Abstract Billions of reared fish are released to the wild to compensate e.g. for the loss of natural populations. However, the efficiency of the releases is low. It has been proposed that one of the factors affecting the low survival rate of reared fish is their low swimming capacity. The molecular, metabolic and structural characters of muscle fiber define the swimming capacity of fish. Swimming capacity is related to the ecological competence of the fish, including the ability to complete long migrations and catch pray. One of the aims of the current study is to compare the properties of muscles of reared and wild salmon. The second aim of the study is to alter the muscular parameters of reared fish closer to those of wild fish by means of training. The muscular differences between wild, reared and trained fish are analyzed with immunological, histochemical and electron microscopic methods. The main focus is on the dihydropyridine and ryanodine receptors. These receptors are involved for example in the initiation, force and velocity of muscle contraction. According to the results, the level of receptors is higher in the muscles of wild as compared to reared fish. The aerobic ATP production capacity is also higher in the wild fish. However, with training both the level of receptors and oxidative capacity of reared fish increase. Moreover, the swimming capacity is enhanced in trained fish, and there is a connection between the level of receptors and swimming capacity of fish. Training also affects the migration pattern of fish which starts to resemble more that of wild fish. In conclusion, the results of the current study show that the performance of fish as a whole depends on functional parameters at cellular level. For the first time, it is shown that the level of receptors involved in muscular contraction is low in muscles of reared fish. However, the muscular properties are not definite. It is now shown that with training, both the muscular and migration parameters of reared fish approach those of wild fish. This will most probably increase the survival probability of trained, reared fish in the future. / Tiivistelmä Kalojen kasvatus ja istutus takaisin luontoon on yksi tärkeimmistä keinoista säädellä ja palauttaa kalakantoja vesistöihin. Maailmanlaajuisesti puhutaan miljardien kalojen istutusmääristä vuosittain. On kuitenkin hyvin tunnettu tosiasia, että kasvatetut kalat eivät selviä luonnossa yhtä hyvin kuin villit lajikumppaninsa. On arvioitu, että vain alle 5 % istutetuista kaloista selviää lisääntymisikään asti hengissä. Eräs tekijä, joka voi vaikuttaa kalojen selviytymiseen, on kalojen lihaskunto. Kasvatettujen kalojen uintikyvyn on todettu olevan heikko villeihin lajikumppaneihin verrattuna. Luonnossa kaloilta kuitenkin vaaditaan suurta uintikykyä esim. saalistukseen, pedoilta pakenemiseen ja vaellukseen. Eräs tämän työn päätavoitteista on määrittää, miten kasvatettujen ja villien kalojen lihasten molekulaariset, aineenvaihdunnalliset ja rakenteelliset ominaisuudet poikkeavat toisistaan, jotta voidaan arvioida mitkä solutason tekijät vaikuttavat kalojen uintikykyyn ja sitä kautta selviytymiseen. Toisaalta kasvatettujen kalojen lihasten toiminnallisten tekijöiden tasoja pyritään nostamaan harjoittelun avulla lähemmäksi villien vastaavaa ja täten vaikuttamaan kasvatettujen kalojen uintikykyyn ja sitä kautta lopulta selviytymiseen. Työssä lihasten ominaisuuksia analysoidaan immunologisin, histokemiallisin ja elektronimikroskooppisin menetelmin. Tutkimuksissa keskitytään erityisesti dihydropyridiini- ja ryanodiinireseptorien suhteellisiin määriin. Nämä reseptorit osallistuvat lihasten supistumisen aikaansaatiin ja niiden määrä korreloi positiivisesti lihasten voiman ja supistumisnopeuden kanssa. Tulosten mukaan villien kalojen lihaksissa on huomattavasti enemmän reseptoreita verrattuna kasvatettujen kalojen lihaksiin. Myös aerobinen ATP:n tuottokapasiteetti on villeillä kaloilla huomattavasti tehokkaampaa. Harjoittelun jälkeen kasvatettujen kalojen lihasten reseptorimäärät ja aerobinen kapasiteetti kuitenkin kasvavat lähemmäksi villien vastaavaa. Lisäksi lihasten reseptorimäärä ja uintikapasiteetti näyttävät korreloivan keskenään. Harjoittelun seurauksena kasvatettujen kalojen vaellusnopeus, eräs kalojen selviytymiseen vaikuttavista tekijöistä, muistuttaa myös enemmän villien vastaavaa. Yhteenvetona voidaan sanoa, että kalojen koko suorituskyky riippuu lihasten solutason mekanismien tehokkuudesta. Tässä työssä todettiin ensimmäistä kertaa, että kasvatettujen kalojen lihaksissa niiden reseptoreiden määrät, jotka liittyvät itse lihassupistuksen tehokkuuteen, ovat huomattavasti alemmat kuin villeillä. Lihasten toiminnalliset ominaisuudet eivät kuitenkaan ole muuttumattomia vakioita. Tulosten perusteella harjoitettujen kalojen sekä lihas- että vaellusominaisuudet lähestyvät villien vastaavaa. Tämä harjoittelun jälkeinen muutos lisää todennäköisesti kasvatettujen kalojen selviytymismahdollisuuksia.

