The cytochrome P450 enzymes (CYPs) are very attractive biocatalysts because of their ability to regio- and stereo-selectively catalyze the insertion of a single atom of molecular oxygen into inactivated C-H bonds. There are many drawbacks, however, limiting the use of these enzymes in organic synthesis, including the need for expensive cofactors, low stability, and low tolerance to organic solvents. The goal of this thesis was to overcome some of these drawbacks for human CYP2D6. This isoform was selected because of its broad substrate promiscuity and high importance in drug metabolism. / We have tested inexpensive chemicals to replace the natural cofactors of CYP2D6, NADPH and cytochrome P450 reductase (CPR). The results showed that cumene hydroperoxide and tert-butyl hydroperoxide can successfully substitute CPR and NAD(P)H with retained regio- and stereo-selectivity. Moreover, with these surrogates, product formation and initial rates are increased by as much as two fold compared to the use of the natural cofactors. / It is widely accepted that even small proportions of organic solvents in the buffer can deactivate most enzymes including P450s. Our studies on the biocatalysis of CYP2D6 in organic solvent/buffer emulsions showed that under the optimized conditions, as much as 76% of the enzyme activity was retained. Product formation in biphasic solvent systems is comparable whether the natural redox partner and cofactor are used, or a surrogate. In addition, a correlation was observed between the log P and the suitability of a solvent for enzymatic activity, with higher log P resulting in higher enzymatic activity. These results were obtained with dextromethorphan (DXM), a water soluble substrate. A very hydrophobic substrate, 7-benzyloxy-4-N,N-diethylaminomethyl-coumarin (BDAC), was also tested successfully to demonstrate the utility of this method. / Lyophilization is usually required to remove water before using enzymes in nearly anhydrous solvents. This physical process is harmful to P450 enzyme activity. We therefore tested numerous sugars as lyoprotectant during lyophilization. Addition of trehalose or sucrose before lyophilization allowed the retention of 80% of the CYP2D6 activity, compared to 40% remaining activity in its absence. CYP2D6 co-lyophilized with trehalose was next tested in selected hydrophobic organic solvents in the absence of water. The enzymatic activity was found to strongly depend on the hydrophobicity of the solvent. Interestingly, the enzyme showed higher catalytic ability in n-decane or n-dodecane than in the standard buffer. This was unexpected considering that the activity of most enzymes was reported to decrease to 10% or less in nearly anhydrous organic solvents. / The last objective of this thesis was to improve the stability and/or activity of CYP2D6. Use of DNA self-assemblies to encapsulate P450 enzymes was envisaged to potentially increase their stability. Indeed, DNA assemblies have many advantages compared to traditional solid supports reported for enzymes. Our preliminary results showed that CYP2D6 templated the formation of cyclic DNA dimeric and tetrameric over polymeric self-assemblies. Characterization of the CYP2D6 activity in the presence of the DNA self-assemblies revealed no loss of activity or stability.

Reports have linked atypical antipsychotics (AAPs) with weight gain. The polymorphic CYP2D6 involved in metabolism has been associated with medication morbidity. Eleven subjects receiving olanzapine were genotyped for CYP2D6 to examine the relationship between 2D6 and AAP weight gain. Using a linear regression, the dependent variable was percent change in body mass index (BMI). Genotype, dose and duration of treatment were independent. Genotype was significant (P < 0.0097) for those with a *1/*3 or *4 genotype experiencing a larger percent BMI change than those with a *1/*1 genotype. This may be due to increased olanzapine concentrations leading to increased exposure, which may trigger AAP weight gain.

