Tesis para optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica Área de Especialización: Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al Título Profesional de Bioquímica / Los médicos prescriben fármacos sobre la base de sus características farmacológicas y sobre la posibilidad de obtener resultados clínicamente reproducibles. Sin embargo, muchos de los fármacos son eficaces en sólo 25% a 60% de los pacientes, por lo tanto, muchos pacientes no responden a los tratamientos e incluso experimentan reacciones adversas e intoxicaciones. Existen variaciones individuales en las respuestas a fármacos que pueden deberse a diversos efectos, pero en la actualidad se sabe que muchas de estas variaciones se encuentran predeterminadas genéticamente; éste es el blanco de estudio de la farmacogenética. La debrisoquina-4-hidroxilasa (CYP2D6) es una de las enzimas más importante del metabolismo de fármacos que actúan tanto a nivel del sistema nervioso central (SNC) como del sistema circulatorio. Los polimorfismos de CYP2D6 presentan grandes diferencias en las frecuencias alélicas según la población y etnia. En este estudio se analizaron a través de PCR-AS semianidada, PCR RFLP y PCRL las variables CYP2D6*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4 y la duplicación del gen CYP2D6 en 321 voluntarios sanos. Las frecuencias alélicas encontradas son muy similares a las registradas para la población española: para *2 un 40,5%, para *3 un 1,09%, para *4 un 11,8%. No se encontraron duplicaciones del gen CYP2D6 en un subgrupo de 20 voluntarios analizados. Para determinar con exactitud la influencia de los polimorfismos del gen CYP2D6 en su actividad debrisoquina hidroxilasa, se seleccionaron 23 voluntarios del grupo en estudio que presentaban genotipos relevantes, los cuales debieron ingerir el marcador metabólico debrisoquina. Se recolectaron las muestras de orina de 0-8 horas y se analizaron a través de HPLC. Presentaron el fenotipo esperado 18 voluntarios, de los cuales el más relevante es el genotipo *4/*4 que presentó una actividad catalítica muy disminuida en comparación al grupo wt/wt. Se obtuvo una correlación genotipo-fenotipo para algunos voluntarios logrando el objetivo fundamental que busca un estudio farmacogenético, es decir, la determinación de la respuesta individual

O citocromo P450 (CYP450) e suas isoformas podem ser reguladas por compostos exogenos, endogenos e patologias. O Diabetes Mellitus (DM) e uma sindrome de etiologia multipla, decorrente da incapacidade da insulina em exercer adequadamente sua acao, sendo capaz de alterar a atividade do CYP450. Este estudo avalia a influencia do DM na atividade das isoformas CYP2D6 e CYP3A4 utilizando como marcadores de atividade o metoprolol (MET) e o midazolam (MDZ) respectivamente. Ratos machos Wistar, 200-250 g, foram tratados com dose unica, por via oral 20 mg/Kg para MET e 15 mg/Kg para MDZ. O DM foi induzido por estreptozotocina (50 mg/Kg) por via intravenosa. Midazolam, metoprolol e alfa-hidroximetoprolol foram analisados em plasma por cromatografia liquida de ultraperformance (coluna XR-ODS 100 mm x 3,0 mm) acoplada a espectrometro de massas. O preparo das amostras foi realizado por extracao liquido-liquido. A analise farmacocinetica do MDZ em ratos mostrou reducao significativa (54,01 vs 12,24 L/h/kg) no clearance dos animais diabeticos em relacao ao controle e aumento significativo (402,66 vs 1742,6 h.ng/mL) do AUC0- ‡ no grupo diabetico quando comparado com o controle. O DM modificou o AUC0- ‡ do MET no grupo diabetico em relacao ao controle (998,09 vs 348,45 h.ng/mL) acompanhado de reducao significativa do clearance no grupo diabetico (46,85 vs 17,80 L/h/kg). Desde que nao foi observada qualquer alteracao na farmacocinetica do alfa-hidroximetoprolol, o aumento do AUC0- ‡ do MET pode ser devido a inibicao de outra via de metabolizacao pelo DM, como comprovado pela alteracao na via do CYP3A. A analise dos dados sugere que o DM inibe a atividade do CYP3A4 e nao exerce influencia sobre a atividade do CYP2D6 / Cytochrome P450 (CYP450) and its isoforms can be regulated by exogenous and endogenous compounds and also diseases. Diabetes Mellitus (DM) is a multiple etiology syndrome resulting from a lack or