Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The cell cycle is an orchestrated mechanism ensuring cell division and differentiation to form multicellular organisms as well as to promote tissue homeostasis and regeneration. To secure correct cell division end ensure genome integrity for the next cell generation, the cell cycle must be strictly controlled. As part of this control cells have to adequately respond to the intra- and extracellular environment. Among the key molecules mediating the exchange of information from the surrounding environment are reactive oxygen species (ROS). ROS are small oxygen species, which control cellular signaling pathways through reductive-oxidative (redox) reactions with cellular proteins. For instance, mitogen signaling is sustained through ROS production by the NADPH oxidases in order to pass the information to proliferate or not to proliferate onto downstream cascades. Furthermore, cellular processes enabling proliferation and thus cell cycle progression require a level of high energy. Here, the cell cycle machinery meets mitochondria. Mitochondrial metabolism is the basis of aerobic respiration, the mechanism which supplies cells with energy and metabolites important for protein and DNA synthesis. By-products of mitochondrial metabolism as a result of incomplete reduction of oxygen are ROS molecules. Whether produced as metabolic by-product by mitochondria or as a growth factor stimulant by NADPH oxidases, many studies have demonstrated the broad influence of ROS on signaling pathways. When looking at ROS in context of cell division, ROS levels have been proposed to oscillate as cells progress through individual cell cycle phases. Perturbations of the cellular redox environment affect cell cycle progression and depending on the perturbation, may promote proliferation, cell cycle arrest or cell death. Thus, the interplay between redox mechanism and the cell cycle appears to be key to cell cycle decision making. Although the mechanisms of how ROS regulate proliferation-related proteins such as growth factor receptors or protein tyrosine phosphatases are known, the mechanisms of how ROS influence the cell cycle core machinery remain to be fully uncovered. To investigate the interplay between redox signaling and the cell cycle, I took advantage of approaches that allowed me to visualize and study changes in both systems at the same time. I visualized ROS dynamics in physiological and unperturbed conditions in non-transformed cells using redox specific dyes and indeed, observed that the levels of ROS oscillate during the cell cycle. ROS changes are characterized by basal levels in G1 phase and increased levels in S and G2 phases. My data provide evidence that ROS oscillations mainly originate from ROS produced by mitochondria. To investigate cause-consequence relations between ROS and the cell cycle I interfered with the cellular redox environment and studied the effect on cell cycle progression. Firstly, I discovered that the protein levels of NADPH oxidase 4 (NOX4), the enzyme producing ROS in response to mitogens, decrease shortly before cells enter S phase. Because NOX4 is constitutively active and its regulation is not known, this observation suggests that there is a mechanism of cell cycle-dependent NOX4 regulation that is important for entry into S phase. Secondly, I showed that reduction of ROS production by decreasing metabolites important for their production slowed proliferation due to prolonged S phase. This allowed me to establish that the main S phase regulator Cdk2 is a redox regulated cell cycle protein. Precisely, full phosphorylation of threonine 160 (T160) in the activatory segment of Cdk2, which is required for full Cdk2 activity was promoted by ROS derived from mitochondria. Furthermore, using a chemo-selective probe for cysteine oxidation I showed that Cdk2 is directly oxidized by ROS. Mutating the only surface exposed cysteine of Cdk2, C177, resulted in a change of Cdk2 binding to KAP, the phosphatase responsible for removing T160 phosphorylation. I found that only in reductive conditions KAP bound to Cdk2 resulting in Cdk2 dephosphorylation and thus reduced activity. In contrast oxidative conditions abolished the interaction between KAP and Cdk2. Thus, I propose a model of redox-dependent regulation of Cdk2 whereby the increase of mitochondrial ROS during S phase negatively regulates the Cdk2-KAP interaction to enable full activation of Cdk2 necessary for cells to rapidly progress through S phase. Altogether, in my thesis I investigated the link between mitochondrial ROS production and the cell cycle machinery and identified a mechanism of how increased levels of ROS drive the cell cycle. Furthermore, I outlined a potential cell cycle-dependent regulation of the NOX4 protein, which might provide a step towards understanding of its regulation. Thus, my thesis provides new views on the interplay between the redox system and the cell cycle machinery.