Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique,... Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire. Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale). Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes. Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc. Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.

Gene regulation allows cells to control their metabolism, growth, division and adaptation to environmental changes. Every step of the genetic information transmission chain is regulated. One of the targets of gene regulation is the mRNA that acts as an intermediate between DNA and proteins. Regulation of the mRNA can happen at the level of its synthesis, processing and degradation. The RNase III of Saccharomyces cerevisiae , Rnt1p, is a nuclear enzyme implicated in the processing of many non-coding RNAs. Rnt1p binds and cleaves double-strand RNA structures capped by NGNN tetra-loops. Such structures can also be found in many mRNAs. Cleavage within the coding sequence of a mRNA results in its degradation and thus contributes to negatively regulate the expression of its gene. The work presented in this thesis characterized the effects of the loss of Rnt1p in yeast. A first publication highlighted the relationship between the localization of this enzyme and cell cycle progression. A change in localization of Rnt1p from the nucleolus to the nucleoplasm contributes to passage through G2/M. A second publication focused on the interaction between Rnt1p and the rRNA transcription machinery. Rnt1p was found to interact with RNA pol I and to be implicated in its transcription termination. We also used Rnt1p as a tool to uncover mRNAs that are posttranscriptionaly regulated in the nucleus. The case studied in this work shows a role for this nuclear degradation mechanism towards promoting the robustness of the cell wall stress response.

Résumé : Le “Suppressor of cytokine signaling -1” (SOCS1) est une protéine de 24 kD qui fonctionne principalement comme un régulateur négatif des voies de signalisation intracellulaires. SOCS1 inhibe l’axe JAK-STAT et induit l’ubiquitylation et la dégradation de certaines protéines cibles. L’expression de SOCS1 est diminuée par l’hyperméthylation de son promoteur dans plus de 65% des cas de carcinome hépatocellulaire. Les souris déficientes en SOCS1 ne survivent que trois semaines après la naissance à cause d’une hyperinflammation induite par IFN-[gamma]. Afin d’étudier le rôle anti tumoral de SOCS1 dans le foie, nous avons utilisé les souris Socs1[indice supérieur -/-]Ifng[indice supérieur -/-], Ifng[indice supérieur -/-] et les souris de type sauvage. Nous avons démontré que le taux de la régénération du foie après une hépatectomie partielle était augmenté chez les souris déficientes en SOCS1. De plus, les souris Socs1[indice supérieur -/]-Ifng[indice supérieur -/-] étaient plus susceptibles pour le développement des nodules hépatiques suite à un traitement avec diethylnitrosamine (DEN). Par contre, les souris déficientes en IFN-[gamma] ont démontré une résistance contre le cancer du foie. Néanmoins, au contraire de nos attentes préliminaires, nous n’avons pas observé une augmentation des taux sériques d’IL-6. Pourtant, la prolifération compensatoire et la synthèse de l’ADN étaient élevées chez les souris SOCS1 KO. Afin d’expliquer cette observation, nous avons étudié l’activation de p53. Nous n’avons pas trouvé une réponse différente de stabilisation ni de phosphorylation de p53 (Ser15) après traitement au cisplatin (in vitro) ou DEN (in vivo). Par contre, nous avons observé que l’expression du gène Cdkn1a était élevée chez les hépatocytes déficients en SOCS1. De plus, l’expression ectopique de SOCS1 pouvait supprimer l’expression de p21 chez les cellules HepG2 traitées au cisplatin. Nous avons aussi constaté que la stabilité de p21 était augmentée chez les