inability of insulin to properly exercise its action, that can modify the CYP450 activity. This research evaluates the influence of DM on CYP2D6 and CYP3A4 isoforms activity employing metoprolol (MET) and midazolam (MDZ) as probe drugs. Male Wistar rats 200-250g, were treated with single oral dose of 20mg/kg for MET and 15 mg/kg for MDZ. Diabetes mellitus was induced by streptozotocin (50mg/kg) intravenously administered. Midazolam, metoprolol and alpha-hydroxymetoprolol were analyzed in plasma by ultraperformance liquid chromatography (column XR-ODS) coupled to a mass spectrometer. The sample preparation was perfomed using liquid-liquid extraction. Pharmacokinetics of MDZ in rats showed a significant decrease (54,01 vs 12,24 L/h/kg) of total clearance in the diabetic animals compared to control group and a significant increase (402.66 vs 1742.6 h.ng/mL) AUC0- ‡ in the diabetic group compared with the control. The DM altered the AUC0- ‡ of MET in the diabetic group compared to control (998.09 vs 348.45 h.ng/mL) followed by a significant decrease in clearance in the diabetic group (46.85 vs 17.80 L/h/kg). Since no changes in alpha- hydroxymetoprolol pharmacokinetics was observed, the increase in MET AUC0- ‡ can be explained by DM inhibition of other MET metabolization pathways. Data analysis suggests that DM inhibits CYP3A4 activity and had no effect on CYP2D6 activity / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Introdução: As variações da CYP2D6 estão associadas com o desfecho clínico das pacientes na terapia adjuvante do câncer de mama com tamoxifeno (TAM). Esta associação deve-se principalmente a hidroxilação do N-desmetiltamoxifeno (NDT) pela CYP2D6 a endoxifeno (EDF) que, por sua alta potência antiestrogênica, é o principal responsável pela eficácia terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre o genótipo e o fenótipo da CYP2D6 com os níveis de EDF e a razão metabólica [NDT]/[EDF] em uma população do Sul do Brasil. Métodos: Foram obtidas amostras de plasma em vale de 97 pacientes em terapia com o tamoxifeno. A genotipagem da CYP2D6 foi realizada com ensaio Luminex, com determinação de escores de atividade genotípica (EAG). As concentrações do TAM e seus metabólitos foram determinados por CLAE-DAD e classificadas em metabolizadores lentos (ML), intermediários (MI), rápidos com atividade diminuída (MR-D), rápidos com atividade rápida (MR-R) e ultra-rápidos (UR). A fenotipagem foi realizada através da determinação do dextrometorfano (DMT) e do dextrorfano (DTF) por CLAE-FL nas amostras de plasma coletadas três horas após administração oral de 33 mg de DMT. A atividade da CYP2D6 foi avaliada pela razão metabólica [DMT]/[DTF]. Resultados: A genotipagem da CYP2D6 mostrou prevalência de 4,1% de ML, 4,1% de MI, 49,5% de MR-D, 39,2% de MR-R e 3,1% de UR. O genótipo (EAG) foi significativamente correlacionado com o fenótipo ([DMT]/[DTF]), com uma associação moderada (rs= -0,463; p<0,001). As medianas das concentrações plasmáticas do TAM e seus metabólitos (ng mL-1) foram: TAM 57,17; HTF 1,01; EDF 6,21; NDT 125,50. Os níveis de EDF foram inferiores nos ML em comparação aos MR (p<0,05). O fenótipo apresentou maior associação, porém ainda moderada, com os níveis de EDF e [NDT]/[EDF] em comparação ao genótipo (r= -0,507 r=0,625, p<0,001 versus r= 0,356 r=0,516; p<0,01). Ao fenótipo da CYP2D6 foram atribuídas 26% da variabilidade dos níveis de EDF e 38 % das razões metabólicas [NDT]/[EDF], enquanto que ao genótipo foram atribuídas 12% e 27 %, respectivamente. Conclusão: A genotipagem e/ou fenotipagem da CYP2D6 não foram capazes de predizer completamente as concentrações de EDF. Desta forma, sugerimos que estudos futuros utilizem o monitoramento dos níveis de EDF durante a terapia com TAM, com o objetivo de avaliar a sua efetividade. / Background: An association between CYP2D6 variation and clinical outcomes among women with breast cancer treated with tamoxifen (TAM) has been demonstrated, such that the presence of 2 functional CYP2D6 alleles was associated with better clinical outcomes. This association is mainly due the CYP2D6 mediated hydroxylation of N-desmethyltamoxifen (NDT) to yield endoxifen (EDF), which because of its high antiestrogenic potency, is the