc à l'extrémité N-terminale. La D2 et la D2Trc ont été co-immunoprécipitées à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'épitope Myc associé à de billes de protéine G sépharose. Les complexes protéiques ont été dissociés de l'anticorps par compétition avec le peptide Myc. Les extraits ont été séparés sur un gel de polyacrylamide puis colorés au nitrate d'argent. Les interactions entre l'anticorps et la forme native de la D2 et la D2Trc ont été observées in situ par colocalisation. Les résultats indiquent que l'anticorps peut se lier à l'étiquette Myc des protéines tant dans la forme native que linéaire, toutefois cette liaison serait faible. Les lavages s'avèrent suffisants pour briser le lien entre la protéine et l'anticorps. L'étiquette serait difficilement accessible dû à une congestion engendrée par les partenaires d'interaction et/ou une nouvelle conformation causée par des interactions entre l'étiquette et la protéine. L'utilisation d'une méthode alternative telle que le double hybride chez la levure ou l'utilisation du vecteur TAP serait à envisager. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Colocalisation, Co-immunoprécipitation, Cycle cellulaire, Cycline D2, Cycline D2 tronquée, Interactions protéine-protéine.

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 172-197.

Reproduction de : Thèse doctorat : Médecine. Biochimie et biologie moléculaire : Reims : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f.196-225.

Reproduction de : Thèse doctorat : Médecine. Sciences de la vie et de la santé : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p.128-157.

Thèse doctorat : Chimie : Strasbourg 1 : 2006. Thèse doctorat : Chimie : Milano-Bicocca - Italie : 2006. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.

Il est connu chez la levure Saccharomyces cerevisiae que la dégradation nucléaire est surtout impliquée dans les mécanismes de surveillance de la qualité des ARNs. Parmi les ribonucléases nucléaires, il existe l'endoribonucléase Rnt1p qui possède plusieurs fonctions notamment dans la maturation de l'ARN ribosomal. Cependant, sa délétion causait des défauts dans la progression du cycle cellulaire ainsi qu'une sensibilité à la température. Ces défauts ont été associés à deux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire HSL1 et SW14. L'analyse des niveaux d'ARNm de ces deux gènes a montré que ces derniers étaient surexprimés en absence de RNT1 et que l'ajout de Rnt1p recombinant à des extraits d'ARNm provenant d'une souche rntl [delta] provoquait une diminution de l'ARNm mature. Le rôle de Rnt1p dans la régulation de ces deux gènes a également été confirmé par des expériences analysant les niveaux des protéines encodées par ces gènes. La protéine Hsl1p étant impliquée dans le contrôle de la morphogénèse et donc du cycle cellulaire, et étant donné que la localisation de Rnt1p est également dépendante de celui ci, nous avons voulu examiner la possibilité que Rnt1p régule Hsl1p de façon dépendante du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons examiné l'impact de la délétion de Rnt1p sur l'expression de Hsl1p dans les différentes phases du cycle cellulaire. Par ailleurs, puisque Hsl1p possède deux fonctions à la fois dans le contrôle de la morphogénèse mais aussi dans la réponse au stress des parois, nous avons décidé d'étudier sa distribution dans le cycle cellulaire mais aussi l'impact de la régulation posttranscriptonnelle sur l'expression et la localisation de son ARNm dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons testé l'impact de trois délétions de ribonucléases nucléaires (Rnt1p et Rrp6p) et cytoplasmique (Xrnlp) afin de comprendre quel niveau de régulation était le plus important dans l'expression de l'ARNm Hsll. Nous avons utilisé pour cela une technique très sensible appelée FISH (fluorescent in situ hybridization) qui permet de détecter des ARNm individuels au sein de la cellule et d'en calculer le nombre dans chaque phase du cycle et dans chaque compartiment cellulaire (noyau et cytoplasme). Nos résultats ont montré que Rnt1p jouait un rôle très important dans l'expression et la localisation cycle cellulaire-dépendante de l'ARNm Hsll avec un impact marqué au niveau de la phase G2/M, alors que les autres délétions n'avaient pas d'effet sur l'expression cyclique de l'ARNm Hsl1.