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A doença renal crônica (DRC) está associada com inibição de sistemas enzimáticos e de transportadores de fármacos. O nebivolol, um bloqueador de terceira geração, seletivo para receptores 1 adrenérgicos e com atividade vasodiladora, é metabolizado principalmente por hidroxilação aromática dependente do CYP2D6, hidroxilação alicíclica e por glicuronidação. O estudo avalia a influência da DRC estágios 3 e 4 e da hemodiálise na farmacodinâmica e na farmacocinética dos isômeros do nebivolol. Os pacientes investigados divididos nos Grupos controle (n=12), DRC estágios 3 e 4 (n=12) e Hemodiálise (n=11) receberam dose única p.o. de 10 mg de nebivolol racêmico. As amostras seriadas de sangue foram coletadas até 48h após a administração do fármaco. Em cada tempo de colheita de sangue, a frequência cardíaca foi avaliada na situação de exercício isométrico durante 2 min com o handgrip, a 30% da contratilidade voluntária máxima. Todos os pacientes foram fenotipados como metabolizadores rápidos do metoprolol, exceto um paciente do Grupo controle fenotipado como metabolizador lento. Os isômeros do nebivolol foram analisados em plasma como concentração total empregando LC-MS/MS e coluna de fase quiral. O método foi linear no intervalo de concentrações de 25-2500 pg de cada isômero do nebivolol/mL de plasma. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados empregando o programa WinNonlin. O teste de Wilcoxon foi empregado para avaliar as razões isoméricas diferentes da unidade (p<0,05) e o teste de Kruskal-Wallis foi empregado para comparar os parâmetros farmacocinéticos entre os três Grupos investigados. A disposição cinética do nebivolol nos pacientes do Grupo controle é enantiosseletiva com acúmulo plasmático (Cmax 1,32 vs 0,88 ng/mL e AUC0-¥ 8,02 vs 4,25 ng.h/mL), menores valores de clearance oral aparente (623,58 vs 1176,40 L/h) e menores valores de volume aparente de distribuição (5383,30 e 6397,70 L) para o isômero lnebivolol. Os parâmetros farmacocinéticos do l-nebivolol e d-nebivolol para os pacientes do Grupo DRC (n=12) permitem inferir, à semelhança do Grupo controle, maiores valores de Cmax e AUC (Cmax 2,40 vs 1,67 ng/mL e AUC0- 10,20 vs 8,37 ng.h/mL) e menores valores de clearance oral aparente (491,51 vs 604,58 L/h) e de volume aparente de distribuição (3527,00 e 5232,50 L) para o isômero l-nebivolol. Semelhante aos Grupos controle e DRC, o Grupo Hemodiálise também apresenta enantiosseletividade com acúmulo acúmulo plasmático (Cmax 1,35 vs 0,78 ng/mL e AUC0- 6,74 vs 4,50 ng.h/mL), menores valores de clearance oral aparente (742,26 vs 1112,10 L/h) e menores valores de volume aparente de distribuição (5704,70 vs 9477,10 L) para o isômero l-nebivolol. A farmacocinética dos isômeros do nebivolol no paciente investigado do Grupo controle, fenotipado como metabolizador lento, difere dos dados apresentados para os pacientes do Grupo controle (n=11), Grupo DRC (n=12) e Grupo Hemodiálise (n=11), fenotipados como metabolizadores rápidos, com observação de razão isomérica de AUC l/d de 4,77 e redução nos valores de clearance oral aparente de ambos os isômeros do nebivolol (67,24 vs 122,07 L/h, respectivamente para os isômeros l-nebivolol e d-nebivolol). Concluindo, a DRC estágios 3 e 4 e a Hemodiálise não alteram a farmacocinética de ambos os isômeros do nebivolol, o volume aparente de distribuição de ambos os isômeros do nebivolol não mostra correlação com o peso dos pacientes, assim como os valores de clearance aparente de ambos os isômeros não mostram correlação com o peso ou com os valores de clearance da creatinina dos pacientes investigados. No entanto, os valores de clearance aparente de ambos os isômeros do nebivolol mostram correlação significativa com a atividade do CYP2D6 avaliada através da RMplasma ix metoprolol/-hidroximetoprolol. A análise PK-PD foi realizada incluindo os 34 pacientes fenotipados como metabolizadores extensivos. O modelo Emax inibitório descreveu a análise PK-PD empregando a