main responsible for the therapeutic efficacy of TAM. The aim of this study was to evaluate the relation of CYP2D6 genotyping and phenotyping with EDF levels and [NDT]/[EDF] metabolic ratio in breast cancer patients from South of Brazil under TAM therapy. Methods: Trough blood samples were collected from 97 patients. CYP2D6 genotyping was performed with a Luminex assay and calculation of Genotypic activity scores (GAS). Tamoxifen and metabolites EDF, NDT and 4-hidroxy-tamoxifen (HTF) were measured in plasma by HPLC-PDA. CYP2D6 phenotyping was performed by determination of dextromethorphan (DMT) and dextrorphan (DTF) by HPLC-FL at plasma collected three hours after oral administration of 33 mg of DMF. Phenotypes were given according to [DMT]/[DTF] metabolic ratio. Results: CYP2D6 genotyping indicated a prevalence of 4.1% PM, 4.1% IM, 49.5% EM-S, 39.2% EM-F and 3.1% UM. Genotype (GAS), was significantly correlated with phenotype ([DMT]/[DTF]), with a moderate association (rs= -0.463; p<0.001). Median plasma concentrations (ng mL-1) (N=97) were: TAM 57.17; HTF 1.01; EDF 6.21; NDT 125.50. EDF levels were lower in PM than in EM (p<0.05). Phenotype showed stronger, but still moderate, association with EDF and [NDT]/[EDF] than genotype (r= -0.507 r=0.625, p<0.001 versus r= 0,356 r=0.516, p<0.01). Phenotype accounted for 26% of the variability in EDF levels and 38 % of [NDT]/[EDF], while genotype for 12% and 27 %, respectively. Conclusion: CYP2D6 genotyping and/or phenotyping could not fully predict EDF concentrations. Monitoring EDF itself could be considered in further studies during TAM therapy in order to evaluate its efficacy

Introdução: a ação antiestrogênica do tamoxifeno (TAM) é dependente da bioativação à endoxifeno (EDF) e 4-hidroxitamoxifeno (HTF). É bastante provável que sua eficácia terapêutica esteja relacionada ao alcance de um limiar nos níveis de EDF (>5,9 ng mL-1). Entretanto, as concentrações plasmáticas de EDF são altamente variáveis, em parte devido a polimorfismos no gene da CYP2D6 e ao uso de inibidores da enzima. A CYP3A4 também contribui para a formação do EDF e pode ser influenciada por interações medicamentosas e exposição solar. Recentemente, o polimorfismo CYP3A4*22 foi associado à redução da atividade da enzima. Entretanto, pouco se sabe sobre seu impacto na formação do EDF. Objetivo: Em virtude da alta variabilidade na resposta terapêutica e os múltiplos fatores associados ao metabolismo do TAM, o presente estudo objetivou avaliar o efeito dos polimorfismos da CYP2D6 e CYP3A4, interações medicamentosas e exposição à vitamina D na bioativação do TAM. Adicionalmente, dois métodos analíticos para a otimização do tratamento através da medida das razões metabólicas da CYP2D6 e quantificação do TAM e metabólitos em manchas de sangue seco (DBS) foram desenvolvidos. Patientes & métodos: Cento e dezesseis pacientes em tratamento adjuvante com o TAM forneceram amostras de plasma para dosagens do TAM, metabótilos e 25OHD3 no inverno e verão. As concentrações de TAM e metabólitos em plasma e DBS foram medidas por LCMS/ MS. Foram avaliados os genótipos da CYP2D6 e CYP3A4, bem como fenótipos obtidos pelas razões metabólicas determinadas após administração dos fármacos sonda dextrometorfano e omeprazol. As concentrações de vitamina D3 em plasma foram quantificadas por HPLC-UV. Foram obtidas informações sobre uso de inibidores ou indutores das enzimas e suplementação de vitamina D. Resultados: Cerca de 20% das pacientes apresentaram atividade metabólica reduzida para a CYP2D6 e 7% para a CYP3A4. Aproximadamente 30% das metabolizadoras lentas (ML), 56% das metabolizadoras intermediárias (MI) e 11.3% das metabolizadoras rápidas (MR) usavam fármaco inibidor da CYP2D6. As concentrações de EDF diminuiram proporcionalmente à redução da atividade metabólica da CYP2D6 (ML 2,79 ng mL-1, MI 5.36 ng mL-1 e MR 10,65 ng mL-1, P<0.01). A mediana das concentrações plasmáticas de TAM e HTF em pacientes CYP2D6 MI com metabolismo reduzido da CYP3A4 (161,50 ng mL-1 e 1,32 ng mL-1, respectivamente) foram superiores as encontradas nos pacientes CYP2D6 MI com metabolismo funcional da CYP3A4 (122,07 ng mL-1 e 0.61 ng mL-1, respectivamente, P<0.05). Adicionalmente, as concentrações de