Les levures non conventionnelles, dont Yarrowia lipolytica, sont devenues desusines cellulaires attractives pour la production de protéines recombinantes. Lasélection de promoteurs régulés impliqués dans le métabolisme de substratshydrophobes est d'un grand intérêt pour une telle application. Dans ce cadre,l’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régulation des promoteurs desgènes POX2 et LIP2 dans le but d’améliorer la production de protéinesrecombinantes chez Y. lipolytica.D’un point de vue biotechnologique, l'analyse à l’échelle cellulaire est devenueune approche répandue pour l’analyse et l’optimisation des bioprocédés. Ainsi,l'objectif de la première partie de ce projet vise le développement d’une méthoded’analyse en ligne des paramètres de culture Y. lipolytica dans un milieu contenantde l’acide oléique. Cette technique consiste au couplage d’un bioréacteur à uncytomètre en flux via une interface d’échantillonnage automatique. Cetteméthodologie a conduit principalement à une analyse rapide de la croissancecellulaire, de l'accumulation des lipides, du dimorphisme ainsi qu’à l'analyse duniveau d’induction des promoteurs chez Y. lipolytica.Les systèmes d’expression basés sur les promoteurs LIP2 et POX2 sont difficilesà manipuler, principalement en raison de l’utilisation de substrats insolubles dansl’eau (acide oléique) comme inducteur. Dans ce travail, il a été clairement démontréque pLIP2 est le promoteur de choix à utiliser pour développer un procédé deproduction de protéines recombinantes par culture de Y. lipolytica dans un milieucomplexe. De plus, l’utilisation d’un mélange acide oléique-glucose 60/40 (w/w) aconduit à une amélioration du niveau d’induction du promoteur LIP2 par un facteurde 10 par rapport à utilisation l'acide oléique. De plus, l’analyse à l’échelle cellulairemontre que ces deux substrats sont co-consommés par les cellules.Enfin, la dernière partie de cette thèse a eu pour but d'étudier la régulation dupromoteur LIP2 par rapport à la transition dimorphique. Nos résultats ont clairement montré que le changement morphologique chez Y. lipolytica n'a pas d'impact sur larégulation de pLIP2.L’ensemble de ces études a conduit à une meilleure compréhension de laphysiologie de Y. lipolytica, soulignant son potentiel avéré de production desprotéines recombinantes. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le développement des bactéries sporulées dans les aliments peut être responsable d’intoxication alimentaire ou d’altérations des produits. Trois leviers ont été identifiés pour prévenir le développement de ce microbiote : les conditions de sporulation, l’intensité du traitement appliqué pour inactiver les spores et les conditions d’incubation. Ce travail de thèse a pour objectif (i) de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement et d’incubation sur la capacité des spores à former des colonies, et (ii) de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement et d’incubation sur les cinétiques de germination et de reprise de croissance. Dans un premier temps, un modèle mathématique a été développé pour décrire et quantifier l’impact des conditions d’incubation sur la capacité des spores à former des colonies après un traitement thermique. Ce modèle intègre uniquement des paramètres physiologiques, les limites de croissance des souches étudiées. La germination et la reprise de croissance est un processus complexe au cours duquel les spores passent par plusieurs stades successifs : spores dormantes, spores germées et cellules végétatives. Afin de quantifier l’impact des conditions de sporulation, de traitement thermique et d’incubation sur chacun de ces stades, une méthode par cytométrie en flux a été développée. Elle a permis de suivre l’évolution de chaque stade au cours du temps et un modèle primaire a été proposé afin de décrire l’évolution de chacun de ces stades. A partir de ce modèle il a été possible de décrire l’impact des différentes conditions de sporulation, de traitement thermique et d’incubation sur cette évolution et un modèle secondaire a été développé pour quantifier l’impact de ces facteurs sur les cinétiques de germination et de reprise de croissance. Afin de corréler les différences de comportement avec la composition protéique des spores, une analyse protéomique a été réalisée sur des spores produites dans différentes conditions. Ces travaux permettent de mieux appréhender le comportement de germination et de reprise de croissance des spores bactériennes. De plus, les résultats apportés ainsi que les modèles mathématiques développés dans cette thèse pourront permettre de mieux contrôler le développement des bactéries sporulées en industrie agro-alimentaire, connaissant l’impact des conditions de stockage et de formulation des produits, comme la température et le pH, sur le comportement des spores. / The development of spore