Darmkrebs ist für etwa 10% aller krebsbedingten Todesfälle verantwortlich, und etwa 50% aller Darmkrebspatienten weisen onkogene Mutationen in KRAS, NRAS oder BRAF Genen auf. Eine wichtige Funktion in Krebszellen ist die Kontrolle von DNA Reparatur- und Schadensreaktionswegen (DDR), da Tumorzellen häufig unter erhöhtem Replikationsstress leiden. Die Aktivierung von MAPK-Signalen durch RAS und RAF Onkogenen ist Auslöser von Replikationsstress. Allerdings sind DDR Checkpoint Inhibitoren in klinischen Studien gescheitert, da das Verständnis über die mechanistische Verbindung zwischen MAPK Effektornetzwerken und DDR gering ist. Dieses Projekt zielt darauf ab, die funktionellen Zusammenhänge zwischen MAPK- und DDR-Regulationsnetzwerken zu untersuchen und Mechanismen zu ermitteln, welche die Sensitivität von Checkpoint-Inhibitoren bei Darmkrebs beeinflussen. Wir haben die Sensitivität von KRAS und BRAF V600E mutierten Darmkrebszelllinien hinsichtlich einer Checkpoint Inhibition getestet und die MAPK- und DDR-Regulationsnetzwerke mittels CyTOF und quantitativer Western-Blot-Analyse analysiert. Darüber hinaus wurden durch einen gezielten CRISPR-i-Screen synthetisch letale Zielgene für Checkpoint Inhibitoren identifiziert und potenzielle Resistenzmechanismen aufgedeckt. Die Mehrheit der BRAF V600E-mutierten Zelllinien erwies sich als übermäßig empfindlich gegenüber der Chk1 Inhibition. Die Analyse der Reaktion auf Chk1 Inhibitoren ergab eine unterschiedliche Regulierung der DDR-Effektoren, sowie der p38 MAPK, mTOR- und NF-κB-Signalwege zwischen empfindlichen und resistenten Linien. Ein CRISPR-i-Screen in der Chk1i-sensitiven Zelllinie HT29 zeigte die Beteiligung von Regulatoren der Replikationsgabel, die entweder direkt mit Chk1 interagieren oder als Chk1-Effektoren fungieren. Dies deutet auf eine erhöhte Abhängigkeit von einem funktionellen DDR-Signalweg hin. Im Gegensatz zu BRAF V600E war onkogenes KRAS kein Indikator für eine Sensitivität auf Chk1 Inhibition. / Colorectal cancer (CRC) accounts for approximately 10% of all cancer-related deaths, and approximately 50% of all CRC patients have oncogenic mutations in KRAS, NRAS, or BRAF. An important function in cancer is the control of DNA repair and DNA damage response (DDR) pathways, as tumor cells often suffer from increased replication stress. The activation of MAPK signaling by RAS/RAF oncogenes triggers replication stress. However, DDR checkpoint inhibitors have failed in clinical trials because the molecular processes involved in DDR checkpoint signaling are not well understood, and the knowledge of the mechanistic link between MAPK effector networks and DDR in CRC is minor. This project aimed to investigate the functional dependencies between MAPK and DDR regulatory networks and to uncover the mechanisms that mediate checkpoint inhibitor sensitivity in CRC. We tested the sensitivity of KRAS and BRAFV600E mutated CRC cell lines to checkpoint inhibition and analyzed MAPK and DDR regulatory networks using cytometry by time of flight (CyTOF) and quantitative western blot analysis. In addition, a targeted CRISPR-i screen identified synthetic lethal targets for Chk1/Mk2 inhibitors and revealed the potential resistance mechanisms. Interestingly, the majority of BRAFV600E mutant CRC cell lines proved to be overly sensitive to Chk1 inhibition. Analysis of the response to checkpoint inhibitors using a CyTOF panel and quantitative western blot analyses revealed differential regulation of checkpoint effectors and the p38 MAPK, mTOR, and NF-κB signaling pathways between sensitive and resistant lines. A CRISPR-i screen in the Chk1i-sensitive cell line HT29 indicated the involvement of replication fork regulators that either interact directly with Chk1 or function as Chk1 effectors. This indicates an increased reliance of BRAFV600E CRC cell lines on functional DDR signaling. In contrast, the presence of oncogenic KRAS does not indicate sensitivity to checkpoint interference.