The acute cellular responses to DNA damaging agents are critical in determining the long term outcome of disease. A cell’s susceptibility to damage, or its capacity to remove or repair this damage, all contributes to the eventual health or disease of tissues. This process is especially crucial in colonic epithelial cells and in the development of colorectal oncogenesis. The colonic lumen is constantly subjected to different environmental compounds that may have genotoxic properties that can initiate mutational events and possibly carcinogenesis. Therefore, the study of a regulatory dietary agent that improves the colonic cells ability to withstand damage, improve repair and retain its general health is a significant and practical tool in the fight against colorectal cancer. The health benefits of fish oil, including its potential chemopreventative properties, have been reported in numerous studies. However, the mechanism by which this protective effect occurs remains unclear. A gap in current literature exists that fails to explore the effect of fish oil on the early cellular responses to carcinogenic agents. Therefore, this thesis aims to firstly, better understand the specific host responses to an insult of carcinogen in vivo; secondly, to determine if regulation of these responses can be achieved by dietary fish oil; and lastly, to explore the potential consequences of this regulation for colorectal oncogenesis. All experimental work was carried out using a rat – azoxymethane (AOM) animal model of colorectal carcinogenesis. The key host responses to the carcinogen that were measured included the formation of acute O6methyldeoxyGuanosine (O6medG) DNA damage, the acute apoptotic response to genotoxic carcinogen (AARGC) and cell proliferation rates. A novel immunochemical assay was designed to detect both the levels and distribution of O6medG in colonic cells. With this established, a pattern of these host responses were mapped out over time. A dietary intervention study trialling a range of fish oil diets containing different doses and forms was then carried out to determine if modulation of responses occurred. This study was then followed on by a longer term study that explored the consequences of regulation by fish oil on pre-neoplastic lesions in the colon. The acute host responses to an insult of AOM showed that colonic O6medG formation began 2h post AOM administration and peaked at 6h. The AARGC response followed the pattern of O6medG by a 2h delay, peaking at 8h post AOM administration, while cell proliferation rates decreased significantly after 6h. The inclusion of tuna oil in the diet did not affect either the AARGC or cell proliferation rates when given in any form or at any dose. Animals fed a diet with 15% free tuna oil and 7% encapsulated tuna oil did however have significantly reduced levels of O6medG DNA damage in the distal colon. This reduction in O6medG levels did not translate into a reduction of ACF lesion, with a protective effect against ACF lesions only being observed in animals fed the high dose fish oil groups. Analysis of the data suggest that the acute host responses to an insult of DNA damaging agent appear to be closely related, all reaching their peak level of response 6-8h after the insult. The short time frame between both O6medG and apoptosis also did not support the current popular theory which explains O6medG mediated apoptosis. An alternate hypothesised BER mediated apoptotic pathway was also not supported. Regulation of the acute apoptotic response or the cell proliferation rate was not achieved by dietary fish oil. However, a high dose fish oil diet did regulate the level of O6medG in colonic epithelial cells by significantly reducing the total O6medG DNA damage load. This reduction of O6medG by a high fish oil diet however, was not translated into a protective effect against the formation of pre-neoplastic lesions. These data suggests that regulation of the acute O6medG response to a damaging agent does not necessarily imply protection for longer term colorectal oncogenesis. Additional studies exploring both the effect of fish oil on AOM metabolising enzymes and also a longer term cancer study may help to answer some pertinent questions evolving from this thesis.