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix / Der Zellzyklus ist ein komplexer Mechanismus, der Zellteilung und Differenzierung in mehrzelligen Organismen, sowie die Homöostase und die Regeneration von Geweben gewährleistet. Um eine korrekte Zellteilung zu ermöglichen und die Integrität des Genoms für die nächste Zellgeneration sicherzustellen, muss der Zellzyklus streng kontrolliert werden. Im Rahmen dieser Kontrolle müssen die Zellen angemessen auf die intra- und extrazellulären Umgebungen reagieren. Zu den Schlüsselmolekülen, die den Austausch von Informationen aus der Umgebung vermitteln, gehören reaktive Sauerstoffspezies (ROS). ROS enthalten Sauerstoff und kontrollieren durch reduktiv-oxidative (Redox-) Reaktionen mit zellulären Proteinen viele verschiedene zelluläre Signalwege. So wird beispielsweise die Proliferation aufgrund von Wachstumssignalen durch die Produktion von ROS durch NADPH-Oxidasen ermöglicht, da sie die Information, ob eine Zellteilung stattfinden soll oder nicht, an nachgeschaltete Kaskaden weiterleiten. Darüber hinaus benötigen zelluläre Prozesse, die den Fortgang des Zellzyklus ermöglichen, ein hohes Energieniveau. Hier trifft die Zellzyklusmaschinerie auf die Mitochondrien. Der mitochondriale Stoffwechsel ist die Grundlage der aeroben Atmung, des Mechanismus, der die Zellen mit Energie und Metaboliten versorgt, die für die Protein- und DNA-Synthese notwendig sind. Als Nebenprodukte des mitochondrialen Stoffwechsels entstehen dabei häufig ROS, die aus der unvollständigen Reduktion von Sauerstoff resultieren. Unabhängig davon, ob sie als Nebenprodukte des Stoffwechsels in den Mitochondrien oder als wachstumsfördernde Substanzen in den NADPH-Oxidasen entstehen, viele Studien haben den weitreichenden Einfluss von ROS auf zahlreiche Signalwege gezeigt. Betrachtet man ROS im Zusammenhang mit der Zellteilung, so wird angenommen, dass die ROS-Konzentration mit dem Durchlaufen der einzelnen Zellzyklusphasen schwankt. Störungen der zellulären Redoxumgebung wirken sich auf den Verlauf des Zellzyklus aus und können je nach Störung Proliferation, Stillstand des Zellzykluses oder Zelltod fördern. Das Zusammenspiel zwischen Redox-Mechanismen und dem Zellzyklus scheint also der Schlüssel zur Entscheidungsfindung im Zellzyklus zu sein. Obwohl die Mechanismen, mit denen ROS essentielle Proteine wie Wachstumsrezeptoren oder Protein-Tyrosin-Phosphatasen regulieren, bekannt sind, sind die Mechanismen, mit denen ROS die Kernmaschinerie des Zellzyklus beeinflussen, noch nicht vollständig aufgeklärt. In der hier vorliegenden Arbeit nutzte ich daher Ansätze, die es mir ermöglichten, Veränderungen im Zellzklus, als auch Veränderungen in Redox-Signalen und deren Zusammenspiel gleichzeitig zu untersuchen. Ich habe die Dynamik reaktiver Sauerstoffspezies unter physiologischen und ungestörten Bedingungen in nichttransformierten Zellen mit redox-spezifischen Farbstoffen visualisiert und beobachtet, dass die ROS-Konzentrationen während des Zellzyklus oszillieren. Die Veränderungen der ROSKonzentrationen sind durch einen Grundwert in der G1-Phase und erhöhte Werte in der Sund G2-Phase gekennzeichnet. Meine Daten belegen, dass ROS-Oszillationen hauptsächlich von ROS herrühren, die von den Mitochondrien produziert werden. Um die Ursache-Folge-Beziehungen zwischen ROS und dem Zellzyklus zu untersuchen, habe ich in die zelluläre Redox-Balance eingegriffen und die Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus untersucht. Zunächst entdeckte ich, dass die Proteinkonzentration der NADPHOxidase 4 (NOX4), des Enzyms, das ROS als Reaktion auf Wachstumsfaktoren produziert, kurz vor dem Eintritt der Zellen in die S-Phase abnimmt. Da NOX4 konstitutiv aktiv ist und seine Regulierung nicht bekannt ist, deutet diese Beobachtung darauf hin, dass es einen zellzyklusabhängigen Mechanismus der NOX4-Regulierung gibt, der für den Eintritt in die S-Phase