HTF e TAM foram aproximadamente 50% superiores em pacientes com genótipo CYP3A4*22 em comparação aos pacientes *1/*1. A sazonalidade também contribuiu para a variabilidade das concentrações dos metabólitos ativos, os níveis de EDF foram 24% e HTF 42% superiores no verão. Nas análises de DBS, foi possível identificar 96% dos pacientes com concentrações de EDF abaixo do limiar clínico, indicando seu potencial uso no monitoramento terapêutico do TAM. Conclusão: a CYP3A4 contribui para a bioativação do TAM através da formação de HTF, tornando-se mais importante em condições de atividade diminuída ou ausente da CYP2D6. Os níveis plasmáticos de EDF e HTF demonstraram ser influenciados pela sazonalidade, com aumento significativo no verão. Entretanto o mecanismo relacionado a associação da vitamina D, exposição solar e bioativação do TAM permanecem por ser elucidados. / Background: The therapeutic antiestrogenic effect of tamoxifen (TAM) requires metabolic activation to endoxifen (EDF) and 4-hydroxytamoxifen (HTF). Adequate therapeutic outcome seems to be dependent on the achievement of a threshold of EDF concentration (>5.9 ng mL-1). EDF plasma levels are highly variable among patients, which could be partly explained by polymorphisms in the CYP2D6 gene and the use of enzymes inhibitor drugs. In a lesser extent, CYP3A4 also contributes to EDF formation and can be influenced by drug interactions and sun exposure. From a genetic point of view, a recently described CYP3A4*22 polymorphism has been associated with reduced enzyme activity. However, there is little knowledge about the impact of CYP3A4 polymorphisms on EDF formation. Objective: In view of the large variability on therapeutic response and the multiple factors associated to TAM metabolic activation, the present study aimed to evaluate the effect of CYP2D6 and CYP3A4 polymorphisms, drug interactions and vitamin D exposure on TAM metabolic activation. Additionally, two analytical methods for optimization of TAM treatment by measurement of CYP2D6 metabolic ratios and quantification of TAM and metabolites in dried blood sopts (DBS) were developed. Patients & methods: One hundred and sixteen patients under TAM therapy provided blood samples for measurement of TAM, NDT, EDF, HTF and 25OHD3 at Winter and Summer. TAM and metabolites were measured in plasma and DBS by LC-MS/MS. CYP2D6 and CYP3A4 genotypes and phenotypes, given according to [DMT]/[DTP] and [OME]/[OMS] metabolic ratios after administration of probe drugs, were also evaluated. Vitamine D3 was measured in plasma by HPLC-UV. Data on use of CYP2D6 and CYP3A4 inhibitor or inducer drugs and vitamin D supplementation were recorded. Results: About 20% of patients had reduced CYP2D6 metabolic activity and 7% CYP3A4 impaired metabolism. Approximately 30% of CYP2D6 poor metabolizers (PM), 56% of intermediate metabolizers (IM) and 11.3% of extensive metabolizers (EM) were using CYP2D6 inhibitor drugs. EDF levels diminished proportionally to the reduction of CYP2D6 metabolic activity (PM 2.79 ng mL-1, IM 5.36 ng mL-1 and EM 10.65 ng mL-1, P<0.01). Median plasma levels of TAM (161.50 ng mL-1) and HTF (1.32 ng mL-1) in CYP2D6 IM patients with reduced CYP3A4 metabolism were higher (P<0.05) than those from CYP2D6 IM patients with functional CYP3A4 metabolism (122.07 ng mL-1 and 0.61 ng mL-1, respectively). Indeed, HTF and TAM plasma levels were approximately 50% higher in patients with CYP3A4*22 genotype compared to patients with alleles *1/*1. Seasonality also contributed to EDF and HTF variability, summer concentrations were 24% and 42% higher compared to winter. The DBS method was able to identify 96% of patients with plasma EDF concentrations below the clinical threshold and can be used in therapeutic monitoring of TAM. Conclusion: Our findings suggest that CYP3A4 contributes to the bioactivation of TAM through formation of HTF and becomes increasingly important in conditions of diminished or absent CYP2D6 activity. A significant variability on EDF and HTF exposure related to seasonality was identified, with considerable higher plasma concentrations during summer. The mechanism relating vitamin D status, seasonality and biotransformation of TAM still remains to be elucidated.