Carcinogen-induced formation of DNA adducts and other types of DNA lesions are the critical molecular events in the initiation of chemical carcinogenesis and modulation of such events by chemopreventive agents could be an important step in limiting neoplastic transformation in vivo. Vanadium, a dietary micronutrient has been found to be effective in several types of cancers both in vivo and in vitro and also possesses profound anticarcinogenicity against rat models of mammary, colon and hepatocarcinogenesis. Presently, we report the chemopreventive potential of vanadium on diethylnitrosamine (DEN)-induced early DNA damages in rat liver. Hepatocarcinogenesis was induced in male Sprague-Dawley rats with a single, necrogenic, intraperitoneal (i.p.) injection of DEN (200 mg/kg body weight) at week 4. There was a significant induction of tissue-specific ethylguanines, steady elevation of modified DNA bases 8-hydroxy-2′-deoxyguanosines (8-OHdGs) (P < 0.0001; 89.93%) along with substantial increment of the extent of single-strand breaks (SSBs) (P < 0.0001) following DEN exposure. Supplementation of 0.5 ppm of vanadium throughout the experiment abated the formations of O6-ethylguanines and 7-ethylguanines (P < 0.0001; 48.71% and 67.54% respectively), 8-OHdGs (P < 0.0001; 81.37%), length:width (L:W) of DNA mass (P < 0.01; 62.12%) and the mean frequency of tailed DNA (P < 0.001; 53.58%), and hepatic nodulogenesis in preneoplastic rat liver. The study indicates that 0.5 ppm vanadium is potentially and optimally effective, as derived from dose-response studies, in limiting early molecular events and preneoplastic lesions, thereby modulating the initiation stage of hepatocarcinogenesis. Vanadium is chemopreventive against DEN-induced genotoxicity and resulting hepatocellular transformation in rats.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are produced via the incomplete combustion of organic matter. They are ubiquitously present in the environment, and human exposures typically involve complex PAH mixtures in complex matrices (e.g., soil, urban air). Many PAHs are genotoxic carcinogens; exposures can augment cancer risk and reliable risk assessment of PAH mixtures is a regulatory concern. There is a paucity of in vivo genotoxicity information for most PAHs and PAH mixtures. Risk assessment of PAH mixtures assumes dose addition (i.e., additive, incremental contributions from each PAH); however, there is a lack of evidence to support this assumption. This thesis assessed the in vivo genotoxicity of 9 PAHs and 6 PAH mixtures following sub-chronic oral exposure of transgenic Muta™Mouse (i.e., adduct and lacZ mutant frequency across 5 tissues). The results revealed that PAHs and PAH mixtures induce significant levels of genetic damage; the mixtures induced very high levels of damage and mutations. Differences in the nature and magnitude of the effects in individual tissues appear to be related to the processes that govern PAH metabolism and the processing of genetic damage (e.g., repair and translesion synthesis). Scrutiny of the dose addition assumption revealed more-than-additive effects in tissues proximal to the exposure route (i.e., intestine, liver), but less-than-additive effects in distal tissues (i.e., bone marrow); however, discrepancies between the experimentally-observed and predicted responses were typically small (i.e., within 5-fold). Comparisons of cross-tissue patterns in adduct and mutant frequencies revealed that the frequency of the former is generally inversely related to that of the latter. This appears to be related to the experimental design, and the influence of repair and replication on adduct and mutant frequency. The BMD approach was employed to estimate genotoxic (i.e., adduct) potency and mutagenic (i.e., lacZ mutant) potency for all agent-tissue combinations. The results demonstrate that the mutagenic potency of PAHs and PAH mixtures is empirically related to genotoxic potency; moreover, that there is cross-tissue and cross-compound congruence in the processing of PAH-induced damage. The results obtained significantly advance existing knowledge regarding the genotoxic hazards of PAHs and PAH mixtures; moreover, the empirical relationships between genetic toxicity endpoints.

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos. / Vários adutos resultantes da reação de aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, ou de seus epóxidos, com bases do DNA têm sido caracterizados nos últimos anos. Esses adutos podem levar à incorporação errada de bases durante a replicação ou a transcrição, resultando, se não reparados, em mutações que podem contribuir para a carcinogênese. O trans,trans-2,4-decadienal (DDE) é um dos aldeídos mais citotóxicos gerados endogenamente a partir da peroxidação lipídica. Verificamos que este aldeído afeta a viabilidade e altera o nível de glutationa de células CV1-P, além de induzir fragmentação do DNA e formação de diferentes produtos com o mesmo. Além da sua formação endógena, DDE é também encontrado em alguns alimentos, contribuindo para o aroma dos mesmos. Neste trabalho detectamos e isolamos 6 produtos formados a partir da reação de DDE com 2\' -desoxiguanosina (dG), sendo que fizemos a caracterização química completa de 3 desses produtos. Através desses estudos mostramos que um deles é o aduto 1,N2-eteno-2\' -desoxiguanosina (1,N2-&#949;dGuo), também formado a partir da reação de dG com compostos carcinogênicos conhecidos, como o c1oreto de vinila. Os outros dois produtos são dois diastereoisômeros correspondentes a 1,N2-&#949;dGuo com uma cadeia lateral substituinte. São produtos inéditos descritos pela primeira vez neste nosso trabalho. A detecção e caracterização desses produtos, assim como os mecanismos de fonnação propostos, podem contribuir para um melhor entendimento da genotoxicidade associada à peroxidação lipídica. Em paralelo desenvolvemos uma técnica muito sensível baseada em LC/ESI/MSMS para detecção desses adutos em sistemas biológicos. A detecção dos adutos caracterizados em DNA incubado com DDE in vitro e em DNA de células expostas ao aldeído aponta para a importância biológica desses compostos. Existe um crescente interesse no uso de adutos exocíclicos de DNA como marcadores de exposição a diversos carcinógenos ambientais e também a processos endógenos envolvendo a peroxidação lipídica. O mecanismo de formação e a estrutura química desses adutos são importantes para revelar as características estruturais queinfluenciam a alquilação do DNA por aldeídos insaturados e para que se possa estimar o papel desses aldeídos na carcinogênese. A formação dos adutos por produtos da peroxidação lipídica sugere a necessidade de estudos epidemiológicos para avaliar riscos de exposição ambiental, via alimentação ou mesmo via fatores indutores de lipoperoxidação. Os resultados aqui obtidos podem contribuir para o estabelecimento de relações entre estrutura química e função e para a avaliação do possível papel dessas lesões na toxicidade associada à exposição a essa classe de compostos.

Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

Bastões plásticos quimioluminescentes, chamados light sticks, são usados por companhias pesqueiras e descartados nas praias. Moradores locais utilizam seus conteúdos como repelentes, óleo bronzeador e medicamento para dores nas articulações. Nós investigamos a reatividade das soluções de bastões de light sticks coletados em praias brasileiras e a toxicidade celular de seus conteúdos e também de soluções de light stick de bastões novos. Produtos da reação dos conteúdos de light stick descartado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo) foram analisados por HPLC/UV/ESI-MS/MS. Um aduto foi purificado e caracterizado em espectrômetro de massas por Dissociação Induzida por Colisão (CID) e através de experimentos de 1H RMN. A estrutura do aduto revelou que o produto de degradação de bis(triclorofenil)oxalato é reativo para nucleófilos in vitro. O mesmo aduto foi detectado em DNA de timo de bezerro incubado in vitro com a solução do light stick descartado pelo uso HPLC/ESI-MS/MS. Além do DNA, albumina também foi modificada pelos conteúdos de light stick descartado. Células HepG2 foram incubadas por 16 h com 0.0125% - 0.12% (v/v) das soluções de light sticks: (i) coletadas na praia, (ii) obtidas imediatamente após a reação quimioluminescente no laboratório, e (iii) previamente a reação, contendo ou n-butil-ftalato, difenilantraceno, e bis(triclorofenil)oxalato (solução 1), ou dimetil-ftalato, H2O2, e salicilato de sódio (solução 2). A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste do XTT, corante cristal violeta e lactato desidrogenase realizados em placas de 96 poços. Com as concentrações testadas foram obtidas significativamente a morte celular. O dano oxidativo ao DNA celular foi avaliado pela análise da 8-oxo-2\'-desoxiguanosina através do equipamento HPLC/ESI-MS/MS, que revelou aumento de alterações nas células tratadas com 0.006% das soluções de light stick de bastões descartados e novos. Nossos dados apontam genotoxicidade e citotoxicidade das soluções de light sticks e podem contribuir como alerta a autoridades públicas para proibição do uso incontrolado. / Chemiluminescent plastic rods, called light sticks, are used by fishery companies and littered on the shores. Local inhabitants use their contents as repellents, tanning oil, and medicine for joint pain. We have investigated the reactivity of spent light stick solutions collected on brazilian beaches and the cellular toxicity of their contents as well as that of brand-new light stick solutions. Products of the reaction of the spent light stick contents with 2\'-deoxyguanosine (dGuo) were analyzed by HPLC/UV/ESI-MS/MS. A dGuo adduct was purified and characterized in a Collision Induced Dissociation (CID) mass spectrometer and through 1H NMR experiments. The adduct structure revealed that a degradation product of bis(trichlorophenyl)oxalate is reactive towards nucleophiles in vitro. The same adduct was detected in calf thymus DNA incubated in vitro with spent light stick solution, by using HPLC/ESI-MS/MS. Besides DNA, albumin was also modified by spent light stick contents. HepG2 cells were incubated for 16 h with 0.0125% 0.12% (v/v) of light stick solutions: (i) collected on the beaches, (ii) obtained immediately after the chemiluminescent reaction in the laboratory, and (iii) previously the reaction, containing either n-butyl-phthalate, diphenylanthracene, and bis(trichlorophenyl)oxalate (solution 1), or dimethyl-phthalate, H2O2, and sodium salicylate (solution 2). Cell survival was evaluated by the XTT, crystal violet dye, and lactate dehydrogenase assays performed in 96 well plates. The concentrations tested were found to significantly kill cells. Oxidative damage to cellular DNA was assessed by 8-oxo-2\'-deoxyguanosine analysis via an HPLC/ESI-MS/MS equipment, which revealed increased changes in cells treated with 0.006% of spent and brand-new light stick solutions. Our data point to important genotoxicity and cytotoxicity of the light stick solutions and may contribute to alert public policies to ban their uncontrolled use.