hépatocytes primaires déficients en SOCS1. En effet, SOCS1 induisait l’ubiquitylation et la dégradation de p21. SOCS1 pouvait interagir avec p21 par son domaine SH2. De plus, SOCS1 pouvait contrôler la localisation cytoplasmique de p21 en régulant l’activité d’AKT. Bien que p21 soit connu comme un inhibiteur du cycle cellulaire, il peut également participer à l’assemblage des complexes CDK4-Cyclin D. Nous avons démontré que l’expression de p21 et des cyclines de type D était augmentée chez les souris déficientes en SOCS1 après l’hépatectomie partielle. En diminuant l’expression de p21 par shRNA, nous avons empêché la réponse proliférative des hépatocytes SOCS1 KO. Finalement, nous avons trouvé que l’expression élevée de p21 chez les hépatocytes déficients en SOCS1 rendait les cellules plus résistantes contre l’apoptose. En conclusion, nos résultats suggèrent que SOCS1 protège contre le cancer du foie par la régulation des activités oncogéniques de p21. // Abstract : Suppressor of cytokine signaling - 1 (SOCS1) is an inducible 24 kD protein that principally acts as a negative regulator of different intracellular signaling pathways. SOCS1 exerts its regulatory feedback by blocking the JAK - STAT axis and inducing ubiquitylation and subsequent proteasomal degradation of target proteins. The gene coding for Socs1 has a CpG - rich promoter and can be methylated by methyltransferases. SOCS1 is silenced due to hypermethylation of its promoter in almost 65% of hepatocellular carcinoma cases. SOCS1 deficient mice cannot survive more than three weeks of age because of enhanced IFN - [gamma] induced inflammation. To better understand the tumor suppressor role of SOCS1 in the liver we used Socs1[superscript - / -]Ifng[superscript - / -], while Ifng[superscript - / -] and wild type mice served as controls. We found that SOCS1 deficient mice showed accelerated liver regeneration following standard partial hepatectomy (PH). Moreover, Socs1 null mice were susceptible to development of hepatic nodules after treatment with diethylnitrosamine (DEN). Interestingly, the IFN - [gamma] deficient mice showed reduced number of liver tumors. In contrast to our preliminary expectations, we did not observe elevated IL - 6 serum levels in SOCS1 deficient mice compared to the controls. Nevertheless, loss of SOCS1 was associated with increased compensator y proliferation and DNA synthesis after PH and DEN treatment. To find an explanation for the increased tumorigeneis in the SOCS1 deficient liver, we examined the activation of p53 and its target genes. Although we observed neither a variable phosphorylation (Ser15), nor an impaired stabilization of p53 after cisplatin ( in vitro ) or DEN treatment ( in vivo ), Cdkn1a expression was increased in the absence of SOCS1. We also found that ectopic expression of SOCS1 could suppress the mRNA levels of p21 in HepG2 cells treated with cisplatin. In addition, we found that loss of SOCS1 increased p21 stability in hepatocytes and that SOCS1 could induce p21 ubiquitylation and subsequent proteasomal degradation. We showed that SOCS1 could bind directly to p21 via its SH2 domain. Furthermore, in SOCS1 deficient hepatocytes, p21 was retained in the cytosol in an AKT dependent fashion. While classically known as a cell cycle inhibitor, p21 can promote the assembly and kinase activity of CDK4 - cyclin D complexes. We showed that D - type cyclins and p21 levels were increased in the liver of SOCS1 deficient mice following PH. Suppression of p21 by transient shRNA transfection in SOCS1 deficient primary hepatocytes could reverse their increased proliferative response to mitogens. Finally, we found that increased p21 expression in SOCS1 deficient hepatocytes renders them resistant to apoptosis. In conclusion, our findings suggest that SOCS1 protects against liver cancer via inhibiting the oncogenic potential of p21.