Introdução: a ação antiestrogênica do tamoxifeno (TAM) é dependente da bioativação à endoxifeno (EDF) e 4-hidroxitamoxifeno (HTF). É bastante provável que sua eficácia terapêutica esteja relacionada ao alcance de um limiar nos níveis de EDF (>5,9 ng mL-1). Entretanto, as concentrações plasmáticas de EDF são altamente variáveis, em parte devido a polimorfismos no gene da CYP2D6 e ao uso de inibidores da enzima. A CYP3A4 também contribui para a formação do EDF e pode ser influenciada por interações medicamentosas e exposição solar. Recentemente, o polimorfismo CYP3A4*22 foi associado à redução da atividade da enzima. Entretanto, pouco se sabe sobre seu impacto na formação do EDF. Objetivo: Em virtude da alta variabilidade na resposta terapêutica e os múltiplos fatores associados ao metabolismo do TAM, o presente estudo objetivou avaliar o efeito dos polimorfismos da CYP2D6 e CYP3A4, interações medicamentosas e exposição à vitamina D na bioativação do TAM. Adicionalmente, dois métodos analíticos para a otimização do tratamento através da medida das razões metabólicas da CYP2D6 e quantificação do TAM e metabólitos em manchas de sangue seco (DBS) foram desenvolvidos. Patientes & métodos: Cento e dezesseis pacientes em tratamento adjuvante com o TAM forneceram amostras de plasma para dosagens do TAM, metabótilos e 25OHD3 no inverno e verão. As concentrações de TAM e metabólitos em plasma e DBS foram medidas por LCMS/ MS. Foram avaliados os genótipos da CYP2D6 e CYP3A4, bem como fenótipos obtidos pelas razões metabólicas determinadas após administração dos fármacos sonda dextrometorfano e omeprazol. As concentrações de vitamina D3 em plasma foram quantificadas por HPLC-UV. Foram obtidas informações sobre uso de inibidores ou indutores das enzimas e suplementação de vitamina D. Resultados: Cerca de 20% das pacientes apresentaram atividade metabólica reduzida para a CYP2D6 e 7% para a CYP3A4. Aproximadamente 30% das metabolizadoras lentas (ML), 56% das metabolizadoras intermediárias (MI) e 11.3% das metabolizadoras rápidas (MR) usavam fármaco inibidor da CYP2D6. As concentrações de EDF diminuiram proporcionalmente à redução da atividade metabólica da CYP2D6 (ML 2,79 ng mL-1, MI 5.36 ng mL-1 e MR 10,65 ng mL-1, P<0.01). A mediana das concentrações plasmáticas de TAM e HTF em pacientes CYP2D6 MI com metabolismo reduzido da CYP3A4 (161,50 ng mL-1 e 1,32 ng mL-1, respectivamente) foram superiores as encontradas nos pacientes CYP2D6 MI com metabolismo funcional da CYP3A4 (122,07 ng mL-1 e 0.61 ng mL-1, respectivamente, P<0.05). Adicionalmente, as concentrações de HTF e TAM foram aproximadamente 50% superiores em pacientes com genótipo CYP3A4*22 em comparação aos pacientes *1/*1. A sazonalidade também contribuiu para a variabilidade das concentrações dos metabólitos ativos, os níveis de EDF foram 24% e HTF 42% superiores no verão. Nas análises de DBS, foi possível identificar 96% dos pacientes com concentrações de EDF abaixo do limiar clínico, indicando seu potencial uso no monitoramento terapêutico do TAM. Conclusão: a CYP3A4 contribui para a bioativação do TAM através da formação de HTF, tornando-se mais importante em condições de atividade diminuída ou ausente da CYP2D6. Os níveis plasmáticos de EDF e HTF demonstraram ser influenciados pela sazonalidade, com aumento significativo no verão. Entretanto o mecanismo relacionado a associação da vitamina D, exposição solar e bioativação do TAM permanecem por ser elucidados. / Background: The therapeutic antiestrogenic effect of tamoxifen (TAM) requires metabolic activation to endoxifen (EDF) and 4-hydroxytamoxifen (HTF). Adequate therapeutic outcome seems to be dependent on the achievement of a threshold of EDF concentration (>5.9 ng mL-1). EDF plasma levels are highly variable among patients, which could be partly explained by polymorphisms in the CYP2D6 gene and the use of enzymes inhibitor drugs. In a lesser extent, CYP3A4 also contributes to EDF formation and can be influenced by drug interactions and sun exposure. From a genetic point of view, a recently described CYP3A4*22 polymorphism has been associated with reduced enzyme activity. However, there is little knowledge about the impact of CYP3A4 polymorphisms on EDF formation. Objective: In view of the large variability on therapeutic response and the multiple factors associated to TAM metabolic activation, the present study aimed to evaluate the effect of CYP2D6 and CYP3A4 polymorphisms, drug interactions and vitamin D exposure on TAM metabolic activation. Additionally, two analytical methods for optimization of TAM treatment by measurement of CYP2D6 metabolic ratios and