Durante a gestação, observamos um influxo de linfócitos para a região mesometrial de camundongos denominados de células Natural Killer Uterinas (uNK). Estas células desempenham funções importantes no início da gestação, como a manutenção da tolerância materna ao feto, angiogênese e remodelação das artérias espiraladas. Sua capacidade citolítica é reduzida podendo ser ativada caso haja algum desequilíbrio entre citocinas pró e anti-inflamatórias durante a gestação. A ciclofosfamida é um medicamento usado no tratamento de doenças autoimunes e câncer. Trata-se de um teratógeno, sendo que seu uso pode levar a alterações macroscópicas e microscópicas, bem como, a redução da viabilidade gestacional em camundongos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da ciclofosfamida no útero e nas células uNK de camundongos no 10° ddg, por meio da análise morfológica, citoquímica e estereológica concomitantemente a análise da viabilidade gestacional e no comportamento destes animais nos parâmetros de depressão e ansiedade. Nossos resultados mostraram que a ciclofosfamida provoca rapidamente o aumento de células uNK no útero, bem como, diminuição na expressão de N-acetil-D-galactosamina em seus grânulos e superfície, atingindo primeiramente células uNK menos diferenciadas próximas ao mesométrio, e posteriormente células mais diferenciadas em regiões mais próximas ao embrião. Seu efeito drástico na gestação provocou ainda diminuição no número de células uNK após 48h de sua administração, concomitante ao aparecimento de muitos sítios em reabsorção, diminuindo a viabilidade gestacional, bem como, estabelecimento de comportamento semelhante ao doentio nesses animais, causando 100% de perda embrionária diagnosticada em nosso estudo da prenhez a termo / During pregnancy, we observed an influx of lymphocytes into the region of mice mesometrial decidua. These cells are natural killer cells (NK), presenting different behavior and phenotype of circulating NK cells. Uterine Natural Killer Cells (uNK) play important roles in early pregnancy, such as maintaining maternal tolerance to the fetus, angiogenesis and remodeling of the spiral arteries. Their cytolytic capacity is reduced during pregnancy and can be activated if there is an imbalance between pro and anti-inflammatory cytokines. Cyclophosphamide is a drug used in treating autoimmune diseases and cancer. It is known that it is a teratogen, and its use can lead to macroscopic and microscopic changes, as well as the reduction of viability pregnancy in mice. The objective of this study was to evaluate the effects of cyclophosphamide in the uterus and in cells uNK (morphological analysis, cytochemistry and stereological) on the 10th ddg, as well as its effects on behavior related to depression and anxiety. Our results showed that cyclophosphamide rapidly increased uNK cells number in the uterus as well as decreased expression of N-acetyl-D-galactosamine in their granules and surface, early reaching less differentiated uNK cells near the mesometrium, and latter more differentiated uNK cells closer to the embryo. His dramatic effect on pregnancy still caused a decreasing in the number of uNK cells 48 after the drug administration, concomitant with the appearance of many resorption implantation sites, decreasing of gestational viability, as well as, establishment of sickness-like behavior, causing 100% of embryo loss diagnosed in the pregnancy to term. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O Brasil é um dos países com o maior número de transferências de embriões de equinos do mundo, mas as éguas receptoras são escassas e caras. Uma alternativa é usar mulas acíclicas como receptoras de embriões equinos. O objetivo deste estudo foi comparar pela primeira vez o desenvolvimento embrionário e fetal precoce em mulas e éguas receptoras do 10º ao 60º dia de gestação. Este estudo foi realizado na Fazenda Experimental Gralha Azul da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Cinco éguas de doadores de embriões com idades entre 4 e 10 anos foram utilizadas. Foram utilizados dois grupos de receptores: 10 éguas cíclicas com idades entre 4 e 15 anos (grupo controle) e 7 mulas acíclicas com idades entre 6 e 12 anos. Os animais foram mantidos em piquetes e/ou estábulos e tiveram acesso a água e sal mineral ad libitum, bem como a uma fonte de volumoso e concentrado. As éguas doadoras foram monitoradas diariamente por ultrassonografia transretal (transdutor linear de 5 MHz, A6V Sonoscape, China) após o início do estro. As éguas foram inseminadas artificialmente usando sêmen fresco de um garanhão com fertilidade comprovada. A coleta de embriões das éguas foi realizada 8 dias após a ovulação. Antes da transferência do embrião, as éguas receptoras cíclicas eram examinadas diariamente por ultrassonografia para usar a melhor sincronia com a ovulação da doadora. As mulas acíclicas foram preparadas antes da transferência do embrião com a administração de 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, im) no dia da ovulação da doadora, e após 2 dias quando a presença de edema uterino foi confirmada, com a administração de Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, im). O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia, 10 dias após a ovulação da doadora. Quando o diagnóstico foi confirmado, a avaliação ultrassonográfica foi realizada diariamente até o 60º dia de gestação. O primeiro dia de detecção da vesícula embrionária foi o Dia 10 por ultrassonografia em ambas as espécies e Dia 20,9 ± 1,3 (Média ± DP) e 21,9 ± 0,9 por palpação transretal em mulas e éguas respectivamente. A fixação da vesícula ocorreu em média no dia 15,7 ± 1,1 em mulas e 16,6 ± 1,7 em éguas. O embrião propriamente dito foi detectado pela primeira vez em mulas (no dia 19,9 ± 1,1) em comparação com as éguas (20,4 ± 1,3). O batimento cardíaco foi observado posteriormente em muares (23,4 ± 1,4) do que em éguas (22,6 ± 0,8). O saco alantóide foi detectado pela primeira vez entre os dias 23 e 26 (25,3 ± 1,1 e 24,6 ± 1,0 em mulas e éguas, respectivamente) e o cordão umbilical foi detectado pela primeira vez no dia 39 (39,7 ± 2,1 x 39,6 ± 1,5 em mulas e éguas, respectivamente). Os diâmetros ovarianos para os ovários esquerdo e direito foram semelhantes para as mulas (21,4 ± 0,4 vs. 21,8 ± 0,4 mm) e para as éguas (45,1 ± 0,4 vs 46,0 ± 0,4). Entretanto, o diâmetro ovariano das éguas (45,5 ± 0,3 mm) foi duas vezes maior (P <0,0001) que as mulas (21,6 ± 0,3 mm). Apenas duas mulas apresentaram o CL acessório que foi observado pela primeira vez nos dias 49 e 51. Dentro dos grupos não houve diferenças entre os cornos esquerdo e direito, gravídicos e não-gravídicos. A média geral não foi diferente entre as mulas (24,6 ± 3,1 mm) e as éguas (25,4 ± 0,1 mm). Como conclusão, de acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo comparativo sobre desenvolvimento embrionário e fetal precoce entre mulas acíclicas e éguas receptoras de embriões equinos. Numerosas semelhanças foram encontradas nos aspectos estudados. Tais achados, associados ao fato de que potros vivos e sadios foram produzidos, sugerem que o uso de mulas acíclicas pode ser considerado como uma alternativa para aumentar a disponibilidade de receptoras em programas equinos de TE. / Brazil is one of the countries with the largest number of equine embryo transfers in the world, but recipients mares are scarce and expensive. One alternative is to use acyclic mules as recipients for equine embryos. The aim of this study was to compare for the first time the embryonic and early fetal development in recipient mules and mares from day 10 to 60 of pregnancy. This study was conducted at the Experimental Farm Gralha Azul of the Pontifical Catholic University of Paraná. Five embryo donor mares aged 4 to 10 years were used. Two groups of recipients were used: 10 cyclic mares aged 4 to 15 years (control group), and 7 acyclic mules aged 6 to 12 years. Animals were kept in paddocks and/or stables and had access to water and mineral salt ad libitum, as well as to a source of roughage and concentrate. Donor mares were monitored daily by transrectal ultrasonography (5-MHz linear transducer, A6V Sonoscape, China) after the beginning of estrus. The mares were artificially inseminated using fresh semen from a stallion with proven fertility. Embryo collection from the mares was performed 8 days after ovulation. Before embryo transfer, cyclic recipient mares were examined daily by ultrasonography to use the most synchronous with the donor's ovulation and have not received any hormonal treatment. The acyclic mules were prepared before the embryo transfer with the administration of 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, i.m.) on the day of the donor's ovulation, and after 2 days when the presence of uterine edema was confirmed, with the administration of Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, i.m.). The pregnancy diagnosis was carried out by ultrasonography 10 days after ovulation in the donor. When the diagnosis was confirmed, ultrasonographic assessment was carried out daily until day 60 of pregnancy. The first day of detection of an embryonic vesicle was Day 10 by ultrasound in both species and day 20.9 ± 1.3 (Mean ±SD), and 21.9 ± 0.9 by transrectal palpation in mules and mares respectively. Fixation of the vesicle occurred on mean day 15.7 ± 1.1 in mules and 16.6 ± 1.7 in mares. The embryo proper was first detected in mules (on day 19.9 ± 1.1) compared to mares (20.4 ± 1.3) The heart beat was observed later in mules (23.4 ± 1.4) than in mares (22.6 ± 0.8). The allantoic sac was first detected between days 23 and 26 (25.3 ± 1.1 and 24.6 ± 1.0 in mules and mares, respectively) and the umbilical cord was first detected on day 39 (39.7 ± 2.1 x 39.6 ± 1.5 in mules and mares, respectively). The ovarian diameters for left and right ovaries were similar for mules (21.4 ± 0.4 vs. 21.8 ± 0.4 mm) and for mares (45.1 ± 0.4 vs. 46.0 ± 0.4). However, the ovarian diameter of the mares (45.5 ± 0.3 mm) was two times larger (P<0.0001) than the mules (21.6 ± 0.3 mm). Within groups there were no differences between left and right and gravid and non-gravid horns. Data were combined for comparison of the endometrial diameter between mules and mares. The overall mean was not different between mules (24.6 3.1 ± 0.1 mm) and mares (25.4 ± 0.1 mm). However, day (P<0.003) and group-by-day (P<0.0001) effects were detected. Only two mules presented accessory CL that was observed for the first time on days 49 e 51. In conclusion, to the best of our knowledge, this is the first comparative study on embryo and early fetal development between noncycling mules and mares used as ET recipients of horse-horse embryos. Numerous similarities in embryo and early fetal development, and endocrinology aspects were seen. The findings of this study in mules, associated with the fact that alive and healthy offspring were produced, the use of mules may be considered as an alternative to increase the availability of recipients in equine ET programs.