L’augmentation transitoire de la concentration calcique intracellulaire constitue l’élément déclencheur de nombreux processus physiologiques tels que la fertilisation de l’ovocyte, la contraction ou la mort cellulaire. L’influx de calcium à la suite de l’activation des récepteurs de l’acétylcholine (RACh) dans les muscles ou les neurones est un événement bref et localisé. Le recrutement, direct ou indirect, des canaux calciques voltage-dépendants permet de convertir cette stimulation aigue en un événement prolongé dans l’espace et le temps, menant à la contraction musculaire, à l’exocytose des neurotransmetteurs ou à la régulation de l’expression des gènes. Les RACh et les canaux de type L étant conservés au cours de l’évolution, nous utilisons la cellule musculaire du nématode Caenorhabditis elegans comme modèle d’étude afin de mieux caractériser la biologie et les mécanismes de régulation de ces protéines. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur deux situations indépendantes de suractivation de l’homéostasie calcique impliquant ces acteurs, i) l’hyperactivation des canaux calciques voltage-dépendants par des mutations gain-de-fonction, ii) la suractivation pharmacologique des RACh à l’aide d’un agoniste cholinergique, le lévamisole. La première étude a consisté en la caractérisation de trois mutations gain-de-fonction dans le gène codant la sous-unité a1 du canal calcique de type L. Ce travail s’inscrivait dans un projet visant à isoler des mutants supprimant les défauts d’excitabilité engendrés par l’hyperactivité des canaux de type L, afin d’identifier de nouveaux partenaires fonctionnels de ces canaux. Ce projet a été interrompu par la mise en place de la deuxième étude, dans laquelle j’ai utilisé l’exposition au lévamisole pour explorer la réponse cellulaire face à une suractivation cholinergique. J’ai montré que la signalisation cholinergique était contrôlée par un inhibiteur associé aux récepteurs, et que les RACh subissaient des modifications quantitatives à court ou long terme. Enfin, j'ai exploité le phénotype de résistance partielle au lévamisole pour réaliser un crible génétique à grande échelle visant à identifier de nouveaux régulateurs des récepteurs / Calcium transients trigger various physiological processes, including oocyte fertilization, contraction or cell death. In neurons or muscles, calcium influx following acetylcholine receptor (AChR) opening is a brief and confined event. By recruiting, directly or not, voltage-dependent calcium channels, this calcium entry is amplified through space and time and leads to muscle contraction, neurotransmitter exocytosis or gene regulation.As AChRs and L-type voltage-gated calcium channels are evolutionarily conserved, we use Caenorhabditis elegans striated muscle cells as a model to characterize the biology and regulation mechanisms of these proteins. During my PhD I worked on two independent situations involving overactivation of calcium homeostasis, i) hyperactivation of L-type calcium channels by gain-of-function mutations within the main subunit, ii) pharmacological overactivation of AChRs using the cholinergic agonist levamisole. The functional characterization of three gain-of-function mutations was the first step of a project aiming to identify new molecular partners of L-type channels, by isolating mutants suppressing excitability troubles introduced by these gain-of-function mutations. This work was interrupted when I started the second study: I used levamisole exposure as an experimental paradigm to investigate how muscle cells are coping with cholinergic overstimulation. I showed that cholinergic signaling is regulated by an inhibitor associated with the receptors, and that AChRs undergo quantitative changes at short or long term. Finally I took advantage of partial levamisole resistance phenotype to undertake a genetic screen in order to identify new regulators of AChRs