quantification of TAM and metabolites in dried blood sopts (DBS) were developed. Patients & methods: One hundred and sixteen patients under TAM therapy provided blood samples for measurement of TAM, NDT, EDF, HTF and 25OHD3 at Winter and Summer. TAM and metabolites were measured in plasma and DBS by LC-MS/MS. CYP2D6 and CYP3A4 genotypes and phenotypes, given according to [DMT]/[DTP] and [OME]/[OMS] metabolic ratios after administration of probe drugs, were also evaluated. Vitamine D3 was measured in plasma by HPLC-UV. Data on use of CYP2D6 and CYP3A4 inhibitor or inducer drugs and vitamin D supplementation were recorded. Results: About 20% of patients had reduced CYP2D6 metabolic activity and 7% CYP3A4 impaired metabolism. Approximately 30% of CYP2D6 poor metabolizers (PM), 56% of intermediate metabolizers (IM) and 11.3% of extensive metabolizers (EM) were using CYP2D6 inhibitor drugs. EDF levels diminished proportionally to the reduction of CYP2D6 metabolic activity (PM 2.79 ng mL-1, IM 5.36 ng mL-1 and EM 10.65 ng mL-1, P<0.01). Median plasma levels of TAM (161.50 ng mL-1) and HTF (1.32 ng mL-1) in CYP2D6 IM patients with reduced CYP3A4 metabolism were higher (P<0.05) than those from CYP2D6 IM patients with functional CYP3A4 metabolism (122.07 ng mL-1 and 0.61 ng mL-1, respectively). Indeed, HTF and TAM plasma levels were approximately 50% higher in patients with CYP3A4*22 genotype compared to patients with alleles *1/*1. Seasonality also contributed to EDF and HTF variability, summer concentrations were 24% and 42% higher compared to winter. The DBS method was able to identify 96% of patients with plasma EDF concentrations below the clinical threshold and can be used in therapeutic monitoring of TAM. Conclusion: Our findings suggest that CYP3A4 contributes to the bioactivation of TAM through formation of HTF and becomes increasingly important in conditions of diminished or absent CYP2D6 activity. A significant variability on EDF and HTF exposure related to seasonality was identified, with considerable higher plasma concentrations during summer. The mechanism relating vitamin D status, seasonality and biotransformation of TAM still remains to be elucidated.

Introdução: a ação antiestrogênica do tamoxifeno (TAM) é dependente da bioativação à endoxifeno (EDF) e 4-hidroxitamoxifeno (HTF). É bastante provável que sua eficácia terapêutica esteja relacionada ao alcance de um limiar nos níveis de EDF (>5,9 ng mL-1). Entretanto, as concentrações plasmáticas de EDF são altamente variáveis, em parte devido a polimorfismos no gene da CYP2D6 e ao uso de inibidores da enzima. A CYP3A4 também contribui para a formação do EDF e pode ser influenciada por interações medicamentosas e exposição solar. Recentemente, o polimorfismo CYP3A4*22 foi associado à redução da atividade da enzima. Entretanto, pouco se sabe sobre seu impacto na formação do EDF. Objetivo: Em virtude da alta variabilidade na resposta terapêutica e os múltiplos fatores associados ao metabolismo do TAM, o presente estudo objetivou avaliar o efeito dos polimorfismos da CYP2D6 e CYP3A4, interações medicamentosas e exposição à vitamina D na bioativação do TAM. Adicionalmente, dois métodos analíticos para a otimização do tratamento através da medida das razões metabólicas da CYP2D6 e quantificação do TAM e metabólitos em manchas de sangue seco (DBS) foram desenvolvidos. Patientes & métodos: Cento e dezesseis pacientes em tratamento adjuvante com o TAM forneceram amostras de plasma para dosagens do TAM, metabótilos e 25OHD3 no inverno e verão. As concentrações de TAM e metabólitos em plasma e DBS foram medidas por LCMS/ MS. Foram avaliados os genótipos da CYP2D6 e CYP3A4, bem como fenótipos obtidos pelas razões metabólicas determinadas após administração dos fármacos sonda dextrometorfano e omeprazol. As concentrações de vitamina D3 em plasma foram quantificadas por HPLC-UV. Foram obtidas informações sobre uso de inibidores ou indutores das enzimas e suplementação de vitamina D. Resultados: Cerca de 20% das pacientes apresentaram atividade metabólica reduzida para a CYP2D6 e 7% para a CYP3A4. Aproximadamente 30% das metabolizadoras lentas (ML), 56% das metabolizadoras intermediárias (MI) e 11.3% das metabolizadoras rápidas (MR) usavam fármaco inibidor da CYP2D6. As concentrações de EDF diminuiram proporcionalmente à redução da atividade metabólica da CYP2D6 (ML 2,79 ng mL-1, MI 5.36 ng mL-1 e MR 10,65 ng mL-1, P<0.01). A mediana das concentrações plasmáticas de TAM e HTF em pacientes CYP2D6 MI com metabolismo reduzido da CYP3A4 (161,50 ng mL-1 e 1,32 ng mL-1, respectivamente) foram superiores as encontradas nos