[pt] A utilização de drogas à base de platina é o tratamento de primeira linha para diversos tipos de câncer. Pacientes tratados com estas drogas apresentam resultados melhores que os obtidos com outros regimes de quimioterapia para os mesmos tipos de malignidades. As principais limitações para a utilização destes compostos são os efeitos colaterais severos e a resistência dos tumores ao tratamento. A cisplatina foi a primeira droga dessa categoria a ser empregada. Desde o final dos anos 70 até hoje, esta droga vem sendo amplamente utilizada e com sucesso substancial. Acredita-se que o principal mecanismo de ação desta classe de medicamentos seja a ligação de dois sítios ativos da platina com o DNA das células tumorais, impedindo sua multiplicação e finalmente induzindo a apoptose, o que provoca a redução, e em alguns casos a eliminação, dos tumores. Entretanto, devido à complexidade dos mecanismos envolvidos, uma descrição clara da atuação intracelular destas drogas ainda não foi estabelecida. A combinação de técnicas de separação como eletroforese ou cromatografia líquida de alta performance com técnicas de espectrometria atômica tem se apresentado como uma poderosa alternativa para investigação de fenômenos biológicos que envolvem, de alguma maneira, espécies metálicas. A hifenação destas técnicas permite a separação e detecção em linha de biomoléculas contendo metais, possibilitando a obtenção de informações únicas sobre os processos biológicos. O presente trabalho apresenta o desenvolvimento de métodos analíticos utilizando eletroforese em gel de agarose (GE), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) para a determinação de biomoléculas contendo platina em materiais biológicos. O principal objetivo do trabalho é fornecer ferramentas analíticas para o estudo dos mecanismos de ação de drogas à base de platina em humanos. Foram utilizados diversos materiais biológicos, como sangue, urina e culturas de células. A cromatografia líquida em fase reversa foi usada na determinação das drogas intactas e de seus produtos de hidrólise; a cromatografia de exclusão por tamanho foi empregada para a avaliação de proteínas presentes nas amostras enquanto a cromatografia de par iônico para separação de fragmentos de DNA. A detecção de platina nos eluatos por ICP-MS permitiu a obtenção de cromatogramas limpos apresentando claramente as moléculas contendo platina. A evidência da aplicabilidade dos métodos desenvolvidos foi avaliada com a prospecção de biomarcadores de eficiência do tratamento com cisplatina. Diversas linhagens celulares foram expostas a diferentes tratamentos com cisplatina e tiveram seus comportamentos avaliados. A determinação de adutos de DNA contendo platina apresentou-se como uma interessante perspectiva para a obtenção de um biomarcador de resistência ao tratamento com cisplatina. / [en] The use of platinum-based drugs is the first line treatment for many cancers. Patients treated with these drugs present better outcome when compared with other chemotherapy regimens for the same types of malignancies. The major limitations to the use of these drugs are the severe side effects and resistance tumors present to the treatment. Cisplatin was the first platinum-based drug to be approved for human use. Since the late 1970 s until today, this drug has been widely used with great success. It is believed that the major mechanism of action of these drugs is the binding of two active sites of platinum complexes with the DNA of the tumor cells, preventing their multiplication and finally inducing apoptosis, that leads to a reduction, and in some cases eliminating, tumors. However, due to the complexity of the mechanisms involved, a clear description of the intracellular action of these drugs has not been established. The combination of separation techniques such as electrophoresis or high performance liquid chromatography with atomic spectrometric techniques has emerged as a powerful alternative for investigation metal-related biological phenomena. The so called hyphenation of these techniques allows the separation and detection of biomolecules containing metals, making possible to obtain unique information about biological processes. This work presents the development of analytical methodologies using agarose gel electrophoresis (GE), high performance liquid chromatography (HPLC) and inductively coupled plasma with mass spectrometry (ICP-MS) for the determination of platinum-containing biomolecules in biological materials. The main objective of this work is to provide analytical tools for the study of the mechanisms of action of platinum-based drugs in humans. Various biological materials such as blood, urine and cell cultures were used. Reverse phase liquid chromatography was used for the determination of intact drugs and its hydrolysis products; size exclusion chromatography was used to assess the protein profile in samples while the ion-pair chromatography for separation of DNA fragments. The detection of platinum in the eluates by ICP-MS allowed the obtention of clean chromatograms clearly presenting the platinum-containing molecules. The evidence of the applicability of the developed methods was assessed with the search for biomarkers of efficacy of treatment with cisplatin. Several cell lines were exposed to different treatments of cisplatin and their behavior were evaluated. The determination of DNA adducts containing platinum presented an interesting approach for obtaining a marker of resistance to cisplatin treatment.