La contraction du muscle squelettique est initiée par une libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS) en réponse à une dépolarisation du sarcolemme. Celle-ci induit un changement de conformation du récepteur des dihydropyridines (DHPR) localisé dans les tubules T entraînant l'ouverture du récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1), canal calcique du RS, et la libération du Ca2+ accumulé dans le RS. Au repos, RyR1 serait maintenu fermé par une action répressive du DHPR. Néanmoins, un efflux de Ca2+ continu se développe à travers la membrane du RS, constamment compensé par l'activité des pompes Ca2+-ATPases. Des études suggèrent que cet efflux pourrait être impliqué dans la perturbation de l'homéostasie calcique dans une des pathologies musculaires des plus fréquentes et sévères, la myopathie de Duchenne. Le travail présenté vise à caractériser l'efflux de Ca2+ du RS dans les fibres musculaires squelettiques de souris normales et mdx, modèle murin de la myopathie de Duchenne, en couplant la technique de potentiel imposé et la mesure fluorimétrique du Ca2+ intracellulaire. La mise au point d'une mesure directe des variations de Ca2+ du RS à l'aide du Fluo-5N a permis de révéler dans les fibres mdx une fuite calcique du RS exacerbée. Cette approche a permis de démontrer que l'efflux calcique du RS dans la fibre musculaire squelettique au repos n'est pas un phénomène incontrôlé à travers RyR1 mais un efflux étroitement contrôlé par le DHPR. Enfin, on s'est intéressée à l'efflux de Ca2+ du RS lors d'une stimulation musculaire prolongée. Nos résultats montrent que le déclin du signal calcique cytosolique dans ces conditions résulterait de la déplétion calcique du RS / Contraction of skeletal muscle is triggered by the release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) in response to depolarization of the sarcolemma. Depolarization elicits a conformational change of the dihydropyridine receptor (DHPR) localized in the tubular membrane that controls the opening of the type 1 ryanodine receptor (RyR1), the SR Ca2+ release channel. At rest, RyR1s are kept in a closed state imposed by the repressive action of DHPRs. Yet, a resting Ca2+ efflux occurs across the SR membrane, constantly balanced by the pumping activity of SR Ca2+-ATPases. Several studies suggest that this SR Ca2+ efflux, considered as purely passive, may contribute to the alteration of Ca2+ homeostasis in one of the most common and severe skeletal muscle disease, namely the Duchenne Muscular Dystrophy. The present work aims at characterizing the SR Ca2+ efflux in skeletal muscle fiber from normal and mdx mice, the murine model of Duchenne Muscular Dystrophy, by combining voltage-clamp and intracellular Ca2+ measurements. The development of a methodology allowing direct monitoring of Ca2+ changes in the SR using the Fluo-5N led us to reveal an elevated SR Ca2+ leak in mdx fibers, which may contribute to the alteration of Ca2+ homeostasis. Still using this approach, we demonstrate that the resting SR Ca2+ efflux in normal skeletal muscle fiber is not, an uncontrolled process through RyR1 but is tightly controlled by DHPR. Finally, we investigates the SR Ca2+ efflux during long-lasting stimulation. Our data indicate that the decline of SR Ca2+ release in these conditions results from SR Ca2+depletion and does not involve voltage-dependent inactivation of SR Ca2+ release

Abstract The dihydropyridine receptor (DHPR) in the skeletal muscle plasma membrane functions as a voltage sensor for excitation-contraction coupling. In the present work the expression and special features of DHPR were studied under various conditions. In order to localize and visualize the DHPRs, a method using fluorophore-conjugated dihydropyridine molecules as a probe was developed. In addition, different laboratory assays and electrophysiological measurements were used to study the expression of the myofibrillar proteins, force production of the muscle and conduction velocity of the plasma membrane. During the postnatal development of mouse skeletal muscle the density of DHPR increased. By the time of DHPR appearance, the expression of sodium channels had started and the typical assembly of basic structural components