Introdução: Alterações no ambiente fetal conferem um risco aumentado para doenças crônicas como obesidade, doença cardiovascular, hipertensão arterial e diabetes tipo 2. As evidências sugerem que a restrição de crescimento intrauterino (RCIU) pode programar de forma persistente as preferências alimentares, e acredita-se que esse tipo de alteração comportamental, pode explicar, pelo menos em parte, o aumento do risco para essas doenças em indivíduos que sofreram RCIU. Portanto, torna-se importante entender os fatores associados e mecanismos envolvidos nesse comportamento. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da RCIU no comportamento alimentar em animais e humanos, assim como os possíveis mecanismos envolvidos na sua programação. Métodos: Ratas Sprague Dawley prenhes foram randomizadas para o grupo controle (Adlib), que recebeu dieta padrão ad libitum ou grupo restrição 50% (FR), que recebeu 50% do consumo habitual de genitoras alimentadas ad libitum. As dietas foram oferecidas a partir do dia 10 de gestação até o dia 21 de lactação. Em até 24h após o nascimento, foi realizada a adoção cruzada formando os grupos: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. O consumo de ração padrão foi comparado entre todos os grupos. A preferência alimentar, a preferência condicionada por lugar induzida por alimento palatável, assim como a fosforilação da enzima tirosina hidroxilase e os níveis de receptores D2 no núcleo acumbens foram comparados entre os grupos de interesse (Adlib_Adlib e FR_Adlib). Nos humanos, 75 jovens, classificados quanto à RCIU, participaram de avaliação antropométrica, bioquímica e de comportamento alimentar (teste de escolha alimentar, no qual todos recebiam um valor monetário para compra de um lanche, e Dutch Eating Behaviour Questionnaire, DEBQ). Dados de neuroimagem funcional em repouso entre regiões relacionadas à recompensa de 28 indivíduos foram processados e analisados, de um total de 43 exames realizados. Resultados: No estudo experimental, viu-se que o consumo de ração padrão não foi diferente entre os grupos. Ratos restritos apresentaram preferência pela dieta palatável, mas menor condicionamento de preferência ao lugar associado ao alimento palatável. A fosforilação da tirosina hidroxilase no núcleo acumbens foi maior nestes animais no estado basal, mas após exposição ao doce essa diferença entre os grupos permaneceu apenas nos machos. A RCIU também se associou a menores níveis de receptores D2 no núcleo acumbens. No estudo clínico, encontrou-se que a menor razão de crescimento fetal (indicativo de maior RCIU) e alto índice de massa corporal predizem um estilo alimentar restritivo visto pelo DEBQ. Pessoas nascidas com RCIU também usaram menor quantidade do um recurso financeiro oferecido no teste de escolha alimentar após um período de jejum. Os dados de neuroimagem funcional sugerem que os indivíduos restritos apresentam um padrão de conectividade em repouso alterado entre o córtex orbito-frontal, o estriado ventral/dorsal e a amígdala. Conclusão: A RCIU esteve associada com preferência por alimentos palatáveis e alterações no sistema dopaminérgico no estudo experimental e alterações da conectividade em repouso entre áreas do sistema mesocorticolímbico no estudo clínico. As alterações observadas no sistema dopaminérgico dos animais restritos indicam que esse sistema estaria envolvido na programação da preferência alimentar nesses indivíduos. Além disso, o padrão de conectividade em repouso observado nos indivíduos restritos sugere que alterações em determinadas regiões do sistema de recompensa poderiam estar associadas com mudanças no comportamento alimentar. As alterações neurocomportamentais observadas confirmam a existência de programação fetal do comportamento alimentar pela RCIU, apontando modificações persistentes no sistema de recompensa do cérebro, o que pode ser visto como um fator de risco para o desenvolvimento de obesidade e suas comorbidades. / Introduction: Fetal environment changes can lead to adaptations that are associated with increased risk for obesity, cardiovascular disease, hypertension and diabetes in adult life. Evidence suggests that intrauterine growth restriction (IUGR) can persistently program the subject’s preference for palatable foods. It is believed that feeding behavior alterations can explain, at least in part, the increased risk for chronic diseases in IUGR individuals. Therefore, it becomes important to understand the factors and mechanisms involved in this behavior. The aim of this study was to explore how IUGR affects feeding behavior of animals and humans, as well as to verify the potential mechanisms related to this behavioral programming. Methods: Time-mated pregnant Sprague-Dawley rats were randomly allocated to Control (receiving standard chow ad libitum) or 50% food restricted (FR), receiving 50% of the ad libitum-fed dam’s habitual intake. These diets were provided from day 10 of pregnancy throughout day 21 of lactation. Within 24 hours after birth, pups were crossfostered, forming four groups: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. Standard chow consumption was compared between all groups. Food preference, conditioned place preference to a palatable diet, and the nucleus accumbens tyrosine hydroxylase phosphorylation and D2 receptor levels were analyzed focusing on two groups of interest (Adlib_Adlib and FR_Adlib). In humans, 75 youths were classified regarding IUGR and had anthropometric data, biochemical data, and feeding behavior (food choice task, in which everyone received a monetary value to purchase a snack, and Dutch Eating Behaviour Questionnaire) assessed. Forty three neuroimaging exams were performed and resting state functional connectivity between brain regions related to reward of 28 individuals were processed and analyzed. Results: In the experimental study, standard chow consumption was not different between groups. IUGR adult rats had increased preference for palatable food, but showed less conditioned place preference to a palatable diet compared to controls. At baseline, the accumbal tyrosine hydroxylase phosphorylation was increased in IUGR rats compared to controls. After sweet food exposure, the difference between groups remained only in males. Accumbal D2 receptors levels were decreased in IUGR rats. In the clinical study, it was found that low birth weight ratio (indicative of higher IUGR) and high body mass index predict a restrained eating style as seen by the DEBQ. IUGR individuals used a smaller quantity of a financial resource offered in the food choice task after a fasting period. Resting state functional connectivity data suggest that IUGR individuals had an altered pattern of connectivity between the orbitofrontal cortex, the ventral/dorsal striatum and the amygdala. Conclusion: IUGR was associated with a preference for palatable foods and alterations in the dopaminergic system in the experimental study, as well as changes in the resting state functional connectivity between regions of the mesocorticolimbic pathway in the clinical study. Alterations in the mesolimbic dopaminergic system observed in IUGR rats indicate an important role in the programming of food preferences. Moreover, the IUGR pattern of brain connectivity observed suggests that alterations in certain regions involved in reward processing and evaluation could be associated with changes in eating behavior. Neurobehavioral changes observed confirmed the existence of a fetal programming of feeding behavior associated with IUGR, pointing out to persistent modifications in the brain reward system, which can be seen as a risk factor for the development of obesity and its comorbidities.