Les facteurs endogènes et exogènes induisent diverses modifications chimiques et structurales dans l’ADN cellulaire et sont à l’origine de nombreuses erreurs lors de la réplication et de la division cellulaire. Elles sont souvent à l’origine de cancers et de maladies chroniques liées à l’âge. Les agents alkylants induisent des lésions complexes de l’ADN. Ils sont utilisés comme des outils efficaces dans les traitements par chimiothérapies. Les deux caractéristiques majeures des lésions complexes de l’ADN sont d’une part l’encombrement et d’autre part la présence de plus d’une modification dans un tour d’hélice. Les données biochimiques et génétiques montrent que l’élimination des dommages complexes de l’ADN nécessitent plusieurs voies de réparation distinctes. Les caractéristiques cliniques des maladies héréditaires caractérisées par des désordres de réparation de l’ADN, comme l’anémie de Fanconi et le syndrome de Cockayne, visent la nature complexe des lésions oxydatives endogène incluant les adduits encombrants et les pontages interbrins (PIBs). D’autre part, les effets biologiques sévères des agents ionisants, des traitements de chimiothérapie et des cancérigènes environnementaux sont impliqués dans la formation de cassures double brins, des PIBs et des adduits encombrants. Bien que ces derniers représentent une faible proportion des dommages de l’ADN induit par stress oxydatif et les agents chimiques dans les cellules, ils sont extrêmement cytotoxiques s’ils ne sont pas réparés. Par exemple, les cellules cancéreuses sont très sensibles aux PIBs et aux cassures double brins. Alors que la consommation de produits contenant de l’acide aristolochique (AA), qui génère des adduits encombrants dans l’ADN cellulaire, peut être à l’origine de neuropathies et a été associé à une cancérogénèse plus élevée que la fumée de cigarette. L’objectif majeur de ce projet est l’étude de la réparation des lésions complexes de l’ADN et leur implication dans le développement des cancers et leur thérapie. Dans cette présente étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires de la réparation des PIBs et des adduits encombrants de l’ADN et leurs possibles rôles dans la chimio- et radiorésistance acquise. De plus, nous avons étudié le mécanisme moléculaire impliqué dans la mutagénèse induite par la réparation aberrante des adduits encombrants initiée par des ADN glycosylases de la voie BER dans des cellules bactériennes et de mammifères. Durant les trois années de thèse, (i) j’ai construit et caractérisé différents substrats d’ADN contenant diverses bases oxydées, des PIBs induits par le psoralène, des adduits encombrants aristolactame et des photoproduits issus des UV, (ii) j’ai purifié divers ADN glycosylases recombinantes (TDG, MBD4, NEIL1 et NEIL3), (iii) j’ai reconstruit in vitro la réparation des lésions de l’ADN et (iv) j’ai également étudié les interactions protéine-protéine et les modifications post-traductionnelles des protéines impliquées dans la réparation des PIBs générés par le cisplatine initiée par les ADN glycosylases NEIL1 et NEIL3. En combinant les différentes approches développées dans notre laboratoire, nous avons identifié et caractérisé des voies de réparation alternatives impliquées dans l’élimination des dommages complexes de l’ADN. Les résultats obtenus dans ce travail permettraient de comprendre la mécanistique du développement de certains cancers et à identifier les facteurs associés à la chimio- radiorésistance des cellules cancéreuses et par conséquent contribuer au développement de nouvelles préventions de stratégies thérapeutiques. / Endogenous and exogenous mutagenic factors induce variety of chemical and structural modifications in cellular DNA that are at the origin of errors that occur during DNA replication and cell division and often give rise to cancer and other age-related chronic diseases. Importantly, alkylating agents which induce complex DNA lesions are used as a powerful tool for anti-cancer chemotherapy. Two most important features of complex DNA lesions are their bulky character and presence of more than one modification within one turn of DNA helix. Genetic and biochemical data indicate that the elimination of complex DNA lesions requires several distinct DNA repair pathways. The clinical features of inherited human DNA repair deficient disorders such as Fanconi anemia and Cockayne syndrome