La chromatine est l'assemblage du matériel génétique, l'ADN et de protéines appelées histones. En plus de leur fonction d'entreposage du génome, ces dernières régulent l'accessibilité de l'ADN aux divers facteurs de régulation. Le variant d'histone H2A.Z est incorporé autour des promoteurs réprimés chez Saccharomyces cerevisiae. Ce variant semble impliqué dans la préparation des gènes réprimés. Cette préparation permet une expression rapide de ces gènes selon les conditions régulant leur activation. Bien qu'il soit essentiel à la viabilité chez les eucaryotes supérieurs, la délétion du gène HTZ1 n'est pas létale chez la levure. Celle-ci engendre cependant plusieurs phénotypes sévères, dont un ralentissement du cycle cellulaire et une sensibilité accrue à divers agents pharmacologiques. Par exemple, la caféine entraîne un arrêt en phase G1 chez le mutant. Cet arrêt correspond au point de contrôle du cycle cellulaire le plus important, le point de départ (START). Il est régulé de façon très stricte par la croissance et la taille des cellules. Lorsque toutes les conditions prolifératives sont réunies, une cascade positive active la cycline-kinase Cdc28 couplée à la cycline Cln3. Celles-ci phosphorylent l'inhibiteur (Whi5) du complexe de facteur de transcription responsable de l'induction des cyclines de la phase G1. Ce complexe, SBF, est normalement déjà lié aux promoteurs de ces cyclines et prépare le gène à une induction forte et rapide au moment opportun.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La lysine méthyltransférase PR-Set7 est responsable de la monométhylation de la lysine 20 de l'histone H4 (H4K20me1). Son expression varie au cours du cycle cellulaire. D'un niveau peu élevé en phase S, l'enzyme atteint un niveau maximum au cours de la mitose. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de PR-Set7 et les raisons de cette régulation au cours du cycle. Présentés sous forme de publication, les résultats de ma thèse montrent que PR-Set7 induit un signal H4K20me1 au niveau des origines de réplication pendant la mitose, ce qui permet le recrutement des complexes de pré-réplication (Pre-RC) contenant les facteurs nécessaires à la formation des fourches de réplication lors la phase S suivante. En effet, la présence de PR-Set7 sur une séquence d'ADN spécifique est suffisante pour induire le co-recrutement des protéines du complexe Pre-RC, tandis que l'inactivation de l'enzyme conduit au contraire à un défaut d'assemblage de ces complexes suivi d'un stress réplicatif. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée par le complexe Cul4-DDB1, via son interaction avec la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition du signal H4K20me1 des origines et l'inhibition des complexes Pre-RC, s'assurant ainsi que les origines sont actives une seule fois par cycle cellulaire. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la maintenance du signal H4K20me1 et une activation répétée des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). L'ensemble de mes résultats établissent PR-Set7 et le signal H4-K20me1 comme un nouveau mécanisme épigénétique de contrôle des origines de réplication chez les mammifères. / The lysine methyltransferase PR-Set7 is responsible of the monomethylation of lysine 20 of histone H4 (H4K20me1). Its expression is cell-cycle regulated. With weak levels in S phase, this enzyme reach a peak level during mitosis. My PhD project was to characterize the functions of PR-Set7 and the reasons underlying its cell-cycle regulation. Presented as publications, my results show that PR-Set7 induces H4K20me1 on replication origins during mitosis, which allows recruitment of pre-replication complexes (Pre-RC) containing all the factors required to create replication forks during the next S phase. Indeed, the presence of PR-Set7 on a specific DNA sequence is sufficient to induce the co-recruitment of Pre-RC complex proteins, whereas the inactivation of this enzyme leads to defects in the assembly of these complexes followed by a replicative stress. During S phase, PR-Set7 is degraded par the Cul4-DDB1 complex through its association with PCN A. This degradation induces the disappearance of H4K20me1 on origins and inhibition of Pre-RC complexes, ensuring that origins are activated only once per cell cycle. Mutations in the interaction domain with PCNA are sufficient to prevent PR-Set7 degradation, leading to the maintenance of H4K20me1 and a multiple activation of origins during S phase (over-replication phenotype). My results establish PR-Set7 and H4K20me1 as a new epigenetic mechanism to control replication origins in mammals.