L’utilisation intensive des insecticides pour lutter contre les insectes ravageurs de culture et vecteurs demaladies, a conduit à des polémiques sur le mode d’action des insecticides. Ces polémiques sont liéesau fait que le mode d’action des insecticides, notamment des néonicotinoïdes est mal connu. Ils agissentprincipalement sur les récepteurs à l’acétylcholine (ACh) de type nicotinique (nAChR) qui jouent un rôlefondamental dans la transmission synaptique cholinergique. Bien que ces récepteurs soient bien décritschez les mammifères, très peu d’études ont évalué l’effet des néoniotinoïdes sur un récepteur natifd’insecte.Au cours de cette thèse, nous avons pour la première fois exprimé en ovocytes de xénope un récepteurhomomérique ⍺7 de blatte et étudié ces propriétés pharmacologiques vis-à-vis des néonicotinoïdes,comparativement au récepteur a7 de rat. Nos résultats révèlent un récepteur atypique qui est insensibleà l’⍺-bungarotoxine et qui n’est pas activé par les néonicotinoïdes. Ainsi, bien que les gènes codantpour les sous-unités α7 de blatte et de rat forment un groupe monophylétique distinct des autres sousunitésd’insectes et de mammifères, les récepteurs homomériques obtenus semblent avoir despropriétés pharmacologiques différentes. Parallèlement, nous avons étudié les propriétéspharmacologiques des nAChR natifs et notamment l’effet modulateur d’un pyréthrinoïde, la permethrine,sur les courants induits par le dinotefurane. Ce travail a permis d’évaluer le mode d’action d’unantiparasitaire, le Vectra 3D. Enfin, nous avons également entrepris de développer la techniqued’extraction membranaire afin de l’utiliser comme alternative pour étudier le mode d’action desinsecticides.Pour conclure, cette thèse a permis une avancée sur l’étude de la caractérisation des propriétéspharmacologiques des récepteurs nicotiniques neuronaux des insectes et sur l’étude du mode d’actiondes insecticides néonicotinoïdes. / The intensive use of insecticides against crop pests and vectors of human and animal leads to several polemics about their mode of action. All these controversies are related to the fact that the mode of action of insecticides in insects is poorly unknown, in particular neonicotinoids which act on nicotinic acetylcholine (ACh) receptors (nAChR).During this PhD thesis, we characterized for the first time the pharmacological properties of a cockroach ⍺7 homomeric receptor in a xenopus oocyte. Our results revealed that cockroach ⍺7 in an atypical receptor that is insensitive to ⍺-bungarotoxin and not activated by neonicotinoids. Cockroach and rat ⍺7 receptors which are included in the same cluster have distinct pharmacological properties. We then studied the pharmacological properties of native receptors, in particular, the modulatory effect of permethrin on dinotefuran-induced currents. This work was included in the study of Vectra 3D. We also evaluated the use of insect central nervous system membrane extraction as a strategy to study the pharmacological properties of insect native nAChRs.To conclude, this PhD contribute to the study of the pharmacological properties of insect nAChRs and the study of the mode of action of neonicotinoids insecticides.

Les récepteurs à l’acétylcholine (AChRs) des nématodes parasites sont des cibles pharmacologiques majeures pour les anthelminthiques utilisés en médecine vétérinaire. Cependant, face à l’émergence d’isolats résistants, l’optimisation des stratégies de lutte nécessite une meilleure connaissance du mode d’action des anthelminthiques et du répertoire d’AChRs pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Les nématodes parasites possèdent potentiellement une grande diversité d’AChR dont un nombre très restreint a été caractérisé fonctionnellement à ce jour. Dans ce contexte, nous avons identifié deux sous-unités d’AChR : ACR-26 et ACR-27 spécifiquement retrouvées chez les nématodes parasites. En exprimant ces sous-unités en œuf de Xénope et dans le nématode modèle Caenorhabditis elegans, nous avons mis en évidence un nouveau sous-type d’AChR musculaire sensible au morantel : le M-AChR. De plus, nous avons réalisé une étude moléculaire et fonctionnelle comparative des sous-unités d’AChR du groupe ACR-16 chez différentes espèces de nématodes. L’identification de ces nouveaux récepteurs constitue une base solide pour le développement de nouveaux anthelminthiques. / Acetylcholine receptors (AChRs) of parasitic nematodes are the major pharmacological targets for anthelmintics used in veterinary medicine. However, with the emergence of resistant isolates, the optimization of control strategies requires a better knowledge of the mode of action of anthelmintics and of the AChR repertoire for the identification of new therapeutic targets. Indeed, parasitic nematodes possess a large diversity of AChR subunits. In this context, we identified two AChR subunits: ACR-26 and ACR-27, specifically found in parasitic nematodes. By expressing these subunits in Xenopus oocytes and in the model nematode Caenorhabditis elegans, we identified a novel muscular AChR subtype sensitive to morantel: the M-AChR. Moreover, we performed a molecular and functional comparative study of the AChR subunits from ACR-16 group in different nematode species. The identification of these new receptors paves the way for the development of new anthelmintic drugs.