point to complex nature of endogenous oxidative DNA damage which include bulky adducts and inter-strand DNA crosslinks (ICLs). On the other hand, severe biological effects of ionizing radiation, anticancer drugs and environmental carcinogens are correlated with formation of dirty DNA strand breaks, ICLs and bulky adducts. Although complex lesions typically constitute relatively small fraction of the total DNA damage induced by oxidative stress and drugs in cells, they are extremely cytotoxic if not repaired. For example, cancer cells are primarily very sensitive to ICLs and dirty DNA strand breaks. While, consumption of products containing aristolochic acid (AA), which generates bulky adenine DNA adducts in cellular DNA, can cause neuropathy and has been associated with higher risk of cancer than cigarette smoking. The major objective of the present project is to study the repair of complex DNA lesions and their implications in cancer development and therapy. Here, we investigated molecular mechanisms of the repair of ICLs and bulky DNA lesions and their possible role in the acquired chemo-resistance of cancer cells. In addition, we studied the molecular mechanism of mutagenesis induced by the aberrant DNA glycosylase-mediated BER towards bulky adducts in bacterial and mammalian cells. During three years of the project, I have (i) constructed and characterized DNA substrates containing various oxidized bases, psoralen-derived ICLs, bulky aristolactam-adenine adducts and UV photoproducts; (ii) purified several recombinant human DNA glycosylases (TDG, MBD4. NEIL1 and NEIL3); (iii) reconstituted in vitro the repair of complex DNA lesions; and finally (iv) studied the protein-protein interactions and post-translational protein modifications involved in the DNA glycosylases NEIL1 and NEIL3 initiated repair of cis-platinum induced ICLs. By combining the approaches developed in our laboratories we have identified and characterized alternative DNA repair pathways involved in the cellular processing of complex DNA damage. The results obtained in present work can provide mechanistic understanding of the development of certain cancer and lead to identification of the factors associated with the acquired chemo- and radio-resistance of tumour cells and therefore would contribute to development of new prevention and therapeutic strategies.

Malondialdehyde (MDA) is a mutagenic and carcinogenic product of lipid peroxidation which has also been found at elevated levels in smokers. MDA reacts with nucleic acid bases to form pyrimidopurinone DNA adducts, of which 3-(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)pyrimidol[1,2-α]purin-10(3H)-one (M1dG) is the most abundant and has been linked to smoking. Mutations in the TP53 tumour suppressor gene are associated with half of all cancers. This research applied a multidisciplinary approach to investigate the toxic effects of MDA on the human lung fibroblasts MRC5, which have an intact p53 response, and their SV40 transformed counterpart, MRC5 SV2, which have a sequestered p53 response. Both cell lines were treated with MDA (0-1000 µM) for 24 and 48 h and subjected to a variety of analyses to examine cell proliferation, cell viability, cellular and nuclear morphology, apoptosis, p53 protein expression, DNA topography and M1dG adduct detection. For the first time, mutation sequencing of the 5’ untranslated region (UTR) of the TP53 gene in response to MDA treatment was carried out. The main findings were that both cell lines showed reduced proliferation and viability with increasing concentrations of MDA, the cell surface and nuclear morphology were altered, and levels of apoptosis and p53 protein expression appeared to increase. A LC MS-MS method for detection of M1dG adducts was developed and adducts were detected in CT-DNA treated with MDA in a dose-dependent manner. DNA appeared to become more fragmented with increasing MDA concentration, and the number of mutations in the 5’ UTR region of the TP53 gene also increased. The majority of mutations observed were insertions, compared to lung cancer mutation data where the majority were G to T transversions. This was unexpected, suggesting that tobacco smoke compounds have a different role in mutagenesis than endogenous lipid peroxidation. Thus, MDA has been found to have a clear effect on human lung fibroblasts at both the cellular and DNA level.