variação da frequência cardíaca como parâmetro farmacodinâmico em função das concentrações plasmáticas do d-nebivolol, resultando em valores de Emax de 15,42 bpm e de EC50 de 2,26 ng/mL, seguindo a administração de dose única oral de 10 mg de nebivolol racêmico. / Chronic kidney disease (CKD) is related to inhibition of enzyme systems and drug transporters. Nebivolol, a third generation -blocker, is a selective 1-adrenoceptor antagonist and has vasodilatory properties. It undergoes aromatic hydroxylation through the CYP2D6, alicyclic hydroxylation and glucuronidation. The study evaluates the influence of CKD stages 3 and 4 and hemodialysis on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of nebivolol isomers. The investigated patients were divided into 3 groups: control group (n = 12), CKD stages 3 and 4 (n = 12) and hemodialysis (n = 11). They received a single oral dose of 10 mg of racemic nebivolol and serial blood samples were collected up to 48h. At each time of blood sampling, heart rate was assessed in the situation of isometric exercise during 2 min with handgrip at 30% of maximal voluntary contractility. All patients were phenotyped as extensive metabolizers (EM) of metoprolol, except one patient in the control group phenotyped as poor metabolizer (PM). The isomers of nebivolol were analyzed in plasma samples by LC-MS/MS using a chiral phase column. The method was linear over the concentration range of 25-2500 pg of each isomer of nebivolol/mL of plasma. Pharmacokinetic parameters were calculated using the WinNonlin program. The Wilcoxon test was used to assess isomeric ratios different from unit (p <0.05) and the Kruskal-Wallis test was used to compare the pharmacokinetic parameters among the 3 groups investigated. The kinetic disposition of nebivolol was stereoselective in control group with plasma accumulation (Cmax 1.32 vs 0.88 ng/mL and AUC0 0- 8.02 vs 4.25 ng.h/mL), lower values of apparent clearance (623.58 vs 1176.40 L/h) and apparent volume of distribution (5383.30 and 6397.70 L) for the l-nebivolol isomer. The kinetic disposition of nebivolol was also stereoselective in CKD group (n=12) showing higher Cmax and AUC (Cmax 2.40 vs 1.67 ng/mL and AUC0- 10.20 vs 8.37 ng.h/mL) and lower values of apparent clearance (491.51 vs 604.08 L/h) and apparent volume of distribution (3527.00 vs 5232.50 L) for the l-nebivolol isomer. Similarly to CKD and control groups, the Hemodialysis Group showed stereoselectivity with plasma accumulation (Cmax 1.35 vs 0.78 ng/mL and AUC0- 6.74 vs 4.50 ng.h/mL), lower values of apparent clearance (742.26 vs 1112.10 L/h) and apparent volume of distribution (5704.70 vs 9477.10 L) for the l-nebivolol isomer. The pharmacokinetics of nebivolol isomers in the patient phenotyped as PM differed from the data presented to the patients phenotyped as EM, with observation of isomeric ratios AUC l/d of 4.77 and reduced values of apparent clearance of both nebivolol isomers (67.24 vs 122.07 L/h, respectively for l- and d-nebivolol). Concluding, CKD stages 3 and 4 and Hemodialysis did not alter the pharmacokinetics of both nebivolol isomers (Kruskal-Wallis test, p> 0.05), the apparent volume of distribution of both nebivolol isomers showed no correlation with the weight of the patients, the apparent clearance of both isomers also showed no correlation with the weight or with the creatinine clearance of the investigated patients. However, the values for apparent clearance for both nebivolol isomers showed a significant correlation with the CYP2D6 activity evaluated by the metabolic ratios plasma metoprolol/-hidroximetoprolol. PK-PD analysis was evaluated including all the investigated patients phenotyped as EM (n=34). The inhibitory Emax model described the PK-PD analysis using heart rate variation as a pharmacodynamic parameter plotted against the plasma concentrations of the isomer dxi nebivolol, showing Emax values of 15.42 bpm and EC50 of 2.26 ng/mL, following administration of a single oral dose of 10 mg of racemic nebivolol.