O Brasil é um dos países com o maior número de transferências de embriões de equinos do mundo, mas as éguas receptoras são escassas e caras. Uma alternativa é usar mulas acíclicas como receptoras de embriões equinos. O objetivo deste estudo foi comparar pela primeira vez o desenvolvimento embrionário e fetal precoce em mulas e éguas receptoras do 10º ao 60º dia de gestação. Este estudo foi realizado na Fazenda Experimental Gralha Azul da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Cinco éguas de doadores de embriões com idades entre 4 e 10 anos foram utilizadas. Foram utilizados dois grupos de receptores: 10 éguas cíclicas com idades entre 4 e 15 anos (grupo controle) e 7 mulas acíclicas com idades entre 6 e 12 anos. Os animais foram mantidos em piquetes e/ou estábulos e tiveram acesso a água e sal mineral ad libitum, bem como a uma fonte de volumoso e concentrado. As éguas doadoras foram monitoradas diariamente por ultrassonografia transretal (transdutor linear de 5 MHz, A6V Sonoscape, China) após o início do estro. As éguas foram inseminadas artificialmente usando sêmen fresco de um garanhão com fertilidade comprovada. A coleta de embriões das éguas foi realizada 8 dias após a ovulação. Antes da transferência do embrião, as éguas receptoras cíclicas eram examinadas diariamente por ultrassonografia para usar a melhor sincronia com a ovulação da doadora. As mulas acíclicas foram preparadas antes da transferência do embrião com a administração de 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, im) no dia da ovulação da doadora, e após 2 dias quando a presença de edema uterino foi confirmada, com a administração de Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, im). O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia, 10 dias após a ovulação da doadora. Quando o diagnóstico foi confirmado, a avaliação ultrassonográfica foi realizada diariamente até o 60º dia de gestação. O primeiro dia de detecção da vesícula embrionária foi o Dia 10 por ultrassonografia em ambas as espécies e Dia 20,9 ± 1,3 (Média ± DP) e 21,9 ± 0,9 por palpação transretal em mulas e éguas respectivamente. A fixação da vesícula ocorreu em média no dia 15,7 ± 1,1 em mulas e 16,6 ± 1,7 em éguas. O embrião propriamente dito foi detectado pela primeira vez em mulas (no dia 19,9 ± 1,1) em comparação com as éguas (20,4 ± 1,3). O batimento cardíaco foi observado posteriormente em muares (23,4 ± 1,4) do que em éguas (22,6 ± 0,8). O saco alantóide foi detectado pela primeira vez entre os dias 23 e 26 (25,3 ± 1,1 e 24,6 ± 1,0 em mulas e éguas, respectivamente) e o cordão umbilical foi detectado pela primeira vez no dia 39 (39,7 ± 2,1 x 39,6 ± 1,5 em mulas e éguas, respectivamente). Os diâmetros ovarianos para os ovários esquerdo e direito foram semelhantes para as mulas (21,4 ± 0,4 vs. 21,8 ± 0,4 mm) e para as éguas (45,1 ± 0,4 vs 46,0 ± 0,4). Entretanto, o diâmetro ovariano das éguas (45,5 ± 0,3 mm) foi duas vezes maior (P <0,0001) que as mulas (21,6 ± 0,3 mm). Apenas duas mulas apresentaram o CL acessório que foi observado pela primeira vez nos dias 49 e 51. Dentro dos grupos não houve diferenças entre os cornos esquerdo e direito, gravídicos e não-gravídicos. A média geral não foi diferente entre as mulas (24,6 ± 3,1 mm) e as éguas (25,4 ± 0,1 mm). Como conclusão, de acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo comparativo sobre desenvolvimento embrionário e fetal precoce entre mulas acíclicas e éguas receptoras de embriões equinos. Numerosas semelhanças foram encontradas nos aspectos estudados. Tais achados, associados ao fato de que potros vivos e sadios foram produzidos, sugerem que o uso de mulas acíclicas pode ser considerado como uma alternativa para aumentar a disponibilidade de receptoras em programas equinos de TE. / Brazil is one of the countries with the largest number of equine embryo transfers in the world, but recipients mares are scarce and expensive. One alternative is to use acyclic mules as recipients for equine embryos. The aim of this study was to compare for the first time the embryonic and early fetal development in recipient mules and mares from day 10 to 60 of pregnancy. This study was conducted at the Experimental Farm Gralha Azul of the Pontifical Catholic University of Paraná. Five embryo donor mares aged 4 to 10 years were used. Two groups of recipients were used: 10 cyclic mares aged 4 to 15 years (control group), and 7 acyclic mules aged 6 to 12 years. Animals were kept in paddocks and/or stables and had access to water and mineral salt ad libitum, as well as to a source of roughage and concentrate. Donor mares were monitored daily by transrectal ultrasonography (5-MHz linear transducer, A6V Sonoscape, China) after the beginning of estrus. The mares were artificially inseminated using fresh semen from a stallion with proven fertility. Embryo collection from the mares was performed 8 days after ovulation. Before embryo transfer, cyclic recipient mares were examined daily by ultrasonography to use the most synchronous with the donor's ovulation and have not received any hormonal treatment. The acyclic mules were prepared before the embryo transfer with the administration of 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, i.m.) on the day of the donor's ovulation, and after 2 days when the presence of uterine edema was confirmed, with the administration of Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, i.m.). The pregnancy diagnosis was carried out by ultrasonography 10 days after ovulation in the donor. When the diagnosis was confirmed, ultrasonographic assessment was carried out daily until day 60 of pregnancy. The first day of detection of an embryonic vesicle was Day 10 