Le cytomégalovirus humain (CMV) est un Herpèsvirus causant une infection latente chez 60% à 70% des nords-américains. Sa primo-infection chez les nouveaux-nés et sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associées à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. Le traitement des infections au CMV est compliqué par l'absence de vaccin et le nombre restreint de drogues homologuées. Ces dernières sont malheureusement issues de vieilles générations de composés, et sont associées à une activité modérée, à une importante toxicité, et à l'apparition fréquente de résistance au traitement. Ces composés ciblent tous l'ADN polymérase virale, et inhibent ainsi la réplication du virus. Cependant, comparativement aux autres polymérases virales, cette enzyme est bien peu caractérisée, ce qui limite le développement de composés thérapeutiques de seconde génération plus efficaces, moins toxiques et moins sujets à l'apparition de résistance virale. Ayant entendu ce signal d'alarme, nous avons entrepris de caractériser la principale cible thérapeutique du cytomégalovirus humain, son ADN polymérase. Le gène UL54 du CMV code une protéine de 1242 acides aminés et qui est connue pour être la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase virale. Malheureusement, sa grande taille a longtemps limité son expression et sa caractérisation. En nous concentrant sur les régions importantes pour son activité, nous avons généré une protéine un peu plus courte, mais toujours catalytiquement active. Nous avons ainsi pu exprimer, pour la première fois, une grande quantité de protéines UL54, ce qui nous a permis de caractériser en détails sa liaison avec ses deux substrats principaux, soit l'ADN et les dNTP. L'emploi de la spectroscopie à fluorescence nous a permis de suivre la liaison de UL54 à ses substrats, en quantifiant l'impact de la liaison de ces derniers sur la fluorescence intrinsèque du tryptophane de UL54. Nous avons ainsi pu établir que les constantes de dissociation de UL54 pour l'ADN et pour les dNTP étaient respectivement de 48[micro]M et de 15[micro]M. Notre étude révèle qu'un substrat d'ADN aussi petit que 6nt peut lier la protéine. Nous avons aussi démontré que UL54 lie aussi bien l'ADNsb que l'ADNdb, et que cette liaison semble séquence indépendante. De plus, la protéine est incapable de discriminer entre un substrat d'ADN et un d'ARN. Le profil thermodynamique de la liaison à l'ADN et aux dNTP a été établi et révèle deux modes de liaison distincts. La liaison de l'ADN est propulsée par l'enthalpie et est fort probablement associée à la relâche de molécules d'eau au solvant. Les interactions hydrophobes et d'empilement représentent les forces majeures stabilisant la liaison, alors que les interactions électrostatiques sont presque négligeables. À l'inverse, la liaison de UL54 au dNTP est propulsée par l'enthalpie, et la stabilisation de la liaison est associée davantage aux interactions électrostatiques, à des ponts hydrogènes et aux forces de van der Waal's. Des essais de dichroïsme circulaire, une seconde technique optique qui peut générer une représentation des structures secondaires et tertiaires d'une protéine, indique que, suite à la liaison de l'ADN, la protéine UL54 opère un changement de conformation, et qu'elle en subit un second suite à la liaison d'un dNTP, ce qui est cohérent avec les changements de conformation observés chez d'autres polymérases mieux caractérisées. Quelques expériences complémentaires sont aussi présentées. Enfin, comme les résistances aux traitements sont un enjeu majeur, et qu'elles sont créées par des erreurs de UL54, l'élaboration d'une démarche expérimentale visant à établir la fidélité de cette protéine est décrite en détail. Nous sommes confiants qu'une telle étude sur la caractérisation biochimique de la principale cible pharmacologique du CMV contribuera au développement rationnel de nouvelles générations de drogues anticytomégaloviriques efficaces.

