京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第21474号 / 生博第405号 / 新制||生||53(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 松田 道行, 教授 影山 龍一郎, 教授 渡邊 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

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Les interactions entre le circovirus porcin de génotype 2b (PCV2b), le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) et le virus de l’influenza porcine (VIP) dans le complexe respiratoire porcin (CRP) sont souvent associées à une augmentation des signes cliniques respiratoires chez les animaux. L’objectif général de cette étude était de caractériser les effets et les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogenèse de la co-infection de PCV2b avec le VSRRP ou le VIP dans des modèles cellulaires des voies respiratoires du porc. La réplication virale, la viabilité cellulaire, l’expression de l’ARNm des cytokines et la modulation de l’expression des gènes cellulaires induite par l’infection virale ont été évalués dans les cellules co-infectées versus les cellules infectées par un seul virus. Les résultats obtenus ont permis de confirmer que la réplication du PCV2b augmente en présence du VSRRP dans les cellules épithéliales des voies respiratoires porcines (NPTr) génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur CD163 (NPTr-CD163), tandis que celle du VSRRP est diminuée. Il a été mis en évidence que le PCV2b provoque une diminution ou une augmentation de la réplication du VIP dans les cellules NPTr et les macrophages alvéolaires porcins (iPAM 3D4/21), respectivement. Cependant, la réplication du PCV2b n’est pas affectée en présence du VIP. L’expression des ARNm des cytokines varie différemment selon le modèle de co-infection analysé et le type cellulaire infecté. L’expression des interférons de type I (α/β) a été significativement réduite dans les cellules NPTr-CD163, co- infectées par le PCV2b et le VSRRP (PCV2b/VSRRP) par rapport aux mêmes cellules infectées uniquement par le PCV2b. Cependant, la co-infection du PCV2b et du VIP (PCV2b/VIP) a causé une augmentation synergique de l’expression des IFNs de type I et de type II dans les cellules NPTr, tandis que dans les cellules iPAM 3D4/21, le PCV2b a affecté la réponse des IFNs induite par le VIP. À la suite des analyses transcriptomiques, plusieurs gènes différentiellement exprimés ont été identifiés dans les cellules co-infectées ou infectées par un seul virus. Dans les cellules co-infectées PCV2b/VSRRP, le niveau d’expression de l’ARNm et de la protéine du gène cellulaire codant pour la phosphatase 1 à double spécificité (DUSP1) ont été significativement augmentés. La réduction de l’expression de DUSP1, à l’aide des petits ARN interférents (ou siRNA pour small interfering RNA) dans les cellules co-infectées a significativement réduit la réplication du PCV2b, suggérant un rôle de DUSP1 dans la pathogenèse de la co-infection PCV2b/VSRRP. / Interactions of porcine circovirus genotype 2b (PCV2b), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and swine influenza virus (SwIV) in the porcine respiratory complex (PRC) are often associated with increased respiratory clinical signs in animals. The general objective of this study was to characterize the effects and molecular mechanisms involved in the pathogenesis of PCV2b co-infection with PRRSV or SwIV using cellular models of the porcine respiratory tract. Viral replication, cell viability, cytokine mRNA expression and modulation of cell gene expression induced by viral infection were evaluated in co-infected cells versus single infected cells. The results obtained confirmed that PCV2b replication increases in the presence of PRRSV in porcine respiratory epithelial cells (NPTr) genetically modified to express the CD163 receptor (NPTr-CD163), whereas PRRSV is decreased. It was demonstrated that PCV2b causes a decrease or an increase in SwIV replication in NPTr cells and porcine alveolar macrophages (iPAM 3D4/21), respectively. However, PCV2b replication was not affected in the presence of SwIV. The impact of co-infections on cytokine mRNA expression varied according to the co- infection model and the type of infected cell. Type I IFNs (α/β) expression was significantly reduced in PCV2b/PRRSV co-infected NPTr-CD163 cells compared to PCV2b single-infected cells. However, PCV2b/SwIV co- infection caused a synergistic increase in type I IFNs expression in NPT cells, while in iPAM 3D4/21 cells, PCV2b affected SwIV-induced IFN response. As result of transcriptomic analyses, differentially expressed genes were identified in co-infected and single infected cells. It was observed that in PCV2b/PRRSV co- infected cells, the mRNA and protein expression levels of the cellular gene coding for the dual specificity protein phosphatase 1 (DUSP1) were significantly increased. Knockdown of DUSP1 expression in co- infected cells, using specific siRNA, significantly reduced PCV2b replication, suggesting a role for DUSP1 in the pathogenesis of PCV2b/PRRSV co-infection.

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Invariant natural killer T (iNKT) cells are a versatile subclass of T lymphocytes which recognize glycolipid antigens. iNKT cells are capable of rapidly producing a broad array of cytokines in response to stimulation; thus, they play an important role in the early regulation of a variety of immune responses. It was hypothesized that iNKT cells express functional Toll-like receptors (TLRs) and that stimulation of TLRs by their ligands modulates iNKT cells responses. In the first objective, it was revealed that upon stimulation with anti-CD3 monoclonal antibody and interferon (IFN)-α, expression of TLRs was enhanced in iNKT cells. Furthermore, stimulation of iNKT cells with TLR ligands led to a significant increase in the expression of several cytokines. In the second objective, the mechanisms behind the modulatory effects of the TLR9 ligand (CpG-ODN) on iNKT cells were determined. Altogether, these findings suggest a direct role for TLRs in iNKT cell activation. / Ontario Graduate Scholarship