wichtig ist. Zweitens konnte ich zeigen, dass die Verringerung von Metaboliten zu einer Verringerung der ROS-Produktion führt, welches die Proliferation aufgrund einer verlängerten S-Phase verlangsamt. Dadurch konnte ich feststellen, dass Cdk2, der wichtigste S-Phasen-Regulator, ein redoxreguliertes Zellzyklusprotein ist. Genauer gesagt wurde die vollständige Phosphorylierung von Cdk2 am Threonin 160 (T160), welche für die volle Cdk2-Aktivität erforderlich ist, durch ROS aus Mitochondrien gefördert. Außerdem konnte ich mit einer chemo-selektiven Probe für Cysteinoxidation zeigen, dass Cdk2 direkt durch ROS oxidiert wird. Die Mutation des einzigen exponierten Cysteins von Cdk2, C177, führte zu einer Veränderung der Bindung von Cdk2 an KAP, die Phosphatase, die für die Aufhebung der T160-Phosphorylierung verantwortlich ist. Ich fand heraus, dass KAP nur unter reduktiven Bedingungen an Cdk2 bindet, was zu einer Dephosphorylierung von Cdk2 und damit zu einer verringerten Aktivität führt. Unter oxidativen Bedingungen hingegen wurde die Interaktion zwischen KAP und Cdk2 aufgehoben. Daher schlage ich ein Modell der redoxabhängigen Regulierung von Cdk2 vor, bei dem der Anstieg der mitochondrialen ROS während der S-Phase die Interaktion zwischen Cdk2 und KAP negativ reguliert, um eine vollständige Aktivierung von Cdk2 und damit eine erfolgreiche S-Phase zu ermöglichen. Insgesamt habe ich in meiner Dissertation die Verbindung zwischen mitochondrialer ROS-Produktion und der Zellzyklusmaschinerie untersucht und einen Mechanismus identifiziert, wie erhöhte ROS-Konzentrationen den Zellzyklus antreiben. Darüber hinaus habe ich die zellzyklusabhängige Regulierung des NOX4-Proteins aufgezeigt, was neue Einblicke zum Verständnis der Zellzykluskontrolle durch ROS gewährt. Somit bietet meine Arbeit neue, interessante Erkenntnisse für das Zusammenspiel zwischen dem Redoxsystem und der Zellzyklusmaschinerie.:1. Introduction 1.1 Reactive oxygen species (ROS) 1.1.1 ROS and signal transduction 1.1.2 Antioxidant systems 1.1.3. Redox homeostasis, oxidative and reductive stress 1.2 ROS producing mechanisms 1.2.1 Mitochondria 1.2.2 NADPH oxidases 1.3 The cell cycle 1.4. ROS and the cell cycle 1.5 Aims of the thesis 2. Results 2.1 CellRox, a ROS sensitive dye, reveals redox changes during the cell cycle progression 2.2 Investigating the role of NADPH oxidases in cell cycle progression 2.2.1 General NOX inhibition causes defect in proliferation and suggests G1 phase delay 2.2.2 NOX4 and NOX1 specific inhibition causes a G1 delay or arrest 2.2.3 Specific down-regulation of NOX4 might have a negative impact on cell proliferation 2.2.4 NOX4 over-expression affects proliferation 2.2.5 NOX4 expression drops at G1 and S phase transition 2.3 Cell cycle dependent ROS oscillations correlate with mitochondria ROS production 2.4 Interference with mtROS decreases proliferation on the level of S phase 2.4.1 MitoTempo negatively affects proliferation and decreases population of EdU positive cells 2.4.2 Genetic interfering with mtROS production results in affected Cdk2 activation 2.5 Redox dependent Cdk2 activation via KAP binding 2.5.1 BTD labeling reveals Cdk2 as a direct target for oxidation 2.5.2 Preventing Cdk2 oxidation of cysteine 177 results in a drop of T160 phosphorylation 2.5.3 KAP binds to Cdk2 in a redox dependent manner 3. Discussion 3.1 ROS levels oscillate during the cell cycle in physiological cell culture conditions 3.2 Expression levels of NOX4 might determine the entry into S phase 3.3 Mitochondria are the main source of redox oscillations during the cell cycle 3.4 mtROS production contributes to Cdk2 activation and thus drives S phase progression 3.5 KAP phosphatase contributes to redox dependent regulation of Cdk2 3.6. Model of interconnection between the cellular redox environment and cell cycle regulation 4. Materials and methods 4.1 Cell culture 4.1.1 Cell lines 4.1.2 Cell treatments 4.1.3 Plasmids and cell line generation 4.1.4 RNA interference (RNAi) 4.1.5 EdU incorporation assay 4.2 Quantitative PCR (qPCR) 4.3 Protein studies 4.3.1 Cdk2-KAP/CAK interaction 4.3.2 Cdk2 sulfenylation by BTD labeling 4.4 SDS-PAGE and Western blot analyses 4.4.1 Total lysate preparation 4.4.2 SDS-PAGE 4.4.3 Western blotting 4.5 Flow cytometry analysis (FACS) 4.6 Hypoxia experiments 4.7 Microscopy 4.8 Automated image and data analysis 4.9 Statistical methods 5. Contributions 6. Bibliography 7. Acknowledgements 8. Appendix