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La réplication de l'ADN au cours de la phase S est initiée au niveau de sites spécifiques, appelés origines de réplication, qui sont distribués de manière adéquate le long des chromosomes et actifs une seule fois par cycle cellulaire. Les mécanismes qui contrôlent la position des origines de réplication restent énigmatiques chez les mammifères. Les travaux réalisés pendant cette thèse révèlent que la lysine méthyltransférase PR-Set7 humaine, responsable de la mono-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4, induit un réarrangement chromatinien au niveau des nombreuses origines de réplication des gènes actifs. Celui-ci est caractérisé par la mono- et tri-méthylation de la lysine 20 de l'histone H4 et la tri-méthylation de la lysine 4 de l'histone H3. Ce profil de méthylation d'histones constituerait un signal épigénétique pour le recrutement sur la chromatine des facteurs nécessaires à la formation des origines de réplication, indépendamment d'un rôle sur la transcription. En effet, la présence d'une forme active de PR-Set7 en amont d'un gène rapporteur est suffisante pour induire cette cascade de méthylation et la formation d'une nouvelle origine de réplication au niveau de ce gène sans en modifier son expression. De la même manière, l'inactivation de l'enzyme dans une cellule conduit à l'inverse à une diminution du nombre total d'origines sans un effet majeur sur l'expression des gènes. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée via le complexe E3 ligase CRL4Cdt2 et la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition au niveau de la chromatine du signal de formation des origines, s'assurant ainsi qu'elles sont actives une seule fois par cycle. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante en effet pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la formation et activation répétées des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). Ces résultats établissent la cascade de méthylation initiée par PR-Set7 pendant la mitose comme le mécanisme épigénétique contrôlant la mise en place et l'activation d'au moins la moitié des origines de réplication chez les mammifères. / In order to ensure accurate inheritance of genetic information through cell proliferation, chromosomes must be precisely copied once and only once and then correctly distributed to daughter cells. Chromosome replication occurs during the S phase of the cell cycle and is initiated at discrete chromosomal sites called replication origins. However, the ability to activate replication origins occurs during mitosis of the previous cell cycle and continuing into early G1 phase. This crucial step, called DNA replication licensing, consists of the assembly of a multi-protein pre-Replicative Complex (pre-RC) onto origins, making them competent for replication. During S phase, pre-RC are inhibited by different ways, that ensures that origins are activated only once per cycle and prevents DNA rereplication (multiple initiations from the same origin). In metazoans, functional replication origins do not show defined DNA consensus sequences, thus evoking the involvement of chromatin determinants in the selection of these origins.During my thesis, I have discovered that that the onset of licensing in mammalian cells coincides with an increase in histone H4 Lysine 20 monomethylation (H4K20me1) at replication origins by the methyltransferase PR-Set7. By genome mapping of H4-20me1 signals during the cell cycle, we found that nearly half of origins that fire during S phase are associated with H4-K20me1 during mitosis, when the process of replication licensing is activated. This mitotic H4-K20me1 signature is highly significant for origins located near transcription start sites and promoters that are characterized by the presence of CpG islands and H3-K4me3 signals. Furthermore, tethering PR-Set7 methylase activity to an origin-free genomic locus is sufficient to promote a chromatin remodeling follow by a creation of a functional origin of replication and promotes replication initiation. PR-Set7 and H4K20me1 are cell-cycle regulated, with high levels during M and early G1 and very low in S phase. At the onset of S phase, PR-Set7 undergoes an ubiquitin-mediated proteolysis, which depends on its interaction with the sliding-clamp protein PCNA and involves the ubiquitin E3 ligase CRL4-Cdt2. Strikingly, expression of a PR-Set7 mutant insensitive to this degradation causes the maintenance of H4K20me1 and repeated DNA replication at origins. This photolytic regulation controls the initiation of replication origin.This suggests that a cascade of lysine methylation events, initiated by PR-Set7 during mitosis, would define the position of origins in open chromatin structures.