and membrane compartments was clearly detectable. According to the histochemical analysis, the DHPR was selectively expressed in type IIA muscle fibres of mouse. In addition to the fibre type specificity, the uneven distribution of DHPRs was also seen at the muscle level. The attenuation of the contraction force after addition of DHPR blocker was largest in muscles with a high percentage of type IIA fibres. In fish muscles, the distribution of DHPR was homogenous and the density between different fibre types was quite similar. In gastrocnemius muscle of mouse, the density and mRNA expression of DHPR increased significantly by 21.5 and 66.8%, respectively, after a 15-week aerobic exercise programme. The increase correlated significantly with the raise in % myosin heavy chain IIa isoform. In thigh and heart muscles, no significant changes were observed. In fish, the environmental change following hatchery release and downstream migration of 46.5 km induced an increase in the DHPR density in swimming muscles. Furthermore, a transition of phenotypic profile from fast-to-slow fibres was observed. Taken together, the present data provide evidence for the fact that the expression of DHPR increases during postnatal development. Moreover, the expression correlates with a specific fibre-type metabolism, thus having an impact on the overall contractile properties of the muscle. This is further manifested as an increase in the DHPR density after endurance training in mammalian as well as in fish muscle. In addition, a strong correlation exists between the level of muscle activity and the density of DHPR. / Tiivistelmä Poikkijuovaisen lihaksen solukalvolla esiintyvä dihydropyridiini (DHP) reseptori toimii jännitesensorina lihaksen ärsytys-supistus kytkennässä. Tässä työssä tutkittiin DHP reseptorin erityispiirteitä sekä erilaisten fysiologisten tekijöiden vaikutusta reseptorin ilmenemiseen. DHP reseptorien visualisointiin kehitettiin histologinen värjäysmenetelmä, jossa merkkiaineena toimi fluorofori-konjugoitu DHP molekyyli. Lisäksi työssä tutkittiin lihaksen proteiinien ekspressiota, lihaksen voimantuottoa sekä solukalvon johtonopeutta erilaisten määritysmenetelmien ja elektrofysiologisten mittausmenetelmien avulla. Tulokset osoittivat, että yksilönkehityksen aikana DHP reseptorien tiheys kasvoi hiiren poikkijuovaisessa lihaksessa. DHP reseptorien ekspression alkaessa natriumkanavat olivat jo ilmaantuneet solukalvolle ja lihassolun rakenne oli pitkälle erilaistunut. Histokemiallisten määritysten perusteella DHP reseptorin ekspressio oli selektiivistä. Reseptoreita esiintyi runsaimmin tyypin IIA soluissa. Reseptoriproteiinin solutyyppispesifisyys oli huomattavissa myös lihastasolla. Tulosten mukaan proteiinin salpaaja alensi lihaksen supistumisvoimaa erityisesti niissä hiiren lihaksissa, joiden solutyyppikoostumuksessa tyypillä IIA on suuri prosentuaalinen osuus. Kalan lihaksissa DHP reseptorit olivat homogeenisesti jakautuneet. Lisäksi reseptoritiheys oli samankaltainen eri solutyyppien välillä. 15 viikon aerobinen harjoittelu lisäsi sekä DHP reseptorin proteiini- että mRNA- ekspressiota tilastollisesti merkitsevästi (21,5 ja 66,8 %) hiiren kantalihaksessa. Ekspression kasvu korreloi merkitsevästi samanaikaisesti tapahtuneen myosiini isomuoto IIa määrän kasvun kanssa. Reisi- ja sydänlihaksessa merkittäviä muutoksia ei havaittu. Kalan uintilihaksissa DHP reseptorien tiheys kasvoi vapauttamisen jälkeisen ympäristön muutoksen ja 46,5 km pituisen vaelluksen jälkeen. Lisäksi lihasten solutyyppikoostumuksessa tapahtui muutos kohti hitaasti supistuvia solutyyppejä. Yhteenvetona voidaan todeta, että saatujen tulosten perusteella DHP reseptorien ekspressio kasvaa syntymän jälkeen hiiren poikkijuovaisessa lihaksessa. Solujen erilaistuessa ekspressio korreloi solutyyppimetabolian kanssa vaikuttaen edelleen lihaksen supistumisominaisuuksiin. Tästä johtuen myös kestävyysharjoittelun seurauksena DHP reseptorien määrä kasvaa sekä nisäkkään että kalan lihaksissa. Erityisesti lihaksen aktiivisuudella on merkitystä DHP reseptorin ekspressioon.