by ultrasound in both species and day 20.9 ± 1.3 (Mean ±SD), and 21.9 ± 0.9 by transrectal palpation in mules and mares respectively. Fixation of the vesicle occurred on mean day 15.7 ± 1.1 in mules and 16.6 ± 1.7 in mares. The embryo proper was first detected in mules (on day 19.9 ± 1.1) compared to mares (20.4 ± 1.3) The heart beat was observed later in mules (23.4 ± 1.4) than in mares (22.6 ± 0.8). The allantoic sac was first detected between days 23 and 26 (25.3 ± 1.1 and 24.6 ± 1.0 in mules and mares, respectively) and the umbilical cord was first detected on day 39 (39.7 ± 2.1 x 39.6 ± 1.5 in mules and mares, respectively). The ovarian diameters for left and right ovaries were similar for mules (21.4 ± 0.4 vs. 21.8 ± 0.4 mm) and for mares (45.1 ± 0.4 vs. 46.0 ± 0.4). However, the ovarian diameter of the mares (45.5 ± 0.3 mm) was two times larger (P<0.0001) than the mules (21.6 ± 0.3 mm). Within groups there were no differences between left and right and gravid and non-gravid horns. Data were combined for comparison of the endometrial diameter between mules and mares. The overall mean was not different between mules (24.6 3.1 ± 0.1 mm) and mares (25.4 ± 0.1 mm). However, day (P<0.003) and group-by-day (P<0.0001) effects were detected. Only two mules presented accessory CL that was observed for the first time on days 49 e 51. In conclusion, to the best of our knowledge, this is the first comparative study on embryo and early fetal development between noncycling mules and mares used as ET recipients of horse-horse embryos. Numerous similarities in embryo and early fetal development, and endocrinology aspects were seen. The findings of this study in mules, associated with the fact that alive and healthy offspring were produced, the use of mules may be considered as an alternative to increase the availability of recipients in equine ET programs.

O Brasil é um dos países com o maior número de transferências de embriões de equinos do mundo, mas as éguas receptoras são escassas e caras. Uma alternativa é usar mulas acíclicas como receptoras de embriões equinos. O objetivo deste estudo foi comparar pela primeira vez o desenvolvimento embrionário e fetal precoce em mulas e éguas receptoras do 10º ao 60º dia de gestação. Este estudo foi realizado na Fazenda Experimental Gralha Azul da Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Cinco éguas de doadores de embriões com idades entre 4 e 10 anos foram utilizadas. Foram utilizados dois grupos de receptores: 10 éguas cíclicas com idades entre 4 e 15 anos (grupo controle) e 7 mulas acíclicas com idades entre 6 e 12 anos. Os animais foram mantidos em piquetes e/ou estábulos e tiveram acesso a água e sal mineral ad libitum, bem como a uma fonte de volumoso e concentrado. As éguas doadoras foram monitoradas diariamente por ultrassonografia transretal (transdutor linear de 5 MHz, A6V Sonoscape, China) após o início do estro. As éguas foram inseminadas artificialmente usando sêmen fresco de um garanhão com fertilidade comprovada. A coleta de embriões das éguas foi realizada 8 dias após a ovulação. Antes da transferência do embrião, as éguas receptoras cíclicas eram examinadas diariamente por ultrassonografia para usar a melhor sincronia com a ovulação da doadora. As mulas acíclicas foram preparadas antes da transferência do embrião com a administração de 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, im) no dia da ovulação da doadora, e após 2 dias quando a presença de edema uterino foi confirmada, com a administração de Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, im). O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia, 10 dias após a ovulação da doadora. Quando o diagnóstico foi confirmado, a avaliação ultrassonográfica foi realizada diariamente até o 60º dia de gestação. O primeiro dia de detecção da vesícula embrionária foi o Dia 10 por ultrassonografia em ambas as espécies e Dia 20,9 ± 1,3 (Média ± DP) e 21,9 ± 0,9 por palpação transretal em mulas e éguas respectivamente. A fixação da vesícula ocorreu em média no dia 15,7 ± 1,1 em mulas e 16,6 ± 1,7 em éguas. O embrião propriamente dito foi detectado pela primeira vez em mulas (no dia 19,9 ± 1,1) em comparação com as éguas (20,4 ± 1,3). O batimento cardíaco foi observado posteriormente em muares (23,4 ± 1,4) do que em éguas (22,6 ± 0,8). O saco alantóide foi detectado pela primeira vez entre os dias 23 e 26 (25,3 ± 1,1 e 24,6 ± 1,0 em mulas e éguas, respectivamente) e o cordão umbilical foi detectado pela primeira vez no dia 39 (39,7 ± 2,1 x 39,6 ± 1,5 em mulas e éguas, respectivamente). Os diâmetros ovarianos para os ovários esquerdo e direito foram semelhantes para as mulas (21,4 ± 0,4 vs. 21,8 ± 0,4 mm) e para as éguas (45,1 ± 0,4 vs 46,0 ± 0,4). Entretanto, o diâmetro ovariano das éguas (45,5 ± 0,3 mm) foi duas vezes maior (P <0,0001) que as mulas (21,6 ± 0,3 mm). Apenas duas mulas apresentaram o CL acessório que foi observado pela primeira vez nos dias 49 e 51. Dentro dos grupos não houve diferenças entre os cornos esquerdo e direito, gravídicos e não-gravídicos. A média geral não foi diferente entre as mulas (24,6 ± 3,1 mm) e as éguas (25,4 ± 0,1 mm). Como conclusão, de acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo comparativo sobre desenvolvimento embrionário e fetal precoce entre mulas acíclicas e éguas receptoras de embriões equinos. Numerosas semelhanças foram encontradas nos aspectos estudados. Tais achados, associados ao fato de que potros vivos e sadios foram produzidos, sugerem que o uso de mulas acíclicas pode ser considerado como uma alternativa para aumentar a disponibilidade de receptoras em programas equinos de TE. / Brazil is one of the countries with the largest