pacientes CYP2D6 MI com metabolismo funcional da CYP3A4 (122,07 ng mL-1 e 0.61 ng mL-1, respectivamente, P<0.05). Adicionalmente, as concentrações de HTF e TAM foram aproximadamente 50% superiores em pacientes com genótipo CYP3A4*22 em comparação aos pacientes *1/*1. A sazonalidade também contribuiu para a variabilidade das concentrações dos metabólitos ativos, os níveis de EDF foram 24% e HTF 42% superiores no verão. Nas análises de DBS, foi possível identificar 96% dos pacientes com concentrações de EDF abaixo do limiar clínico, indicando seu potencial uso no monitoramento terapêutico do TAM. Conclusão: a CYP3A4 contribui para a bioativação do TAM através da formação de HTF, tornando-se mais importante em condições de atividade diminuída ou ausente da CYP2D6. Os níveis plasmáticos de EDF e HTF demonstraram ser influenciados pela sazonalidade, com aumento significativo no verão. Entretanto o mecanismo relacionado a associação da vitamina D, exposição solar e bioativação do TAM permanecem por ser elucidados. / Background: The therapeutic antiestrogenic effect of tamoxifen (TAM) requires metabolic activation to endoxifen (EDF) and 4-hydroxytamoxifen (HTF). Adequate therapeutic outcome seems to be dependent on the achievement of a threshold of EDF concentration (>5.9 ng mL-1). EDF plasma levels are highly variable among patients, which could be partly explained by polymorphisms in the CYP2D6 gene and the use of enzymes inhibitor drugs. In a lesser extent, CYP3A4 also contributes to EDF formation and can be influenced by drug interactions and sun exposure. From a genetic point of view, a recently described CYP3A4*22 polymorphism has been associated with reduced enzyme activity. However, there is little knowledge about the impact of CYP3A4 polymorphisms on EDF formation. Objective: In view of the large variability on therapeutic response and the multiple factors associated to TAM metabolic activation, the present study aimed to evaluate the effect of CYP2D6 and CYP3A4 polymorphisms, drug interactions and vitamin D exposure on TAM metabolic activation. Additionally, two analytical methods for optimization of TAM treatment by measurement of CYP2D6 metabolic ratios and quantification of TAM and metabolites in dried blood sopts (DBS) were developed. Patients & methods: One hundred and sixteen patients under TAM therapy provided blood samples for measurement of TAM, NDT, EDF, HTF and 25OHD3 at Winter and Summer. TAM and metabolites were measured in plasma and DBS by LC-MS/MS. CYP2D6 and CYP3A4 genotypes and phenotypes, given according to [DMT]/[DTP] and [OME]/[OMS] metabolic ratios after administration of probe drugs, were also evaluated. Vitamine D3 was measured in plasma by HPLC-UV. Data on use of CYP2D6 and CYP3A4 inhibitor or inducer drugs and vitamin D supplementation were recorded. Results: About 20% of patients had reduced CYP2D6 metabolic activity and 7% CYP3A4 impaired metabolism. Approximately 30% of CYP2D6 poor metabolizers (PM), 56% of intermediate metabolizers (IM) and 11.3% of extensive metabolizers (EM) were using CYP2D6 inhibitor drugs. EDF levels diminished proportionally to the reduction of CYP2D6 metabolic activity (PM 2.79 ng mL-1, IM 5.36 ng mL-1 and EM 10.65 ng mL-1, P<0.01). Median plasma levels of TAM (161.50 ng mL-1) and HTF (1.32 ng mL-1) in CYP2D6 IM patients with reduced CYP3A4 metabolism were higher (P<0.05) than those from CYP2D6 IM patients with functional CYP3A4 metabolism (122.07 ng mL-1 and 0.61 ng mL-1, respectively). Indeed, HTF and TAM plasma levels were approximately 50% higher in patients with CYP3A4*22 genotype compared to patients with alleles *1/*1. Seasonality also contributed to EDF and HTF variability, summer concentrations were 24% and 42% higher compared to winter. The DBS method was able to identify 96% of patients with plasma EDF concentrations below the clinical threshold and can be used in therapeutic monitoring of TAM. Conclusion: Our findings suggest that CYP3A4 contributes to the bioactivation of TAM through formation of HTF and becomes increasingly important in conditions of diminished or absent CYP2D6 activity. A significant variability on EDF and HTF exposure related to seasonality was identified, with considerable higher plasma concentrations during summer. The mechanism relating vitamin D status, seasonality and biotransformation of TAM still remains to be elucidated.