L’augmentation transitoire de la concentration calcique intracellulaire constitue l’élément déclencheur de nombreux processus physiologiques tels que la fertilisation de l’ovocyte, la contraction ou la mort cellulaire. L’influx de calcium à la suite de l’activation des récepteurs de l’acétylcholine (RACh) dans les muscles ou les neurones est un événement bref et localisé. Le recrutement, direct ou indirect, des canaux calciques voltage-dépendants permet de convertir cette stimulation aigue en un événement prolongé dans l’espace et le temps, menant à la contraction musculaire, à l’exocytose des neurotransmetteurs ou à la régulation de l’expression des gènes. Les RACh et les canaux de type L étant conservés au cours de l’évolution, nous utilisons la cellule musculaire du nématode Caenorhabditis elegans comme modèle d’étude afin de mieux caractériser la biologie et les mécanismes de régulation de ces protéines. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur deux situations indépendantes de suractivation de l’homéostasie calcique impliquant ces acteurs, i) l’hyperactivation des canaux calciques voltage-dépendants par des mutations gain-de-fonction, ii) la suractivation pharmacologique des RACh à l’aide d’un agoniste cholinergique, le lévamisole. La première étude a consisté en la caractérisation de trois mutations gain-de-fonction dans le gène codant la sous-unité a1 du canal calcique de type L. Ce travail s’inscrivait dans un projet visant à isoler des mutants supprimant les défauts d’excitabilité engendrés par l’hyperactivité des canaux de type L, afin d’identifier de nouveaux partenaires fonctionnels de ces canaux. Ce projet a été interrompu par la mise en place de la deuxième étude, dans laquelle j’ai utilisé l’exposition au lévamisole pour explorer la réponse cellulaire face à une suractivation cholinergique. J’ai montré que la signalisation cholinergique était contrôlée par un inhibiteur associé aux récepteurs, et que les RACh subissaient des modifications quantitatives à court ou long terme. Enfin, j'ai exploité le phénotype de résistance partielle au lévamisole pour réaliser un crible génétique à grande échelle visant à identifier de nouveaux régulateurs des récepteurs / Calcium transients trigger various physiological processes, including oocyte fertilization, contraction or cell death. In neurons or muscles, calcium influx following acetylcholine receptor (AChR) opening is a brief and confined event. By recruiting, directly or not, voltage-dependent calcium channels, this calcium entry is amplified through space and time and leads to muscle contraction, neurotransmitter exocytosis or gene regulation.As AChRs and L-type voltage-gated calcium channels are evolutionarily conserved, we use Caenorhabditis elegans striated muscle cells as a model to characterize the biology and regulation mechanisms of these proteins. During my PhD I worked on two independent situations involving overactivation of calcium homeostasis, i) hyperactivation of L-type calcium channels by gain-of-function mutations within the main subunit, ii) pharmacological overactivation of AChRs using the cholinergic agonist levamisole. The functional characterization of three gain-of-function mutations was the first step of a project aiming to identify new molecular partners of L-type channels, by isolating mutants suppressing excitability troubles introduced by these gain-of-function mutations. This work was interrupted when I started the second study: I used levamisole exposure as an experimental paradigm to investigate how muscle cells are coping with cholinergic overstimulation. I showed that cholinergic signaling is regulated by an inhibitor associated with the receptors, and that AChRs undergo quantitative changes at short or long term. Finally I took advantage of partial levamisole resistance phenotype to undertake a genetic screen in order to identify new regulators of AChRs

ColQ est un collagène spécifique qui ancre l’acétylcholinestérase (AChE) dans la fente synaptique de la jonction neuromusculaire (JNM). L'importance du complexe AChE-ColQ dans la physiologie humaine de cette synapse est soulignée par l’identification de mutations dans le gène codant pour ColQ qui conduisent à un syndrome myasthénique congénital (SMC) associé à une déficience en AChE. Le déficit en AChE a, jusqu’à présent, été considéré comme l’unique facteur responsable des symptômes observés chez les patients ainsi que des défauts de la JMN chez le modèle de souris SMC (souris déficiente pour ColQ). Toutefois, ces symptômes sont complexes et l’absence d’AChE ne peut probablement pas expliquer tous les symptômes. Nous avons montré auparavant que ColQ participait à la formation de la synapse ce qui expliquerait les symptômes observés chez les patients et la souris modèle. En effet, nous avons pu montrer que ColQ contrôle l’agrégation du récepteur à l’acétylcholine (RACh) et de l’expression de gènes spécifiques de la synapse. En particulier, nous avons montré in vitro et in vivo, que l’absence de ColQ induit une