Les Kinases cycline-dépendantes (CDK / cyclines) jouent un rôle majeur dans la régulation de la progression du cycle cellulaire et la prolifération des cellules cancéreuses, et constituent ainsi des cibles d'intérêt pour le développement de stratégies de diagnostic et thérapeutiques anticancéreuse. L'objectif de cette étude a consisté à développer une famille de biosenseurs fluorescents pour mesurer l'activité des CDK/ cycline in vitro, in cellulo et in vivo.Nous avons conçu et développé un biosenseur polypeptidique sensible à l'environnement comprenant une séquence substrat des CDKs, qui est marquée avec une sonde fluorescente sensible à l'environnement à proximité du site de phosphorylation, et un domaine de liaison phospho-amino acide, qui se lie à la séquence du substrat lorsqu'il est phosphorylé, ce qui modifie l'environnement de la sonde fluorescente et conduit par conséquent à l'augmentation de la fluorescence. Plusieurs variants de ce premier biosenseur CDKACT ont été développés. Les biosenseurs ont d'abord été caractérisés in vitro en utilisant plusieurs complexes CDK / cycline recombinants et avec des CDK / cyclines endogènes à partir d'extraits cellulaires, induisant des changements dynamiques de l'intensité de fluorescence, qui ont été mesurés en temps réel. Nous avons caractérisé la spécificité de ces biosenseurs pour les kinases CDK/ cycline par rapport à d'autres kinases (Plk1, Plk3, CIV, PKA, MAPK). En outre ces biosenseurs permettent de mesurer des différences dans l'activité des CDK/Cyclines entre différentes lignées cellulaires saines et cancéreuses. Enfin, nous avons mis en place les conditions pour internaliser ces biosenseurs dans des cellules vivantes grâce à des formulations de peptides pénétrants, afin de mesurer l'activité des CDK / cycline en temps réel. L'imagerie time-lapse et la quantification ratiométrique de fluorescence de la sonde sensible à l'environnement par rapport à une sonde fluorescente standard a permis de suivre l'activité des CDK/ cycline au cours du cycle cellulaire de cellules en division, des cellules ne se divisant pas et des cellules traitées avec des inhibiteurs des CDK / cycline. Les biosenseurs ont également été utilisé pour établir des conditions nécessaires à réaliser un criblage haut débit et des essais d'imagerie in vivo dans des modèles de souris comportant des xénogreffes. / Cyclin-dependent kinases (CDK/Cyclins) play central roles in regulation of cell cycle progression and proliferation of cancer cells, thereby constituting attractive targets for development of cancer diagnostics and therapeutics. The objective of this study consisted in developing a family of fluorescent biosensors to probe CDK/Cyclin activity in vitro, in cellulo and in vivo. To this aim, we designed and engineered an environmentally sensitive polypeptide sensor consisting of a CDK substrate sequence labelled with an environmentally-sensitive dye proximal to the phosphorylation site, and a phospho-amino acid binding domain, which binds the substrate sequence when it is phosphorylated, thereby altering the environment of the fluorescent probe and consequently leading to fluorescence enhancement. Several variants of this first CDKACT biosensor were further engineered. The biosensors were first characterized in vitro using several recombinant CDK/Cyclin complexes and endogenous CDK/Cyclins from cell extracts, inducing dynamic changes in fluorescence intensity, which were measured in real-time. We further characterized the specificity of these biosensors for CDK/Cyclin kinases as opposed to other kinases (Plk1, Plk3, CIV, PKA, MAPK). We further applied CDK biosensors to measure CDK/Cyclin kinase activity between different healthy and cancer cell lines. Finally, we established conditions to deliver the biosensors into living cells thanks to cell-penetrating peptide formulations, to monitor CDK/Cyclin activity in real time. Time-lapse imaging and ratiometric quantification of fluorescence of the environmentally sensitive probe over that of a fluorescent standard allowed to monitor CDK/Cyclin activity throughout the cell cycle of dividing cells, non-dividing cells and cells treated with CDK/Cyclin inhibitors. The biosensors were further applied to establish conditions for a high throughput screen and an in vivo imaging assay using xenografted mouse models.