Os idosos constituem a parcela da população, que mais cresce atualmente. Este segmento populacional requer cuidados médicos e terapêuticos frequentes e consomem cerca de três vezes mais medicamentos que indivíduos jovens. Deste modo necessitam de uma avaliação detalhada da farmacocinética e farmacodinâmica do fármaco a ser utilizado para uma menor ocorrência de efeitos adversos. O objetivo foi fenotipar o CYP2D6 em pacientes idosos cardiopatas classificados como metabolizadores extensivos ou lentos do metoprolol, desenvolver e validar o método de análise do tartarato de metoprolol e seu metabólito em urina utilizando a cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e identificar possíveis correlações entre fatores antropométricos, raciais e comorbidades apresentadas com a razão metabólica metoprolol/-OH metoprolol em urina. A casuística foi composta por 130 indivíduos idosos, considerados acima de 60 anos, voluntários, com algum tipo de cardiopatia previamente identificada, com função renal e hepática normais. Todos indivíduos foram submetidos a uma coleta de urina de 0-8h após a administração de um comprimido de 100 mg de tartarato de metoprolol para a determinação do metoprolol e -OH metoprolol com a finalidade de estabelecer a sua razão metabólica e fenotipar esses indivíduos de acordo com os resultados da razão da concentração metoprolol/-OH metoprolol em urina utilizando a HPLC com detecção por fluorescência, sendo fenotipados como metabolizadores lentos os pacientes que tiveram resultados > 12,6 e como metabolizadores extensivos aqueles avaliados com resultados 12,6. A maior porcentagem de pacientes estudados situou-se na faixa etária de 60 a 70 anos (média de 71,8 ± 6,2), mediana de 71,0, valor mínimo de 60 e máximo de 93 anos. Cento e quatro pacientes (80,0%) reportaram ser da raça branca, 13 (10,0%) da raça negra, 1 (0,8%) da raça amarela e 12 (9,2%) da raça parda. Cento e um pacientes (77,7%) eram do sexo feminino. Os pacientes investigados utilizavam em média 5,9 + 2,1 tipos de medicamentos, variando de 1 a 11 fármacos utilizados concomitantemente. Observou-se uma média de 5,1 + 3,2 comorbidades concomitantes, variando de 1 a 14 patologias associadas. Três pacientes (2,3%) foram fenotipados como metabolizadores lentos do metoprolol, diferenciando dos 7 a 10% de metabolizadores lentos existentes na população caucasiana. Foi detectada diferença estatisticamente significativa na razão metabólica metoprolol/-OH metoprolol segundo a quantidade de medicamentos utilizada pelos idosos (p=0,017) e segundo a utilização de bebida alcoólica (p=0,045). Conclui-se que a maioria dos indivíduos estudados eram do sexo feminino, a proporção de metabolizadores de idosos cardiopatas classificados como PM foi menor do que a que é encontrada em caucasianos, a variável quantidade de medicamentos utilizados esteve relacionada de maneira significativa à taxa de metabolização do tartarato de metoprolol observada nestes idosos cardiopatas e a variável ingestão de bebida alcoólica mostrou correlação significativa com o valor da razão metoprolol/-OH metoprolol no presente estudo. / These days, elderly people constitute the most important part of the increasing population. This population segment requires frequent medical and therapeutic cares, and spends three times more drugs than the young individuals. For that reason, a detailed pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of the administrated drug must be accomplished aiming to avoid side effects. The objective of this study was to phenotype CYP2D6 in elderly cardiopatic patients classified as extensive or poor metoprolol metabolizers, aiming to develop and validate the method for analysis of metoprolol tartrate and its metabolite in urine using high performance liquid chromatography (HPLC), and to identify possible correlations between anthropometric, racial factors, and comorbidities presented with the urine metabolic ratio of metoprolol/-OH-metoprolol. The