Abstract Melatonin is an important modulator of several physiological and behavioural processes, and it influences the function of many different tissues. Melatonin has effective antioxidative properties, but some of its actions in mammals are also mediated through the MT1 and MT2 melatonin receptors. Antioxidative properties are seen especially when the melatonin concentration is high (≥ nM), and melatonin's affinity for its receptors appears at lower concentrations (pM). Recently, the involvement of melatonin in protecting the heart against cardiac diseases, including myocardial infarction (MI), has been brought out. MI alters the structure and function of myocardium, attenuating for example cardiac contractility by affecting the amount and function of the essential Ca2+ handling proteins, dihydropyridine receptor (DHPR), ryanodine receptor (RyR2) and sarco-endoplasmic reticulum (SR) Ca2+-ATPase2 (SERCA2). MI also evokes many adaptive responses in organisms, such as elevated production of atrial and brain natriuretic peptides (ANP and BNP). In this thesis, the expression of MT1 and MT2 receptor mRNAs was investigated in several rat tissues. Furthermore, the effect of MI and exogenous melatonin on the rat endogenous melatonin and on the expression of cardiac MT1, MT2, DHPR, RyR2 and SERCA2 proteins was evaluated. The concentrations of ANP and BNP were also measured after post-MI melatonin administration. The results show the expression of MT1 and/or MT2 receptor mRNAs in the hypothalamus, retina, small intestine, liver and heart, which indicates that at least some effects of melatonin could be mediated through the receptors in these tissues. Melatonin synthesis in the pineal gland increased rapidly in response to MI, supporting an important role of endogenous melatonin in protecting the heart after MI. Furthermore, exogenous melatonin altered the mRNA expression of DHPR, RyR2 and SERCA2 after MI, suggesting that melatonin might contribute to the post-infarction cardiac contractile function. The results also revealed a novel, positive relationship between melatonin and ANP, and thereby bring out one more possible way of melatonin to protect the heart against MI-induced injuries. Taken together, the present thesis (i) supports the notion that melatonin is an important endogenous protective agent of the organism, and (ii) extends our knowledge of melatonin's post-infarction cardioprotective actions. / Tiivistelmä Melatoniini osallistuu monien fysiologisten toimintojen ja käyttäytymisen säätelyyn sekä vaikuttaa useiden eri kudosten toimintaan. Melatoniini on tehokas antioksidantti, mutta jotkut sen vaikutuksista välittyvät myös MT1 ja MT2 melatoniini reseptorien kautta. Antioksidatiiviset vaikutukset tulevat esiin erityisesti silloin, kun melatoniinin pitoisuus on korkea (≥ nM). Alhaisemmilla pitoisuuksilla (pM) on puolestaan havaittavissa melatoniinin sitoutuminen reseptoreihinsa. Viime aikoina on tullut esille melatoniinin mahdollinen suojavaikutus sydänsairauksia, kuten sydäninfarkteja, vastaan. Sydäninfarkti muuttaa sydänlihaksen rakennetta ja toimintaa esimerkiksi vaikuttamalla supistuksen kannalta välttämättömien proteiinien, dihydropyridiini reseptorin (DHPR), ryanodiini reseptorin (RyR2) ja sarko-endoplasmakalvoston Ca2+-ATPaasi2:n (SERCA2) lukumääriin ja toimintaan, ja sitä kautta muun muassa heikentää sydämen supistuvuutta. Sydäninfarkti laukaisee elimistössä myös monia adaptiivisia vasteita, kuten eteispeptidin (ANP) ja aivojen natriureettisen peptidin (BNP) lisääntyneen erityksen. Tässä väitöstyössä tutkittiin MT1 ja MT2 reseptorien mRNAn ilmentymistä useissa rotan eri kudoksissa. Lisäksi tutkittiin sydäninfarktin ja eksogeenisen melatoniinin vaikutuksia rotan endogeeniseen melatoniiniin sekä sydämen MT1, MT2, DHPR, RyR2 ja SERCA2 proteiinien ekspressioon. Myös ANP ja BNP pitoisuudet mitattiin. Tulokset osoittivat MT1 ja/tai MT2 reseptori mRNAn ilmentymisen hypotalamuksessa, silmän verkkokalvolla, ohutsuolessa, maksassa ja sydämessä, minkä perusteella ainakin osa melatoniinin vaikutuksista saattaisi olla reseptorivälitteisiä näissä kudoksissa. Tulosten mukaan käpyrauhasen melatoniinisynteesi lisääntyi nopeasti sydäninfarktin jälkeen, mikä tukee käsitystä endogeenisen melatoniinin tärkeästä roolista infarktin jälkeisessä sydämen suojauksessa. Lisäksi eksogeeninen melatoniini muutti DHPR:n, RyR2:n ja SERCA2:n mRNA ekspressiota infarktin jälkeen, mikä voisi merkitä, että melatoniini saattaa vaikuttaa infarktin jälkeiseen sydämen supistuvuuteen. Tulosten osoittama positiivinen riippuvuus melatoniinin ja ANP:n välillä tuo puolestaan esille yhden uuden mahdollisen keinon, jonka kautta melatoniini voisi suojata sydäntä infarktin aiheuttamia vaurioita vastaan. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä väitöstyö (i) tukee käsitystä, että endogeenisella melatoniinilla on tärkeä merkitys elimistön suojaamisessa, ja (ii) laajentaa tietämystämme infarktin jälkeisistä melatoniinin sydäntä suojaavista vaikutuksista.