DGCR8 (DiGeorge critical region 8) protein constitutes part of the Microprocessor complex together with Drosha, and is involved in the nuclear phase of microRNA (miRNA) biogenesis. DGCR8 recognises the hairpin RNA substrates of precursor miRNAs through two double-stranded RNA (dsRNA) binding motifs and acts as a molecular anchor to direct Drosha cleavage at the base of the pri-miRNA hairpin. Recent characterisation of the RNA targets of the Microprocessor by HITSCLIP of DGCR8 protein revealed that this complex also binds and regulates the stability of several types of transcripts, including mRNAs, lncRNAs and retrotransposons. Of particular interest is the binding of DGCR8 to mature small nucleolar RNA (snoRNA) transcripts, since the stability of these transcripts is dependent on DGCR8, but independent of Drosha. This raises the interesting possibility that there could be alternative DGCR8 complex/es using different nucleases to process a variety of cellular RNAs. We performed mass spectrometry experiments and revealed that DGCR8 copurifies with subunits of the nucleolar exosome, which contains the exonuclease RRP6. We demonstrated DGCR8 and the exosome form a nucleolar complex, which degrade the mature snoRNAs tested within this study. Interestingly, we also show that DGCR8/exosome complex controls the stability of the human telomerase RNA component (hTR/TERC), and absence of DGCR8 creates a concomitant telomere phenotype. In order to identify the RNA targets of the DGCR8/Exosome complex on a global scale we performed iCLIP of endogenous and overexpressed RRP6 (wild-type and a catalytically inactive form). Thus, intersection of CLIP datasets from DGCR8 and RRP6 identified common substrates; accordingly snoRNAs were the most represented. In addition, we identified the cellular RNA targets of the RRP6 associated human exosome. The use of a catalytically inactive form of RRP6 stabilised important in vivo interactions that are highly dynamic and transient and also highlighted the role of RRP6-mediated trimming of 3’flanks of immature non-coding RNAs. We will present a global view of the RNA-binding capacity of the RRP6-associated exosome. In sum, we identified a novel function for DGCR8, acting as an adaptor to recruit the exosome to structured RNAs and induce their degradation. Moreover, we have identified DGCR8-depenedent substrates of the exosome and have demonstrated the requirement of RRP6 for 3’ processing of ncRNAs.

Les micro-ARNs (miRNAs) sont des ARNs de 20-22 nucléotides, transcrits à partir du génome, dont la fonction est de réguler l’expression génique en s’appariant à des ARNm cibles, inhibant ainsi leur traduction et/ou entrainant leur dégradation. Dans les cancers, l’expression des miRNAs est fortement dérégulée. Une majorité de miRNAs est diminuée dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux, et un lien causal a été décrit entre inhibition globale des miRNAs et tumorigenèse. Par ailleurs, des miRNAs agissant comme des suppresseurs de tumeurs et d’autres comme des oncogènes ont été décrits. Dans ce contexte impliquant de plus en plus les miRNAs dans les pathologies néoplasiques, l’objectif de ce travail était d’étudier le rôle de la voie miRNA dans la biologie des cellules tumorales. Afin d’identifier des cellules tumorales dépendant de miRNAs oncogènes endogènes pour survivre ou proliférer, nous avons développé une stratégie d’inhibition globale de la biogenèse des miRNAs en ciblant Drosha ou DGCR8, les deux composants du microprocesseur, complexe nucléaire de maturation des miRNAs. Cette stratégie nous a permis d’identifier des lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l’inhibition du microprocesseur conduit à un phénotype d’arrêt de prolifération durable. Nous avons mis à profit cette dépendance à la voie miRNA pour réaliser un crible positif de complémentation du défaut de prolifération observé grâce à l’expression de miRNAs individuels. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des miRNAs capables de soutenir individuellement la prolifération de ces cellules tumorales. Cette stratégie nous a également permis de montrer des différences fonctionnelles entre miRNAs homologues ou de la même famille. La recherche des cibles régulées par ces miRNAs nous a permis d’élaborer des hypothèses concernant les cibles potentiellement impliquées dans le phénotype observé. Nous avons ainsi démontré la participation du suppresseur de tumeur PTEN à l’arrêt de prolifération induit par l’inhibition du microprocesseur. La stratégie d’inhibition globale de la voie miRNA suivie d’une complémentation phénotypique par des miRNAs individuels