number of equine embryo transfers in the world, but recipients mares are scarce and expensive. One alternative is to use acyclic mules as recipients for equine embryos. The aim of this study was to compare for the first time the embryonic and early fetal development in recipient mules and mares from day 10 to 60 of pregnancy. This study was conducted at the Experimental Farm Gralha Azul of the Pontifical Catholic University of Paraná. Five embryo donor mares aged 4 to 10 years were used. Two groups of recipients were used: 10 cyclic mares aged 4 to 15 years (control group), and 7 acyclic mules aged 6 to 12 years. Animals were kept in paddocks and/or stables and had access to water and mineral salt ad libitum, as well as to a source of roughage and concentrate. Donor mares were monitored daily by transrectal ultrasonography (5-MHz linear transducer, A6V Sonoscape, China) after the beginning of estrus. The mares were artificially inseminated using fresh semen from a stallion with proven fertility. Embryo collection from the mares was performed 8 days after ovulation. Before embryo transfer, cyclic recipient mares were examined daily by ultrasonography to use the most synchronous with the donor's ovulation and have not received any hormonal treatment. The acyclic mules were prepared before the embryo transfer with the administration of 17 beta-estradiol (10 mg/mL, 1 mL, i.m.) on the day of the donor's ovulation, and after 2 days when the presence of uterine edema was confirmed, with the administration of Altrenogest (60 mg/mL, 5 mL, i.m.). The pregnancy diagnosis was carried out by ultrasonography 10 days after ovulation in the donor. When the diagnosis was confirmed, ultrasonographic assessment was carried out daily until day 60 of pregnancy. The first day of detection of an embryonic vesicle was Day 10 by ultrasound in both species and day 20.9 ± 1.3 (Mean ±SD), and 21.9 ± 0.9 by transrectal palpation in mules and mares respectively. Fixation of the vesicle occurred on mean day 15.7 ± 1.1 in mules and 16.6 ± 1.7 in mares. The embryo proper was first detected in mules (on day 19.9 ± 1.1) compared to mares (20.4 ± 1.3) The heart beat was observed later in mules (23.4 ± 1.4) than in mares (22.6 ± 0.8). The allantoic sac was first detected between days 23 and 26 (25.3 ± 1.1 and 24.6 ± 1.0 in mules and mares, respectively) and the umbilical cord was first detected on day 39 (39.7 ± 2.1 x 39.6 ± 1.5 in mules and mares, respectively). The ovarian diameters for left and right ovaries were similar for mules (21.4 ± 0.4 vs. 21.8 ± 0.4 mm) and for mares (45.1 ± 0.4 vs. 46.0 ± 0.4). However, the ovarian diameter of the mares (45.5 ± 0.3 mm) was two times larger (P<0.0001) than the mules (21.6 ± 0.3 mm). Within groups there were no differences between left and right and gravid and non-gravid horns. Data were combined for comparison of the endometrial diameter between mules and mares. The overall mean was not different between mules (24.6 3.1 ± 0.1 mm) and mares (25.4 ± 0.1 mm). However, day (P<0.003) and group-by-day (P<0.0001) effects were detected. Only two mules presented accessory CL that was observed for the first time on days 49 e 51. In conclusion, to the best of our knowledge, this is the first comparative study on embryo and early fetal development between noncycling mules and mares used as ET recipients of horse-horse embryos. Numerous similarities in embryo and early fetal development, and endocrinology aspects were seen. The findings of this study in mules, associated with the fact that alive and healthy offspring were produced, the use of mules may be considered as an alternative to increase the availability of recipients in equine ET programs.

Introdução: Alterações no ambiente fetal conferem um risco aumentado para doenças crônicas como obesidade, doença cardiovascular, hipertensão arterial e diabetes tipo 2. As evidências sugerem que a restrição de crescimento intrauterino (RCIU) pode programar de forma persistente as preferências alimentares, e acredita-se que esse tipo de alteração comportamental, pode explicar, pelo menos em parte, o aumento do risco para essas doenças em indivíduos que sofreram RCIU. Portanto, torna-se importante entender os fatores associados e mecanismos envolvidos nesse comportamento. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da RCIU no comportamento alimentar em animais e humanos, assim como os possíveis mecanismos envolvidos na sua programação. Métodos: Ratas Sprague Dawley prenhes foram randomizadas para o grupo controle (Adlib), que recebeu dieta padrão ad libitum ou grupo restrição 50% (FR), que recebeu 50% do consumo habitual de genitoras alimentadas ad libitum. As dietas foram oferecidas a partir do dia 10 de gestação até o dia 21 de lactação. Em até 24h após o nascimento, foi realizada a adoção cruzada formando os grupos: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. O consumo de ração padrão foi comparado entre todos os grupos. A preferência alimentar, a preferência condicionada por lugar induzida por alimento palatável, assim como a fosforilação da enzima tirosina hidroxilase e os níveis de receptores D2 no núcleo acumbens foram comparados entre os grupos de interesse (Adlib_Adlib e FR_Adlib). Nos humanos, 75 jovens, classificados quanto à RCIU, participaram de avaliação antropométrica, bioquímica e de comportamento alimentar (teste de escolha alimentar, no qual todos recebiam um valor monetário para compra de um lanche, e Dutch Eating Behaviour Questionnaire, DEBQ). Dados de neuroimagem funcional em repouso entre regiões relacionadas à recompensa de 28 indivíduos foram processados e analisados, de um total de 43 exames realizados. Resultados: No estudo