forming bacteria in foods can be responsible for food poisoning or food spoilage. Three levers allowing the development of this microbiota were identified: the conditions of sporulation, the conditions of heat treatment and the conditions of incubation. This PhD work objectives were (i) to quantify the impact of sporulation conditions, heat treatment intensity and recovery conditions of the ability of spores to form colonies, and (ii) to quantify the impact of sporulation conditions, heat treatment intensity and recovery conditions on germination and outgrowth kinetics. Firstly, a mathematical model was developed to describe and quantify the impact of recovery conditions on the spore ability to form colonies a heat treatment. This model integrated only physiological parameters, the growth limits. The germination and outgrowth is a complex process made of successive physiological stages the spores pass through: the dormant spores, the germinated spores and the vegetative cells. A flow cytometry method was developed in order to quantify the impact of sporulation conditions, the heat treatment intensity and the incubation conditions on each physiological stage. This method allowed monitoring the evolution of each stage over time and a primary model was proposed to describe these evolutions. Thanks to this model, the impact of sporulation conditions, the heat treatment intensity and the incubation conditions were quantified and a secondary model was developed to quantify the impact of these factors on germination and outgrowth kinetics. In order to correlate the differences of behavior with the proteome of spores, proteomic analysis were performed on spores produced in different conditions. This work allows a better comprehension of germination and outgrowth behavior. Moreover, the results and the mathematical models provided by this work can be applied in food industry to improve the control of spores forming bacteria development knowing the impact of storage conditions and the product formulation, like temperature and pH, on spore behavior.

Cette thèse a conduit à la mise au point de deux nouvelles approches statistiques pour l'identification automatique de populations cellulaires en cytometrie de flux multiparamétrique, et ceci pour le traitement d'un grand nombre d'échantillons, chaque échantillon étant prélevé sur un donneur particulier. Ces deux approches répondent à des besoins exprimés dans le cadre du projet Labex «Milieu Intérieur». Dix panels cytométriques de 8 marqueurs ont été sélectionnés pour la quantification des populations principales et secondaires présentes dans le sang périphérique. Sur la base de ces panels, les données ont été acquises et analysées sur une cohorte de 1000 donneurs sains.Tout d'abord, nous avons recherché une quantification robuste des principales composantes cellulaires du système immunitaire. Nous décrivons une procédure computationnelle, appelée FlowGM, qui minimise l'intervention de l'utilisateur. Le cœur statistique est fondé sur le modèle classique de mélange de lois gaussiennes. Ce modèle est tout d'abord utilisé pour obtenir une classification initiale, le nombre de classes étant déterminé par le critère d'information BIC. Après cela, une méta-classification, qui consiste en l'étiquetage des classes et la fusion de celles qui ont la même étiquette au regard de la référence, a permis l'identification automatique de 24 populations cellulaires sur quatre panels. Ces identifications ont ensuite été intégrées dans les fichiers de cytométrie de flux standard (FCS), permettant ainsi la comparaison avec l'analyse manuelle opérée par les experts. Nous montrons que la qualité est similaire entre FlowGM et l'analyse manuelle classique pour les lymphocytes, mais notamment que FlowGM montre une meilleure discrimination des sous-populations de monocytes et de cellules dendritiques (DC), qui sont difficiles à obtenir manuellement. FlowGM fournit ainsi une analyse rapide de phénotypes cellulaires et se prête à des études de cohortes.A des fins d'évaluation, de diagnostic et de recherche, une analyse tenant compte de l'influence de facteurs, comme par exemple les effets du protocole, l'effet de l'âge et du sexe, a été menée. Dans le contexte du projet MI, les 1000 donneurs sains ont été stratifiés selon le sexe et l'âge. Les résultats de l'analyse quantitative faite avec FlowGM ont été jugés concordants avec l'analyse manuelle qui est considérée comme l'état de l'art. On note surtout une augmentation de la précision pour les populations CD16+ et CDC1, où les sous-populations CD14loCD16hi et HLADRhi CDC1 ont été systématiquement identifiées. Nous démontrons que les effectifs de ces deux populations présentent une corrélation significative avec l'âge. En ce qui concerne les populations qui sont connues pour être associées à l'âge, un modèle de régression linéaire multiple