Le traitement de cellules par des aminobisphosphonates (ABP) induit une accumulation intracellulaire de molécules activatrices des lymphocytes T Vy9Vd2 (IPP, ApppI). Alors que ces lymphocytes ne semblent pas naturellement activés lors d'une infection par le cytomégalovirus humain (HCMV), le laboratoire a mis en évidence l'existence d'une action synergique entre le HCMV et les ABP sur leur activation. Ma thèse a eu pour objectif d'analyser le mécanisme de cette synergie et d'évaluer le potentiel immuno-thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection HCMV. Nous avons montré qu'après sensibilisation par des ABP in vitro, des cellules infectées sont fortement activatrices des T Vy9Vd2. Les fibroblastes traités par des ABP activent la production d'IFN-y par les T Vy9Vd2 mais pas la production de TNF. L'infection de ces fibroblastes par le HCMV induit une augmentation de la production d'IFN-y et stimule la production de TNF par des T Vy9Vd2. Cette activation a été observée avec des lymphocytes T Vy9Vd2 établis en lignées cellulaires mais aussi avec des cellules Vy9Vd2 isolées directement de sang périphérique. De plus, cette augmentation de production de cytokines est observée avec différentes souches virales (souche de laboratoire et isolats cliniques) et différents types cellulaires permissifs pour HCMV. Nous avons également montré que l'infection par le HCMV entraine une surproduction d'IPP et d'ApppI dans les cellules cibles traitées aux ABP, ce qui explique en partie l'augmentation de la sécrétion de cytokines par les T Vy9Vd2. Enfin, nous avons mis en évidence que ces T Vy9Vd2 sont capables de limiter la réplication et la production virale suite à un traitement par des ABP, tout en préservant les cellules non infectées. Selon nos études, cette activité antivirale implique la production des cytokines IFN-y et TNF et non l'activité cytotoxique des T Vy9Vd2. Par conséquent, mes travaux de thèse fournissent une preuve de concept pour une application thérapeutique des ABP dans le cadre d'une infection par le HCMV. / Aminobisphosphonates (ABP) treatment of cells induces intracellular accumulation of molecules (IPP, ApppI) which stimulate human Vy9Vd2 T cells. Although these lymphocytes do not appear naturally activated during human cytomegalovirus (HCMV) infection, the laboratory demonstrated a synergistic effect of HCMV and ABP on Vy9Vd2 T cell activation. My PhD thesis aimed to analyze the mechanism of this synergy and evaluate the immunotherapeutic potential of ABP in the context of HCMV infection. After ABP treatment of cells in vitro, we showed that HCMV-infected cells strongly activated Vy9Vd2 T cells. ABP-treated fibroblasts activate Vy9Vd2 T cells to produce IFN-y but not TNF. The HCMV infection of these fibroblasts stimulates TNF secretion and an increased production of IFN-y, indicating that Vy9Vd2 cells can sense HCMV infection. Increased cytokine production was observed with Vy9Vd2 T cell lines and "fresh" Vy9Vd2 directly isolated of blood. Moreover, Vy9Vd2 T cell activation was observed with most HCMV strains (laboratory strains or clinical isolates) and different HCMV-permissive cells. We also showed that HCMV infection induces an overproduction of IPP and ApppI in ABP-treated cells, which explains in part the increased cytokine production by Vy9Vd2 T cells. At last, we demonstrated the capacity of Vy9Vd2 T cells to limit viral replication and production after ABP treatment while preserving uninfected cells. Our experiments indicate that this antiviral activity involves IFN-y and TNF secretion by Vy9Vd2 T cells but not their cytotoxicity activity. Consequently, my work provides a proof of concept of the therapeutic potential of ABP in the context of HCMV infection.

Le cytomégalovirus humain (HCMV), un membre de la famille des Herpesviridae, cause des infections latentes chez plus de la moitié (60 %) de la population dans les pays développés. Cette proportion peut atteindre jusqu’à la totalité (100%) de la population dans les pays en voie de développement. Sa primo-infection chez le foetus en développement ou chez le nouveau-né ainsi que sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associés à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. L’infection congénitale est l’infection à HCMV la plus importante et engendre un coût économique de plus de 2 milliards de dollars américains chaque année. Aucun vaccin n’est approuvé à ce jour pour la prévention de l’infection à HCMV. Cependant, des antiviraux sont disponibles pour le traitement de cette infection. Parmi ceux-ci, on retrouve trois types d’analogues : un analogue nucléosidique (ganciclovir), un analogue nucléosidique monophosphaté (cidofovir) et un analogue du pyrophosphate inorganique (foscarnet). Ces antiviraux ont tous comme cible commune l’ADN polymérase virale. Toutefois, de nombreuses souches résistantes à ces antiviraux sont retrouvées chez certains individus infectés. Ces souches résistantes présentent de nombreuses mutations au niveau du gène viral qui encode pour l’ADN polymérase UL54 du cytomégalovirus. Jusqu’à présent dans la littérature, seule l’association entre les mutations et la résistance antivirale a été proposée. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à mieux comprendre l’effet des mutations sur la liaison des antiviraux à la polymérase et donc éventuellement élucider le mécanisme moléculaire de résistance aux antiviraux chez ce pathogène. Cette recherche a permis de déterminer que les mutations, associées à la résistance antivirale, affectent la liaison optimale des désoxynucléotides (dNTPs) et bloquent la liaison de l’antiviral (foscarnet) à l’ADN polymérase virale UL54. Toutefois, ces mutations n’affectent pas la liaison de l’ADN simple brin à celle-ci. De plus, selon l’étude présentée ici, les mutations n’affectent pas le repliement global de l’ADN polymérase virale. Le mécanisme de résistance moléculaire semble donc avoir un impact très local sur la protéine. Peu d’informations sur la structure de cette polymérase virale sont disponibles à ce jour dans la littérature. Il serait donc pertinent d’élucider la structure cristallographique de cette polymérase pour éventuellement étudier l’effet structural des mutations sur la polymérase et ainsi élucider le ou les mécanismes moléculaires de résistance aux antiviraux.