casuistry was composed by 130 elderly individuals over 60 years old, volunteer, carrying any type of pre identified cardiomyopathy, with normal renal and hepatic functions. Aiming the evaluation of the urine metabolic ratio of metoprolol/-OH-metoprolol, the individuals were submitted to a urine collection 0-8h after administration of tablets of 100 mg of metoprolol tartrate for phenotyping after the results of the concentration metoprolol/-OH-metoprolol using HPLC and fluorescence detection, being phenotyped as poor metabolizers the patients that presented ratio > 12.6, and extensive metabolizers 12.6. Mostly studied patients percentage age was 60-70 years old (mean of 71.8 ± 6.2) - median 71.0; the maximum value was 93, and the minimum value was 60 years old. One hundred and four patients (80.0%) reported being Caucasian, 13 (10.0%) Black, 1 (0.8%) Asian, and 12 (9.2%) Half-black. One hundred and one patients (77.7%) were female. The studied patients used approximately 5.9 + 2.1 types of drugs, varying of 1 to 11 concomitant drugs used. We could observe the mean of concomitant comorbidities of 5.1 + 3.2 varying of 1 to 14 associated pathologies. Three patients (2.3%) were phenotyped as poor metoprolol metabolizers differentiating of those 7 to 10% poor metabolizers existent in Caucasian population. A significant statistical difference was detected in the metabolic ratio metoprolol/-OH-metoprolol according to the quantity of drug used by elderly patients (p=0.017), and alcohol users (p=0.045). It could be concluded that mostly of studied individuals was female. The proportion of elderly cardiopatic metabolizers classified as PM was lower than the Caucasian ones. The quantity of drugs used was significantly related to the metabolism ratio of metoprolol tartatre observed on those elderly cardiopatic patients, and the variable alcohol ingestion showed significant relation to the value of ratio metoprolol/-OH-metoprolol in the present study.

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Os idosos constituem a parcela da população, que mais cresce atualmente. Este segmento populacional requer cuidados médicos e terapêuticos frequentes e consomem cerca de três vezes mais medicamentos que indivíduos jovens. Deste modo necessitam de uma avaliação detalhada da farmacocinética e farmacodinâmica do fármaco a ser utilizado para uma menor ocorrência de efeitos adversos. O objetivo foi fenotipar o CYP2D6 em pacientes idosos cardiopatas classificados como metabolizadores extensivos ou lentos do metoprolol, desenvolver e validar o método de análise do tartarato de metoprolol e seu metabólito em urina utilizando a cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) e identificar possíveis correlações entre fatores antropométricos, raciais e comorbidades apresentadas com a razão metabólica metoprolol/-OH metoprolol em urina. A casuística foi composta por 130 indivíduos idosos, considerados acima de 60 anos, voluntários, com algum tipo de cardiopatia previamente identificada, com função renal e hepática normais. Todos indivíduos foram submetidos a uma coleta de urina de 0-8h após a administração de um comprimido de 100 mg de tartarato de metoprolol para a determinação do metoprolol e -OH metoprolol com a finalidade de estabelecer a sua razão metabólica e fenotipar esses indivíduos de acordo com os resultados da razão da concentração metoprolol/-OH metoprolol em urina utilizando a HPLC com detecção por fluorescência, sendo fenotipados como metabolizadores lentos os pacientes que tiveram resultados > 12,6 e como metabolizadores extensivos aqueles avaliados com resultados 12,6. A maior porcentagem de pacientes estudados situou-se na faixa etária de 60 a 70 anos (média de 71,8 ± 6,2), mediana de 71,0, valor mínimo de 60 e máximo de 93 anos. Cento e quatro pacientes (80,0%) reportaram ser da raça branca, 13 (10,0%) da raça negra, 1 (0,8%) da raça amarela e 12 (9,2%) da raça parda. Cento e um pacientes (77,7%) eram do sexo feminino. Os