a été considéré qui fournit un coefficient de régression renforcé. Ces résultats établissent une base efficace pour l'évaluation de notre procédure FlowGM.Lors de l'utilisation de FlowGM pour la caractérisation détaillée de certaines sous-populations présentant de fortes variations au travers des différents échantillons, par exemple les cellules T, nous avons constaté que FlowGM était en difficulté. En effet, dans ce cas, l'algorithme EM classique initialisé avec la classification de l'échantillon de référence est insuffisant pour garantir l'alignement et donc l'identification des différentes classes entre tous échantillons. Nous avons donc amélioré FlowGM en une nouvelle procédure FlowGMP. Pour ce faire, nous avens ajouté au modèle de mélange, une distribution a priori sur les paramètres de composantes, conduisant à un algorithme EM contraint. Enfin, l'évaluation de FlowGMP sur un panel difficile de cellules T a été réalisée, en effectuant une comparaison avec l'analyse manuelle. Cette comparaison montre que notre procédure Bayésienne fournit une identification fiable et efficace des onze sous-populations de cellules T à travers un grand nombre d'échantillons. / In the course of my Ph.D. work, I have developed and applied two new computational approaches for automatic identification of cell populations in multi-parameter flow cytometry across a large number of samples. Both approaches were motivated and taken by the LabEX "Milieu Intérieur" study (hereafter MI study). In this project, ten 8-color flow cytometry panels were standardized for assessment of the major and minor cell populations present in peripheral whole blood, and data were collected and analyzed from 1,000 cohorts of healthy donors.First, we aim at robust characterization of major cellular components of the immune system. We report a computational pipeline, called FlowGM, which minimizes operator input, is insensitive to compensation settings, and can be adapted to different analytic panels. A Gaussian Mixture Model (GMM) - based approach was utilized for initial clustering, with the number of clusters determined using Bayesian Information Criterion. Meta-clustering in a reference donor, by which we mean labeling clusters and merging those with the same label in a pre-selected representative donor, permitted automated identification of 24 cell populations across four panels. Cluster labels were then integrated into Flow Cytometry Standard (FCS) files, thus permitting comparisons to human expert manual analysis. We show that cell numbers and coefficient of variation (CV) are similar between FlowGM and conventional manual analysis of lymphocyte populations, but notably FlowGM provided improved discrimination of "hard-to-gate" monocyte and dendritic cell (DC) subsets. FlowGM thus provides rapid, high-dimensional analysis of cell phenotypes and is amenable to cohort studies.After having cell counts across a large number of cohort donors, some further analysis (for example, the agreement with other methods, the age and gender effect, etc.) are required naturally for the purpose of comprehensive evaluation, diagnosis and discovery. In the context of the MI project, the 1,000 healthy donors were stratified across gender (50% women and 50% men) and age (20-69 years of age). Analysis was streamlined using our established approach FlowGM, the results were highly concordant with the state-of-art gold standard manual gating. More important, further precision of the CD16+ monocytes and cDC1 population was achieved using FlowGM, CD14loCD16hi monocytes and HLADRhi cDC1 cells were consistently identified. We demonstrate that the counts of these two populations show a significant correlation with age. As for the cell populations that are well-known to be related to age, a multiple linear regression model was considered, and it is shown that our results provided higher regression coefficient. These findings establish a strong foundation for comprehensive evaluation of our previous work.When extending this FlowGM method for detailed characterization of certain subpopulations where more variations are revealed across a large number of samples, for example the T cells, we find that the conventional EM algorithm initiated with reference clustering is insufficient to guarantee the alignment of clusters between all samples due to the presence of technical and biological variations. We then improved FlowGM and presented FlowGMP pipeline to address this specific panel. We introduce a Bayesian mixture model by assuming a prior distribution of component parameters and derive a penalized EM algorithm. Finally the performance of FlowGMP on this difficult T cell panel with a comparison between automated and manual analysis shows that our method provides a reliable and efficient identification of eleven T cell subpopulations across a large number of samples.