experimental, viu-se que o consumo de ração padrão não foi diferente entre os grupos. Ratos restritos apresentaram preferência pela dieta palatável, mas menor condicionamento de preferência ao lugar associado ao alimento palatável. A fosforilação da tirosina hidroxilase no núcleo acumbens foi maior nestes animais no estado basal, mas após exposição ao doce essa diferença entre os grupos permaneceu apenas nos machos. A RCIU também se associou a menores níveis de receptores D2 no núcleo acumbens. No estudo clínico, encontrou-se que a menor razão de crescimento fetal (indicativo de maior RCIU) e alto índice de massa corporal predizem um estilo alimentar restritivo visto pelo DEBQ. Pessoas nascidas com RCIU também usaram menor quantidade do um recurso financeiro oferecido no teste de escolha alimentar após um período de jejum. Os dados de neuroimagem funcional sugerem que os indivíduos restritos apresentam um padrão de conectividade em repouso alterado entre o córtex orbito-frontal, o estriado ventral/dorsal e a amígdala. Conclusão: A RCIU esteve associada com preferência por alimentos palatáveis e alterações no sistema dopaminérgico no estudo experimental e alterações da conectividade em repouso entre áreas do sistema mesocorticolímbico no estudo clínico. As alterações observadas no sistema dopaminérgico dos animais restritos indicam que esse sistema estaria envolvido na programação da preferência alimentar nesses indivíduos. Além disso, o padrão de conectividade em repouso observado nos indivíduos restritos sugere que alterações em determinadas regiões do sistema de recompensa poderiam estar associadas com mudanças no comportamento alimentar. As alterações neurocomportamentais observadas confirmam a existência de programação fetal do comportamento alimentar pela RCIU, apontando modificações persistentes no sistema de recompensa do cérebro, o que pode ser visto como um fator de risco para o desenvolvimento de obesidade e suas comorbidades. / Introduction: Fetal environment changes can lead to adaptations that are associated with increased risk for obesity, cardiovascular disease, hypertension and diabetes in adult life. Evidence suggests that intrauterine growth restriction (IUGR) can persistently program the subject’s preference for palatable foods. It is believed that feeding behavior alterations can explain, at least in part, the increased risk for chronic diseases in IUGR individuals. Therefore, it becomes important to understand the factors and mechanisms involved in this behavior. The aim of this study was to explore how IUGR affects feeding behavior of animals and humans, as well as to verify the potential mechanisms related to this behavioral programming. Methods: Time-mated pregnant Sprague-Dawley rats were randomly allocated to Control (receiving standard chow ad libitum) or 50% food restricted (FR), receiving 50% of the ad libitum-fed dam’s habitual intake. These diets were provided from day 10 of pregnancy throughout day 21 of lactation. Within 24 hours after birth, pups were crossfostered, forming four groups: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. Standard chow consumption was compared between all groups. Food preference, conditioned place preference to a palatable diet, and the nucleus accumbens tyrosine hydroxylase phosphorylation and D2 receptor levels were analyzed focusing on two groups of interest (Adlib_Adlib and FR_Adlib). In humans, 75 youths were classified regarding IUGR and had anthropometric data, biochemical data, and feeding behavior (food choice task, in which everyone received a monetary value to purchase a snack, and Dutch Eating Behaviour Questionnaire) assessed. Forty three neuroimaging exams were performed and resting state functional connectivity between brain regions related to reward of 28 individuals were processed and analyzed. Results: In the experimental study, standard chow consumption was not different between groups. IUGR adult rats had increased preference for palatable food, but showed less conditioned place preference to a palatable diet compared to controls. At baseline, the accumbal tyrosine hydroxylase phosphorylation was increased in IUGR rats compared to controls. After sweet food exposure, the difference between groups remained only in males. Accumbal D2 receptors levels were decreased in IUGR rats. In the clinical study, it was found that low birth weight ratio (indicative of higher IUGR) and high body mass index predict a restrained eating style as seen by the DEBQ. IUGR individuals used a smaller quantity of a financial resource offered in the food choice task after a fasting period. Resting state functional connectivity data suggest that IUGR individuals had an altered pattern of connectivity between the orbitofrontal cortex, the ventral/dorsal striatum and the amygdala. Conclusion: IUGR was associated with a preference for palatable foods and alterations in the dopaminergic system in the experimental study, as well as changes in the resting state functional connectivity between regions of the mesocorticolimbic pathway in the clinical study. Alterations in the mesolimbic dopaminergic system observed in IUGR rats indicate an important role in the programming of food preferences. Moreover, the IUGR pattern of brain connectivity observed suggests that alterations in certain regions involved in reward processing and evaluation could be associated with changes in eating behavior. Neurobehavioral changes observed confirmed the existence of a fetal programming of feeding behavior associated with IUGR, pointing out to persistent modifications in the brain reward system, which can be seen as a risk factor for the development of obesity and its comorbidities.