permet de s’affranchir de la grande redondance de séquence et de fonction des miRNAs et devrait pouvoir s’appliquer d’une manière plus générale à l’étude d’autres processus régulés par les miRNAs. / MicroRNAs (miRNAs) are 20-22 nucleotides RNAs, transcribed from the genome, which regulate gene expression by base-pairing to target mRNAs, thus inhibiting their translation and/or leading to their degradation. In cancers, miRNAs expression is strongly deregulated. A majority of miRNAs is diminished in tumoral tissues compared to normal tissues, and a causal link has been established between global inhibition of the miRNA pathway and tumorigenesis. In addition, miRNAs acting like tumor suppressors or oncogenes have been described. In this context of growing evidences implicating miRNAs in neoplasic diseases, this work aimed to investigate the role played by miRNA pathway in the biology of tumoral cells. In order to identify tumoral cells depending on endogenous oncogenic miRNAs to proliferate or survive, we developed a strategy of global inhibition of miRNAs biogenesis by targeting Drosha or DGCR8, the two components of the “microprocessor”, the nuclear miRNA maturation complex. This strategy allowed us to identify tumoral cell lines in which microprocessor inhibition led to a sustained growth arrest. We took advantage of this miRNA pathway dependency to screen for individual miRNAs able to complement the observed growth defect. This complementation screen allowed us to identify individual miRNAs able to sustain growth in those tumoral cells. This strategy also highlighted functional differences between homologous miRNAs or between miRNAs from the same family. The search for targets regulated by those miRNAs allowed us to develop hypothesis concerning the potential targets involved in the observed phenotype. By using this approach, we demonstrated that the tumor suppressor PTEN was involved in the growth arrest induced by microprocessor inhibition. The strategy of global miRNA pathway inhibition followed by phenotypic complementation by individual miRNAs allows overcoming the high sequence and function redundancy of miRNAs. We thus think it could be applied more generally to the study of other cellular processes regulated by miRNAs.

Les micro-ARNs (miRNAs) sont des ARNs de 20-22 nucléotides, transcrits à partir du génome, dont la fonction est de réguler l'expression génique en s'appariant à des ARNm cibles, inhibant ainsi leur traduction et/ou entrainant leur dégradation. Dans les cancers, l'expression des miRNAs est fortement dérégulée. Une majorité de miRNAs est diminuée dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux, et un lien causal a été décrit entre inhibition globale des miRNAs et tumorigenèse. Par ailleurs, des miRNAs agissant comme des suppresseurs de tumeurs et d'autres comme des oncogènes ont été décrits. Dans ce contexte impliquant de plus en plus les miRNAs dans les pathologies néoplasiques, l'objectif de ce travail était d'étudier le rôle de la voie miRNA dans la biologie des cellules tumorales. Afin d'identifier des cellules tumorales dépendant de miRNAs oncogènes endogènes pour survivre ou proliférer, nous avons développé une stratégie d'inhibition globale de la biogenèse des miRNAs en ciblant Drosha ou DGCR8, les deux composants du microprocesseur, complexe nucléaire de maturation des miRNAs. Cette stratégie nous a permis d'identifier des lignées cellulaires tumorales dans lesquelles l'inhibition du microprocesseur conduit à un phénotype d'arrêt de prolifération durable. Nous avons mis à profit cette dépendance à la voie miRNA pour réaliser un crible positif de complémentation du défaut de prolifération observé grâce à l'expression de miRNAs individuels. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des miRNAs capables de soutenir individuellement la prolifération de ces cellules tumorales. Cette stratégie nous a également permis de montrer des différences fonctionnelles entre miRNAs homologues ou de la même famille. La recherche des cibles régulées par ces miRNAs nous a permis d'élaborer des hypothèses concernant les cibles potentiellement impliquées dans le phénotype observé. Nous avons ainsi démontré la participation du suppresseur de tumeur PTEN à l'arrêt de prolifération induit par l'inhibition du microprocesseur. La stratégie d'inhibition globale de la voie miRNA suivie d'une complémentation phénotypique par des miRNAs individuels permet de s'affranchir de la grande redondance de séquence et de fonction des miRNAs et devrait pouvoir s'appliquer d'une manière plus générale à l'étude d'autres processus régulés par les miRNAs.