Ce travail porte sur différentes méthodes de détection de protéines par des anticorps (Acs) marqués par des boîtes quantiques (QD, « quantum dots »). La première partie de la thèse porte sur le développement et l'optimisation de méthodes de conjugaison d'Acs polyclonaux à des QDs. Une étude de 2007 avait démontré que les conjugués anticorps-quantum dots (Acs-QDs) commerciaux ne présentent que de très rares anticorps fonctionnels à leur surface [Pathak et al., 2007]. Nous avons donc : (i) développé des conditions de réduction ménagée des ponts disulfures des Acs en utilisant soit du dithiothreitol, soit du 2-mercapotethanolamine, (ii) purifié les fragments d'Acs fonctionnels grâce à une colonne d'affinité, (iii) conjugué ces fragments fonctionnels d'Acs aux QDs en utilisant l'agent de liaison amine-thiol SMCC et (iv) développé une méthode de purification des conjugués sur gel d'agarose afin d'éliminer les fragments d'Acs non conjugués et les QDs libres. Des tests en cytométrie en flux ont permis de déterminer l'efficacité des conjugués pour détecter l'expression de la molécule CD4 à la surface de lymphocytes T humains. Un marquage de CD4 réalisé avec des conjugués préparés selon notre méthode s'avère être cinq fois plus sensible qu'en utilisant des conjugués réalisés selon les recommandations commerciales. Une autre méthode de préparation des Acs pour la conjugaison aux QDs a été testée : l'ajout de groupements fonctionnels sulfhydriles sur des amines primaires grâce au N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). Cependant, cette méthode ne permet pas d'avoir un contrôle précis du nombre ni de l'emplacement des groupements fonctionnels sulfhydriles ainsi ajoutés. Les tests de conjugaison aux QDs qui ont été réalisés avec ces Acs-SH, en utilisant l'agent de liaison SMCC, a entraîné la formation d'agrégats de taille variable. Cette méthode a donc été abandonnée.La seconde partie de la thèse porte sur la démonstration de la faisabilité et l'optimisation d'un marquage de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA, « carcinoembryonic antigen ») humain à la surface de lignées cellulaires murines avec un anticorps simple domaine (sdAb) anti-CEA biotinylé détecté grâce à des conjugués streptavidine-QDs commerciaux et analysé par cytométrie en flux. Ces sdAbs ont été biotinylés selon deux approches : (i) avec des agents de biotinylation chimique qui permettent d'ajouter une biotine sur les amines primaires (biotinylation in vitro) et (ii) par une enzyme lors de leur production par E. coli (biotinylation in vivo). La détection du CEA humain à la surface des 100 000 cellules (lignées cellulaires murine MC38 et MC38-CEA) par ces sdAbs biotinylés a été testée en cytométrie de flux puis comparée à celle obtenue par un anticorps monoclonal biotinylé in vitro. Les résultats ont démontré que les sdAbs biotinylés ont une sensibilité de détection similaire que la biotinylation soit réalisée in vitro ou in vivo. Par contre, la sensibilité de la détection du CEA est environ cinquante fois meilleure en utilisant des sdAbs biotinylés (0,6 fmol d'anticorps sont nécessaires pour détecter le CEA) qu'avec des anticorps monoclonaux biotinylés (33 fmol). / We have been working on different ways to detect proteins with antibodies (Abs) labeled by quantum dots (QDs). The first part of his work is to develop and optimize the conjugation of polyclonal antibodies to quantum dot. A study has reported that commercial antibody-quantum dots conjugates (Abs-QDs) present very few functional Ab fragments at the surface of the conjugate [Pathak et al., 2007]. We had: (i) developed an advanced procedure of antibody reduction using dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanolamine (2-MEA) (to prevent the loss of antibody functions), (ii) purified the active fragments by affinity purification on column, (iii) conjugated the active reduced antibody fragments to QDs using the amine-thiol crosslinker SMCC for SH coupling, and (iv) developed the purification of the conjugates on agarose gel to remove free QDs and unconjugated antibody fragments. Our conjugates present about a five times better ability to detect CD4 by flow cytometry on 500 000 isolated human lymphocyte T cells than those made after the commercial procedure. Another procedure for antibody preparation was addition of sulfhydryl groups on primary amines using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). However this procedure presents some variable yield and the number and the localization of sulfhydryl groups added on antibody cannot be fully controlled. Thereby, the conjugation of these Abs-SH to QDs using SMCC chemistry leads to the creation of aggregates. This Ab preparation in preparation for conjugation to QDs was abandoned.The second part of our work focusses on testing and comparing the ability to detect carcinoembryonic antigen (CEA) by flow cytometry with anti-CEA single domain antibodies (sdAbs) labeled by QDs. The sdAbs were biotinylated by using two methods: (i) in vitro chemical biotinylation reagent which adds biotins on primary amines, and (ii) enzymatic in vivo biotinylation during their production in E. coli. These anti-CEA sdAb biotinylation methods were compared to in vitro biotinylated monoclonal Abs against CEA for their respective ability to detect human CEA on 100 000 mice cells (MC38 and MC38-CEA cell lines) using flow cytometry. The results show that the limit detection for biotinylated sdAbs is similar between in vitro and in vivo biotinylation. Furthermore the limit detection with biotinylated sdAb (0.6 fmol are required to detect CEA) is about fifty times better than with biotinylated monoclonal Abs (33 fmol).

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