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acétylation de l’histone H3 sur la Lysine 56 (H3K56ac) a lieu sur toutes les histones H3 nouvellement synthétisées qui sont déposées derrière les fourches de réplication. L’acétylation de H3K56 joue un rôle primordial dans l’assemblage de l’ADN lors la réplication et la réparation. L’acétylation de H3K56 joue également un rôle important dans la stabilité génomique et la stabilisation des fourches de réplication bloquée. En effet, les cellules dépourvues de H3K56ac sont sensibles au méthane sulfonate de méthyle (MMS) et à d’autres agents génotoxiques qui causent du stress réplicatif. Notre projet visait à investiguer les liens entre la protéine du réplisome Ctf4 et l’acétyltransférase d’histone Rtt109. Dans un premier lieu, la délétion de CTF4 a partiellement contré la sensibilité des cellules rtt109Δ au MMS. Notre analyse génétique a aussi montré que Ctf4, Rtt109, et le complexe Rtt101-Mms1-Mms22 agissent dans la même voie de réponse face à un stress réplicative. Nos résultats montrent que les cellules ctf4Δ et rtt109Δ présentent des foyers intenses du complexe de liaison à l'ADN simple-brin RPA en réponse au stress réplicatif, suggérant la formation excessive de régions d'ADN simple-brin aux fourches de réplication bloquées, ce qui conduit à une hyper activation des points de contrôle des dommages à l'ADN. Ces mutants présentent des ponts anaphase et des foyers persistants des protéines de recombinaison homologues Rad51 et Rad52 en réponse aux génotoxines, suggérant ainsi que la structure anormale des réplisomes bloqués peut compromettre leur récupération. Nos résultats indiquent également que la délétion des gènes de la RH (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 et MUS81) avec ctf4Δ et rtt109Δ respectivement, engendre une sensibilité synergique au MMS, suggérant que les cellules qui sont déficientes en H3K56 acétylation utilisent la RH pour réparer les dommages causés suite à un stress réplicatif. En conclusion, nos résultats suggèrent que les cellules déficientes en H3K56ac présentent des défauts de RH en réponse aux dommages à l’ADN induits par le MMS durant la phase S. / In Saccharomyces cerevisiae, histone H3 lysine 56 acetylation (H3K56ac) occurs on all newly synthesized histones H3 that are deposited behind DNA replication forks. H3K56ac plays critical role in chromatin assembly during DNA replication and repair. H3K56ac is also required for genome stability and stabilization of stalled replication fork. Cells lacking H3K56ac are sensitive to methyl methane sulfonate and other drugs that cause replicative stress. In this thesis, we investigated the links between the replisome protein Ctf4 and the H3K56 acetyltransferase Rtt109. Deletion of CTF4 partially rescued the sensitivity of rtt109Δ cells to methyl methane sulfonate. Genetic analyses also showed that Ctf4, Rtt109, and the Rtt101-Mms1-Mms22 complex act in the same pathway to response to replicative stress. ctf4Δ and rtt109Δ cells displayed intense foci of the single-stranded DNA binding complex RPA during replicative stress, suggesting formation of excess single-stranded DNA regions at stalled replication forks, leading to hyper activation of DNA damage checkpoints. These mutants accumulated anaphase bridges and persistent foci of the homologous recombination proteins Rad51 and Rad52 in response to genotoxins, suggesting that abnormal DNA structure formed at stalled replisome may compromise their recovery. Deletion of HR genes (RAD51, RAD52, RAD54, RAD55 and MUS81) together with ctf4Δ and rtt109Δ presents synergistic sensitivity to MMS, suggesting that H3K56ac deficient cells use HR to repair the damages caused by replicative stress. Overall our results demonstrate that H3K56ac deficient cells cannot recover MMS- induced damages because HR is compromised in these mutants.