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-09-13T17:47:07Z No. of bitstreams: 1 MauricioFernandes.pdf: 1547228 bytes, checksum: 87d9e63be597d8eaf8f7a783479e1294 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T17:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MauricioFernandes.pdf: 1547228 bytes, checksum: 87d9e63be597d8eaf8f7a783479e1294 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão / INTRODUCTION: In Brazil, it is reported that a great part of the patients who arrive for the primary care service have as main complaint: sadness (depression) and / or anxiety, also with more complex disorders such as problems related to abuse of alcohol and serious and persistent mental disorders, such as schizophrenia and affective psychoses (bipolar mood disorder). In the pharmacogenetic studies of antidepressants and antipsychotics, cytochrome P450 (CYPs) enzymes have been shown to be one of the most significant targets in the interindividual changes in drug response kinetic parameters. OBJECTIVE: To characterize the frequency of CYP2D6 polymorphisms (*4, *6 and *17) in users of psychotropic therapy, especially tricyclic antidepressants and antipsychotics. METHODS: Cross - sectional, descriptive study carried out in the city of São Luis – MA. RESULTS: From a total of 105 charts, a sample of 43 patients was collected. The mean age was 40.98 (± 11.04) years, of which 24 (55.81%) were male and 19 (44, 19%) of females. Regarding the pharmacotherapy, all participants (100%) were on daily use of the antipsychotic haloperidol, seventeen (39.53%) patients used risperidone and one (2.32%) patient used amitriptyline (tricyclic antidepressant), all three drugs are substrates of the enzyme CYP2D6. For the polymorphism of CYP2D6, we had a prevalence of 11 (25.48%) for allele 4, and all the patients presented with this polymorphism were heterozygous, that means they had one polymorphic allele and one normal allele. For allele 17, we had a prevalence of 4 (9.3%), also all patients being heterozygous for this allele. Allele 6 did not appear in any patient in our study. We also had two patients who presented the polymorphisms for alleles * 4 and * 17 at the same time. CONCLUSION: This study was able to characterize the frequency of CYP2D6 (* 4, * 6 and 17 *) polymorphisms in users of psychotropic therapy, including tricyclic antidepressants and antipsychotics, in addition to contributing to a higher dose / response do medication, ensuring greater safety and efficacy in the use of medicines, improving the quality of life of patients. / INTRODUÇÃO: No Brasil, tem-se o relato de que grande parte dos pacientes que chegam para o atendimento na atenção primária apresentam, como principal queixa, tristeza (depressão) e/ou ansiedade, aparecendo também transtornos mais complexos como os problemas relacionados ao abuso de álcool, assim como os transtornos mentais graves e persistentes, como a esquizofrenia e as psicoses afetivas (transtorno bipolar do humor). Nos estudos farmacogenéticos de antidepressivos e antipsicóticos, as enzimas do citrocromo P450 (CYPs) tem se mostrado um dos alvos mais significativos nas alterações interindividuais dos parâmetros cinéticos de resposta às drogas. OBJETIVO: caracterizar a frequência de polimorfismos do CYP2D6 (*4, *6 e 17*) em usuários da terapêutica com psicotrópicos, principalmente antidepressivos tricíclicos e antipsicóticos. MÉTODOS: Estudo transversal, descritivo realizado no Município de São Luís (MA). RESULTADO: De um total de 105 prontuários, coletou-se amostra de 43 pacientes, a média de idade foi de 40,98 (±11,04) anos, sendo 24 (55,81%) do sexo masculino e 19 (44,19%) do sexo feminino. Em relação à farmacoterapia, todos os participantes (100%) estavam em consumo diário do antipsicótico haloperidol, dezessete (39,53%) pacientes faziam uso de risperidona e um (2,32%) paciente utilizava amitriptilina (antidepressivo tricíclico), todos os três medicamentos são substratos da enzima CYP2D6. Para o polimorfismo da CYP2D6, tivemos para o alelo 4 uma prevalência de 11 (25,48%), sendo que todos os pacientes que apresentaram esse polimorfismo são heterozigotos, ou seja, apresentaram um alelo polimórfico e outro normal. Para o alelo 17, tivemos uma prevalência de 4 (9,3%), sendo também todos os pacientes heterozigotos para esse alelo. O alelo 6 não apareceu em nenhum paciente do nosso estudo. Tivemos também dois pacientes que apresentaram os polimorfismos para os alelos *4 e *17 ao mesmo tempo. CONCLUSÃO: Este estudo pôde caracterizar a frequência de polimorfismos do CYP2D6 (*4, *6 e 17*) em usuários da terapêutica com psicotrópicos, incluindo antidepressivos tricíclicos e antipsicóticos, além de contribuir para uma maior adequação da relação dose/resposta ao medicamento, garantindo maior segurança e eficácia quanto ao uso de medicamentos, melhorando a qualidade de vida dos pacientes.