pacientes investigados utilizavam em média 5,9 + 2,1 tipos de medicamentos, variando de 1 a 11 fármacos utilizados concomitantemente. Observou-se uma média de 5,1 + 3,2 comorbidades concomitantes, variando de 1 a 14 patologias associadas. Três pacientes (2,3%) foram fenotipados como metabolizadores lentos do metoprolol, diferenciando dos 7 a 10% de metabolizadores lentos existentes na população caucasiana. Foi detectada diferença estatisticamente significativa na razão metabólica metoprolol/-OH metoprolol segundo a quantidade de medicamentos utilizada pelos idosos (p=0,017) e segundo a utilização de bebida alcoólica (p=0,045). Conclui-se que a maioria dos indivíduos estudados eram do sexo feminino, a proporção de metabolizadores de idosos cardiopatas classificados como PM foi menor do que a que é encontrada em caucasianos, a variável quantidade de medicamentos utilizados esteve relacionada de maneira significativa à taxa de metabolização do tartarato de metoprolol observada nestes idosos cardiopatas e a variável ingestão de bebida alcoólica mostrou correlação significativa com o valor da razão metoprolol/-OH metoprolol no presente estudo. / These days, elderly people constitute the most important part of the increasing population. This population segment requires frequent medical and therapeutic cares, and spends three times more drugs than the young individuals. For that reason, a detailed pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of the administrated drug must be accomplished aiming to avoid side effects. The objective of this study was to phenotype CYP2D6 in elderly cardiopatic patients classified as extensive or poor metoprolol metabolizers, aiming to develop and validate the method for analysis of metoprolol tartrate and its metabolite in urine using high performance liquid chromatography (HPLC), and to identify possible correlations between anthropometric, racial factors, and comorbidities presented with the urine metabolic ratio of metoprolol/-OH-metoprolol. The casuistry was composed by 130 elderly individuals over 60 years old, volunteer, carrying any type of pre identified cardiomyopathy, with normal renal and hepatic functions. Aiming the evaluation of the urine metabolic ratio of metoprolol/-OH-metoprolol, the individuals were submitted to a urine collection 0-8h after administration of tablets of 100 mg of metoprolol tartrate for phenotyping after the results of the concentration metoprolol/-OH-metoprolol using HPLC and fluorescence detection, being phenotyped as poor metabolizers the patients that presented ratio > 12.6, and extensive metabolizers 12.6. Mostly studied patients percentage age was 60-70 years old (mean of 71.8 ± 6.2) - median 71.0; the maximum value was 93, and the minimum value was 60 years old. One hundred and four patients (80.0%) reported being Caucasian, 13 (10.0%) Black, 1 (0.8%) Asian, and 12 (9.2%) Half-black. One hundred and one patients (77.7%) were female. The studied patients used approximately 5.9 + 2.1 types of drugs, varying of 1 to 11 concomitant drugs used. We could observe the mean of concomitant comorbidities of 5.1 + 3.2 varying of 1 to 14 associated pathologies. Three patients (2.3%) were phenotyped as poor metoprolol metabolizers differentiating of those 7 to 10% poor metabolizers existent in Caucasian population. A significant statistical difference was detected in the metabolic ratio metoprolol/-OH-metoprolol according to the quantity of drug used by elderly patients (p=0.017), and alcohol users (p=0.045). It could be concluded that mostly of studied individuals was female. The proportion of elderly cardiopatic metabolizers classified as PM was lower than the Caucasian ones. The quantity of drugs used was significantly related to the metabolism ratio of metoprolol tartatre observed on those elderly cardiopatic patients, and the variable alcohol ingestion showed significant relation to the value of ratio metoprolol/-OH-metoprolol in the present study.