Introdução: Alterações no ambiente fetal conferem um risco aumentado para doenças crônicas como obesidade, doença cardiovascular, hipertensão arterial e diabetes tipo 2. As evidências sugerem que a restrição de crescimento intrauterino (RCIU) pode programar de forma persistente as preferências alimentares, e acredita-se que esse tipo de alteração comportamental, pode explicar, pelo menos em parte, o aumento do risco para essas doenças em indivíduos que sofreram RCIU. Portanto, torna-se importante entender os fatores associados e mecanismos envolvidos nesse comportamento. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da RCIU no comportamento alimentar em animais e humanos, assim como os possíveis mecanismos envolvidos na sua programação. Métodos: Ratas Sprague Dawley prenhes foram randomizadas para o grupo controle (Adlib), que recebeu dieta padrão ad libitum ou grupo restrição 50% (FR), que recebeu 50% do consumo habitual de genitoras alimentadas ad libitum. As dietas foram oferecidas a partir do dia 10 de gestação até o dia 21 de lactação. Em até 24h após o nascimento, foi realizada a adoção cruzada formando os grupos: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. O consumo de ração padrão foi comparado entre todos os grupos. A preferência alimentar, a preferência condicionada por lugar induzida por alimento palatável, assim como a fosforilação da enzima tirosina hidroxilase e os níveis de receptores D2 no núcleo acumbens foram comparados entre os grupos de interesse (Adlib_Adlib e FR_Adlib). Nos humanos, 75 jovens, classificados quanto à RCIU, participaram de avaliação antropométrica, bioquímica e de comportamento alimentar (teste de escolha alimentar, no qual todos recebiam um valor monetário para compra de um lanche, e Dutch Eating Behaviour Questionnaire, DEBQ). Dados de neuroimagem funcional em repouso entre regiões relacionadas à recompensa de 28 indivíduos foram processados e analisados, de um total de 43 exames realizados. Resultados: No estudo experimental, viu-se que o consumo de ração padrão não foi diferente entre os grupos. Ratos restritos apresentaram preferência pela dieta palatável, mas menor condicionamento de preferência ao lugar associado ao alimento palatável. A fosforilação da tirosina hidroxilase no núcleo acumbens foi maior nestes animais no estado basal, mas após exposição ao doce essa diferença entre os grupos permaneceu apenas nos machos. A RCIU também se associou a menores níveis de receptores D2 no núcleo acumbens. No estudo clínico, encontrou-se que a menor razão de crescimento fetal (indicativo de maior RCIU) e alto índice de massa corporal predizem um estilo alimentar restritivo visto pelo DEBQ. Pessoas nascidas com RCIU também usaram menor quantidade do um recurso financeiro oferecido no teste de escolha alimentar após um período de jejum. Os dados de neuroimagem funcional sugerem que os indivíduos restritos apresentam um padrão de conectividade em repouso alterado entre o córtex orbito-frontal, o estriado ventral/dorsal e a amígdala. Conclusão: A RCIU esteve associada com preferência por alimentos palatáveis e alterações no sistema dopaminérgico no estudo experimental e alterações da conectividade em repouso entre áreas do sistema mesocorticolímbico no estudo clínico. As alterações observadas no sistema dopaminérgico dos animais restritos indicam que esse sistema estaria envolvido na programação da preferência alimentar nesses indivíduos. Além disso, o padrão de conectividade em repouso observado nos indivíduos restritos sugere que alterações em determinadas regiões do sistema de recompensa poderiam estar associadas com mudanças no comportamento alimentar. As alterações neurocomportamentais observadas confirmam a existência de programação fetal do comportamento alimentar pela RCIU, apontando modificações persistentes no sistema de recompensa do cérebro, o que pode ser visto como um fator de risco para o desenvolvimento de obesidade e suas comorbidades. / Introduction: Fetal environment changes can lead to adaptations that are associated with increased risk for obesity, cardiovascular disease, hypertension and diabetes in adult life. Evidence suggests that intrauterine growth restriction (IUGR) can persistently program the subject’s preference for palatable foods. It is believed that feeding behavior alterations can explain, at least in part, the increased risk for chronic diseases in IUGR individuals. Therefore, it becomes important to understand the factors and mechanisms involved in this behavior. The aim of this study was to explore how IUGR affects feeding behavior of animals and humans, as well as to verify the potential mechanisms related to this behavioral programming. Methods: Time-mated pregnant Sprague-Dawley rats were randomly allocated to Control (receiving standard chow ad libitum) or 50% food restricted (FR), receiving 50% of the ad libitum-fed dam’s habitual intake. These diets were provided from day 10 of pregnancy throughout day 21 of lactation. Within 24 hours after birth, pups were crossfostered, forming four groups: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. Standard chow consumption was compared between all groups. Food preference, conditioned place preference to a palatable diet, and the nucleus accumbens tyrosine hydroxylase phosphorylation and D2 receptor levels were analyzed focusing on two groups of interest (Adlib_Adlib and FR_Adlib). In humans, 75 youths were classified regarding IUGR and had anthropometric data, biochemical data, and feeding behavior (food choice task, in which everyone received a monetary value to purchase a snack, and Dutch Eating Behaviour Questionnaire) assessed. Forty three neuroimaging exams were performed and resting state functional connectivity between brain regions related to reward of 28 individuals were processed and analyzed. Results: In the experimental study, standard chow consumption was not different between groups. IUGR adult rats had increased preference for palatable food, but showed less conditioned place preference to a palatable diet compared to controls. At baseline, the accumbal tyrosine hydroxylase phosphorylation was increased in IUGR rats compared to controls. After sweet food exposure, the difference between groups remained only in males. Accumbal D2 receptors levels were decreased in IUGR rats. In the clinical study, it was found that low birth weight ratio (indicative of higher IUGR) and high body mass index predict a restrained eating style as seen by the DEBQ. IUGR individuals used a smaller quantity of a financial resource offered in the food choice task after a fasting period. Resting state functional connectivity data suggest that IUGR individuals had an altered pattern of connectivity between the orbitofrontal cortex, the ventral/dorsal striatum and the amygdala. Conclusion: IUGR was associated with a preference for palatable foods and alterations in the dopaminergic system in the experimental study, as well as changes in the resting state functional connectivity between regions of the mesocorticolimbic pathway in the clinical study. Alterations in the mesolimbic dopaminergic system observed in IUGR rats indicate an important role in the programming of food preferences. Moreover, the IUGR pattern of brain connectivity observed suggests that alterations in certain regions involved in reward processing and evaluation could be associated with changes in eating behavior. Neurobehavioral changes observed confirmed the existence of a fetal programming of feeding behavior associated with IUGR, pointing out to persistent modifications in the brain reward system, which can be seen as a risk factor for the development of obesity and its comorbidities.

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