L'épithélium intestinal est en constant renouvellement et les mécanismes qui contrôlent la prolifération y sont parfaitement orchestrés. Le facteur de transcription E2F4 est un régulateur clé de la transition G1/S, de la prolifération et de l'homéostasie des cellules épithéliales intestinales. Contrairement à E2F1, la localisation cellulaire d'E2F4 varie en fonction de l'état prolifératif des cellules : il est exprimé majoritairement au cytoplasme des cellules quiescentes ou différenciées et au noyau des cellules prolifératives. Dans cette thèse, les mécanismes de contrôle de la localisation d'E2F4, de sa phosphorylation et de son expression, de même que les mécanismes qui contrôlent l'entrée en phase S des cellules épithéliales intestinales normales humaines (HIEC) ont été analysés. Nos résultats démontrent que l'activation de la signalisation MEK/ERK par le sérum est requise pour la translocation nucléaire d'E2F4 et la transition G 1/S des HIEC. Par contre, la stimulation du sentier MEK/ERK par l'EGF n'est pas suffisante à induire ces événements: l'inhibition concomitante des GSK3?/? ou des p38?/? est aussi requise. En effet, la combinaison de l'EGF ou du FGF9 avec un inhibiteur pharmacologique des GSK3 entraîne la translocation nucléaire d'E2F4 et l'entrée en phase S. De manière analogue, l'inhibition des p38 en combinaison avec l'EGF cause aussi la translocation nucléaire d'E2F4 et l'entrée en phase S des HIEC. Par ailleurs, l'activation des IKK?/? semble aussi requise pour la translocation nucléaire d'E2F4 et la transition G1/S des HIEC induites par le sérum. Ensuite, nos résultats indiquent qu'E2F4 est rapidement phosphorylé suivant la stimulation par le sérum de manière dépendante du sentier MEK/ERK. Ainsi, des essais kinases in vitro démontrent qu'ERK1 phosphoryle efficacement E2F4, potentiellement sur les S244 et S384. Nos résultats suggèrent aussi que GSK3? interagit avec E2F4, principalement dans les cellules quiescentes, et pourrait alors le phosphoryler. Par ailleurs, E2F4 est phosphorylé, surexprimé et localisé au noyau des adénomes colorectaux humains. De plus, les mutants d'E2F4 retrouvés dans les cancers colorectaux avec instabilité des microsatellites, E2F4(Ser) 12 et E2F4(Ser)14 , sont plus fortement exprimés en raison d'une stabilité accrue et ont une meilleure activité transcriptionnelle. Nous démontrons aussi l'existence de 2 formes principales du partenaire d'interaction d'E2F4, DP-2, exprimées dans les HIEC: DP-2 40 , dont l'expression augmente avec l'entrée en phase S et DP-266 , dont l'expression diminue. De plus, DP-2 40 est surexprimée dans les cancers colorectaux humains et pourrait alors y favoriser la localisation nucléaire d'E2F4. En conclusion, nous avons identifié des mécanismes de régulation du facteur de transcription E2F4 et de l'entrée en phase S des HIEC. Cependant, ces mécanismes sont altérés lors de la carcinogenèse. D'ailleurs, la surexpression et la localisation aberrante d'E2F4 de même que la surexpression de DP-2 40 dans les cancers colorectaux pourraient contribuer à l'hyperprolifération et à la formation de cancers dans le côlon et le rectum. [symboles non conformes]

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Titre de l'écran-titre (visionné le 16 juin 2009). Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Les kinases dépendantes des Cyclines (Cdk) contrôlent le déroulement du cycle cellulaire, mais leur étude est difficile car des mécanismes de compensation se développent lorsqu'une Cdk est absente. Cdk2 est principalement impliquée dans la phase de réplication de l'ADN, cependant l'ablation génétique de Cdk2 chez la souris n'a pas d'effet sur leur développement: les fonctions de Cdk2 sont compensées par d'autres Cdk. L'inhibition chimique permet de bloquer une Cdk et de limiter les compensations. Pour étudier les rôles de Cdk2, nous l'avons inhibé avec NU6102 qui sélectif pour Cdk2 dans le modèle xénope. Nous avons aussi développé des mutants de Cdk2 résistants à NU6102 pour vérifier sa sélectivité et avons cherché à mieux comprendre les paramètres qui déterminent l'affinité entre Cdk2 et un ligand. D'autre part, nous déterminons in vitro que NU6102 serait plus sélectif pour Cdk2 que pour les autres Cdk chez l'humain, et avons décrit les phénotypes induits par cet inhibiteur dans les cellules humaines en cultures. Ces résultats ne permettent pas de confirmer la sélectivité de NU6102 mais montrent que NU6102 a des caractéristiques intéressantes pour être utilisé dans le traitement contre le cancer. L'activité des Cdk est essentielle à l'initiation de la réplication de l'ADN, mais aucun substrat essentiel n'a été identifié chez les métazoaires. Nous avons réalisé un crible des protéines chargées sur la chromatine en présence et en absence d'activité Cdk dans le modèle xénope, afin d'identifier des substrats qui pourraient être impliqués dans la réplication. Ces résultats suggèrent que l'activité Cdk, qui initie la réplication au niveau des origines de réplication de l'ADN, pourrait être impliquée dans d'autres fonctions cellulaires. / Cycline Dependant Kinases (Cdk) control cell cycle progression. The study of their roles is often difficult because of functional redundancy; when a given Cdk is absent, others may compensate. The main role of Cdk2 in the cell cycle is in the initiation of DNA replication, but absence of Cdk2 is compensated for by Cdk1. For example, mice with a genetic knockout of Cdk2 are viable. The chemical inhibition of Cdks may limit compensation by other Cdks. Therefore, to study Cdk2 roles, we have studied chemical inhibition by NU6102, which seems to be selective for Cdk2 in the Xenopus model. To verify the selectivity and study parameters that determine selectivity, we have designed and produced mutants of Cdk2 which are resistant to NU6102, allowing restoration of function in the presence of inhibitor. Moreover, we demonstrate in vitro that NU6102 is selective for Cdk2 compared to other human Cdks, and we describe phenotypes induced by NU6102 in cultured cells, which are interesting in the light of potential applications of NU6102 in cancer chemotherapy. Cdk activity is essential for initiation of DNA replication, but in metazoans no essential substrates are known. To identify potential Cdk substrates during DNA replication, we have performed a proteomics screen of the proteins loaded onto chromatin in the presence or absence of Cdk activity, in the Xenopus model. The results suggest that Cdk activity is not only required for assembling DNA replication complexes onto origins of replication, but may also be implicated in other cellular functions.