augmentation du niveau des ARNm codant pour toutes les sous-unités de RACh et une expression réduite du niveau de leurs protéines. Des résultats préliminaires indiquent que cette augmentation de ces ARNm n’est pas transcriptionnelle. L’objectif de cette thèse est d’expliquer les mécanismes qui induisent l’augmentation du niveau des ARNm de AChR en l’absence de ColQ et les voies de signalisation qui relient ColQ au métabolisme des ARN du RACh. Notre hypothèse de travail a été que l'absence de ColQ stimule la stabilisation post-transcriptionnelle des ARNm codant pour les sous-unités du RACh via la protéine HuR. HuR est une protéine qui stabilise les ARNm quand elle se fixe sur les AU-richelement (ARE) dans la séquence 3’UTR. HuR est une protéine clé dans la myogenèse et la formation de la JNM parce qu’elle stabilise de manière post-transcriptionnelle de nombreux transcrits tels que myogénine, MyoD et AChE. Dans cette étude, nous montrons pour la première fois qu’un mécanisme post-transcriptionnel de stabilisation des ARNm est responsable de l’augmentation du niveau des ARNm du RACh via ColQ. De plus, nous constatons qu’en absence de ColQ, il y a une augmentation aux niveaux d’ARNm et de protéine de HuR. HuR est également capable de se lier au domaine ARE dans le 3’UTR des ARNm des sous-unités de AChR. De plus, l’interaction entre HuR et les ARNm du RACh augmente la stabilité et par conséquence les niveaux des transcrits du RACh. Trois conclusions importantes ressortent de ma thèse : nous démontrons que (1) en plus de la régulation transcriptionnelle, il existe des mécanismes de régulation post-transcriptionnlle du RACh (2) ColQ régule la stabilité des ARNm RACh via HuR médiée par MuSK (3) la voie de signalisation p38 contrôle les niveaux de HuR de manière dépendante de ColQ. Ensemble, ces résultats donnent un aperçu des voies de signalisation du muscle qui sont affectées par les mutations de ColQ conduisant à des SMC avec une déficience en AChE. Nos résultats mettront en évidence des nouvelles cibles moléculaires spécifiques qui peuvent conduire au développement des interventions thérapeutiques dans le cadre de myasthénies congénitales. / ColQ is a specific collagen that anchors acetylcholinesterase (AChE) in the synaptic cleft of the neuromuscular junction (NMJ). The importance of AChE-ColQ complex in the physiology of this synapse has been highlighted by the identification of COLQ mutations in the human gene, leading to a congenital myasthenic syndrome (CMS) with AChE deficiency. The lack of AChE has been incriminated for the symptoms observed in patients along with NMJ defects in the CMS mouse model (ColQ-deficient). However, symptoms observed in the patients and mouse model of CMS with AChE deficiency are complex and AChE deficiency cannot account for all of them. We have demonstrated that ColQ could play a role per se in synapse formation which would explain some of the defects observed in patients and model mice. Indeed, we have shown that ColQ controls the clustering of Acetylcholine Receptors (AChR) and the expression of a number of specific synaptic genes. The most striking effect of the absence of ColQ is an upregulation of all AChR subunit mRNAs correlated by an increase in their protein levels. Preliminary results indicate that AChR mRNA upregulation is not transcriptional. This thesis deciphers the mechanisms that drive AChR mRNA upregulation in the absence of ColQ and the pathways that connect ColQ to the AChR RNA metabolism. Accordingly, we hypothesize that the absence of ColQ induces an upregulation of the stabilization of AChR subunit mRNAs, a post-transcriptional mechanism mediated by HuR. HuR is an RNA binding protein which stabilizes its target transcript by binding AU-rich elements (AREs) in their 3’UTR. HuR is critical during skeletal myogenesis and post-synaptic NMJ formation due to its stabilization of such transcripts as myogenin, MyoD and AChE. In this study, we show for the first time that a post-transcriptional mechanism of AChR mRNA stabilization is responsible for the ColQ mediated increase of AChR mRNAs. In support of these findings, the absence of ColQ also increased HuR mRNA and protein levels. We demonstrate that HuR is capable of binding to conserved ARE elements in the 3’UTR of AChR subunit mRNA. HuR’s interaction with AChR mRNA increased the stability of the transcripts, resulting in an increase in mRNA levels. Three major conclusions emerge from my thesis: we provide evidence that (1) in addition to transcriptional and assembly regulation of AChR, post-transcriptional mechanisms of AChR mRNA exist (2) ColQ regulates HuR mediated AChR stability through MuSK and (3) the p38 signalling pathway controls the levels of HuR in a ColQ dependent manner. Collectively, our data provides insight into the muscle signaling pathways which are affected by ColQ mutations leading to CMS with AChE deficiency. Thus, we have identified specific new molecular targets that may become important for the development of therapeutic interventions for patients with CMS.